1、實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸 課件模板-114,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、常用酶的配制,三、常用酶的配制：,1。溶菌酶 用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份并保存于-20。每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。 2。蛋白水解酶類 貯存液貯存溫度反應(yīng)濃度反應(yīng)緩沖液溫度預(yù)處理0.01mol/L Tris(pH7.8)鏈霉蛋白酶a20mg/ml-20（溶于水）1mg/ml0.01mol/L EDTA37自消化b0.5% SDS0.01mol/L Tris(pH7.8)蛋白酶Kc20mg/ml-20（溶于水）50g/ml0.005mol/L EDTA3756無須預(yù)處理0.5% SDS a：鏈霉蛋白酶是從鏈球菌（

2、Streptomycesgriseus）中分離到的一種絲氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、常用酶的配制,三、常用酶的配制：,b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，經(jīng)自消化的鏈酶蛋白酶的配制方法如下：把該酶的粉末溶解于10mmol./lTrisHCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml濃度，于37溫育1h。經(jīng)消化的鏈霉蛋白酶分裝成小份放在密封試管中，保存-20。 c：蛋白酶K是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中純化得到。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、常用酶的配制,三、常用酶的配

3、制：,該酶有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機(jī)理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶K消化過程中通常加入EDTA（以抑制依賴于Mg2+的核酸酶的作用）。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、常用酶的配制,三、常用酶的配制：,但是，如果要消化對(duì)蛋白酶K具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGT（pH8.0）至終濃度為2mmol/L,以鰲合Ca2+。 3。無DNA

4、酶的RNA酶 將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/l TrisHCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：四、常用抗生素溶液,四、常用抗生素溶液：,抗生素貯存液a工作濃度濃度保存條件嚴(yán)緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒氨芐青霉素50mg/ml(溶于水)-2020g/ml60g/ml羧芐青霉素50mg/ml(溶于水)-2020g/ml60g/ml氯霉素34mg/ml(溶于乙醇)-2025g/ml170g/ml卡那霉素10mg/ml(溶于水)-2010g/ml50g/ml鏈霉素10mg/

5、ml(溶于水)-2010g/ml50g/ml四環(huán)素b5mg/ml(溶于乙醇)-2010g/ml50g/ml a：以水為溶劑的抗生素貯存液通過0.22m濾器過濾除菌。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：四、常用抗生素溶液,四、常用抗生素溶液：,以乙醇為溶劑的抗生素溶液無須除菌處理。所有抗生素溶液均應(yīng)放于不透光的容器保存。 b：鎂離子是四環(huán)素的拮抗劑，四環(huán)素抗性菌的篩選應(yīng)使用不含鎂鹽的培養(yǎng)基（如LB培養(yǎng)基）。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,1。30%丙烯酰胺溶液 【配制方法】 將29g丙烯酰胺和1g N，N-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37溶解之，補(bǔ)加水至

6、終體積為100ml。用Nalgene濾器（0.45m孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。 【注意】 丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具。可認(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料。 一些價(jià)格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂（MB-1Mallinckrodt），攪拌過夜，然后用Whatman 1號(hào)濾紙過濾以純化之。,實(shí)用免疫細(xì)胞與

7、核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。 2。40%丙烯酰胺 【配制方法】 把380g丙烯酰胺（DNA測序級(jí)）和20g N，N-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸餾水中。繼續(xù)按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應(yīng)以蒸餾水補(bǔ)足至終體積為1L。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,【注意】 見上述配制30%丙烯酰胺的說明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列測定。 3。放線菌素D溶液 【配制方法】 把20mg放線菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%

8、乙醇作空白對(duì)照讀取OD440值。放線菌素D（分子量為1255）純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21，900，故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182，放線菌素D的貯存液應(yīng)放在包有箔片的試管中，保存于-20。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,【注意】 放線菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時(shí)必須戴手套并在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，而不能在開放在實(shí)驗(yàn)桌面上進(jìn)行，謹(jǐn)防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。 藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導(dǎo)作用

9、。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,4。0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液 【配制方法】 在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/L NaOH調(diào)至pH值至7.0，用蒸餾水定容1ml，分裝成小份保存于-70 5。10mol/L乙酸酰溶液 【配制方法】 把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后過濾除菌。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,6。10%過硫酸銨溶液 【配制方法】 把1g過硫酸銨溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4保存數(shù)周。 7。BCIP溶液 【配制方法】 把0.5g的5-溴-4-氯

10、-3-吲哚磷酸二鈉鹽（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4 8。2BES緩沖鹽溶液 【配制方法】 用總體積90ml的蒸餾水溶解1.07g鹽溶液BESN，N-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙磺酸、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室溫下用HCl調(diào)節(jié)該溶液的pH值至6.96、然后加入蒸餾水定容至100ml，用0.22m濾器過濾除菌，分裝成小份，保存于-20。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,9。1mol/L CaCl2溶液 【配制方法】 在200ml蒸餾水中溶解54gCaCl26H2O，用0.22m濾器過濾除菌，分裝成10ml小

11、份貯存于-20。 【注意】 制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，取出一小份解凍并用蒸餾水稀釋至100ml，用Nalgene濾器（0.45m孔徑）過濾除菌，然后驟冷至0。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,10。2.5mol/L CaCl2溶液 【配制方法】 在20ml蒸餾水中溶解13.5gCaCl26H2O，用0.22m濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20。 11。1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）溶液 【配制方法】 用20ml 0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，過濾除菌后分裝成1ml小份貯存于-20。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制

12、,五、常用貯存液的配制：,【注意】 DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。 12。脫氧核苷三磷酸（dNTP）溶液 【配制方法】 把每一種dNTP溶解于水至濃度各為100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris堿分別調(diào)節(jié)每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH試紙檢測），把中和后的每種dNTP溶液各取一份作適當(dāng)稀釋，在下表中給出的波長下讀取光密度計(jì)算出每種dNTP的實(shí)際濃度，然后用水稀釋成終濃度為50mmol/L的dNTP，分裝成小份貯存于-70。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,堿基波長（nm）消化系數(shù)（）L/（molcm）A2591.

13、54104G2531.37104C2719.10103T2607.40103 比色杯光徑為1cm時(shí),吸光度=M 13。0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液 【配制方法】 在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2H2O），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0（約需20g NaOH顆粒）然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,【注意】 EDTA二鈉鹽需加入NaOH將溶液的pH值調(diào)至接近8.0，才能完全溶解。 14。溴化乙錠（10mg/ml溶液） 【配制方法】 在100ml水中

14、加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。 【注意】 小心：溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)務(wù)必戴上手套，稱量染料時(shí)要戴面罩。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,15。2HEPES緩沖鹽溶液 【配制方法】 用總量為90ml的蒸餾水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO42H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/lNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.05，再用蒸餾水定容至100ml。用0.22m濾器過濾除菌，分裝成5ml小份，貯存于-20。,實(shí)用免疫

15、細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,16。IPTG溶液 【配制方法】 IPTG為異丙基硫代-D-半乳糖苷（分子量為238.3），在8ml蒸餾水中溶解2g IPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用0.22m濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20。 17。1mol/L乙酸鎂溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解214.46g四水乙酸鎂，用水定容至1L過濾除菌。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,18。1mol/L MgCl2溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解203.4gMgCl26H2O，用水定容至1L，分裝成小份并高壓滅菌備用。 【

16、注意】 MgCl2極易潮解，應(yīng)選購小瓶（如100g）試劑，啟用新瓶后勿長期存放。 19。-巰基乙醇（BME）溶液 【配制方法】 一般得到的是14.4mol/L溶液，應(yīng)裝在棕色瓶中保存于4。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,【注意】 BME或含有BME的溶液不能高壓處理。 20。NBT溶液 【配制方法】 把0.5g氯化氮藍(lán)四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4。 21。酚/氯仿溶液 【配制方法】 把酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/L TrisHCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/l Tri

17、sHCl(pH7.6)液層，保存于4。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,【注意】 酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套及防護(hù)鏡，穿防護(hù)服。所有操作均應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥中進(jìn)行。與酚接觸過的部位皮膚應(yīng)用大量的水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。 22。10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液 【配制方法】 用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分裝成小份貯存于-20。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,如有必要可配成濃度高達(dá)17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L） 【注意】 PMSF嚴(yán)重?fù)p害

18、呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應(yīng)立即用大量水沖洗之。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。 PMSF在水溶液中不穩(wěn)定。應(yīng)在使用前從貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于裂解緩沖液中。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH值的升高而加快，且25的失活速率高于4。pH值為8.0時(shí)，20mmol/l PMSF水溶液的半壽期大約為85min，這表明將PMSF溶液調(diào)節(jié)為堿性（pH8.6）并在室溫放置數(shù)小時(shí)后，可安全地予以丟棄。 23。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液 【配制方法】 在800ml蒸餾水中溶解

19、8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,保存于室溫。 24。1mol/L乙酸鉀（pH7.5）溶液 【配制方法】 將9.82g乙酸鉀溶解于90ml純水中，用2mol/L乙酸調(diào)節(jié)pH值至7.5后加入純水定容到1L，保存于-20。 25。乙酸鉀溶液（用于堿裂解） 【配制方法】 在60ml 5mol/L乙酸鉀溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成鉀濃度為3mol/

20、L而乙酸根濃度為5mol/L的溶液。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,26。3mol/L乙酸鈉（pH5.2和pH7.0）溶液 【配制方法】 在80ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2或用稀乙酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水定容到1L，分裝后高壓滅菌。 27。5mol/L NaCl溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,28。10%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液 【配制方法】 在900ml水中溶解100g電泳級(jí)SDS，加熱至6

21、8助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。 【注意】 SDS的微細(xì)晶粒易擴(kuò)散，因此稱量時(shí)要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的SDS，10%SDS溶液無須滅菌。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,29。20SSC溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/l NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 30。20SSPE溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6g NaH2PO4H2O和7.4g EDTA，用Na

22、OH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4（約需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,31。100%三氯乙酸溶液 【配制方法】 在裝有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。 32。1mol/L Tris溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解121.91gTris堿，加入濃HCl調(diào)節(jié)pH值至所需值。 pHHCl 7.4 70ml 7.6 60ml 8.0 42ml 應(yīng)使溶液冷至室溫后方可最后調(diào)定pH值，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液

23、的配制,五、常用貯存液的配制：,【注意】 如1mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，應(yīng)予丟棄并置備質(zhì)量更好的Tris。 盡管多種類型的電極均不能準(zhǔn)確測量Tris溶液的pH值，但仍可向大多數(shù)廠商購得合適的電極。 Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高1，pH值大約降低0.03個(gè)單位。例如：0.05mol/L的溶液在5、25、和37時(shí)的pH值分別為9.5、8.9和8.6。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,33。Tris緩沖鹽溶液（TBS）（25mmol/l Tris） 【配制方法】 在800ml蒸餾水中溶解8gNaCl、0.2g KCl和3g Tris堿，加入0.015g酚

24、并用HCl調(diào)至pH值至7.4，用蒸餾水定容至1L，分裝后在151bf/in2(1.034105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min，于室溫保存。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,34。X-gal溶液 【配制方法】 X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20。X-gal溶液無須過濾除菌。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,雜交試驗(yàn)中用于降低背景的封閉劑 試劑用途Denha

25、rdt試劑Northern雜交使用RNA探針的雜交單拷貝序列的Southern雜交將DNA固定于尼龍膜上的雜交Denhardt試劑通常配制50貯存液，過濾后保存于-20?？蓪⒃撡A存液10倍稀釋于預(yù)雜交液（常為含有0.5%SDS和100g/ml經(jīng)變性被打斷的鮭精DNA的6SSC或6SSPE）中。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：五、常用貯存液的配制,五、常用貯存液的配制：,50Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組分V”Sigmal），加水至終體積為500ml。BLOTTOGrunstein-Hogness雜交Benton-Davis雜交除單拷貝序列Southern雜交以外的所有Southern雜交斑點(diǎn)印跡1BLOTT（