1、重組DNA表達(dá)系統(tǒng),體外表達(dá)：無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)等 體內(nèi)表達(dá)： 酵母表達(dá)系統(tǒng) 真核表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 動(dòng)物/植物表達(dá)系統(tǒng)（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/植物）,體系選擇,研究基因功能: 大腸桿菌, 裂殖酵母,昆蟲細(xì)胞, CHO細(xì)胞 多肽藥物生產(chǎn): 大腸桿菌, 畢氏酵母, CHO細(xì)胞, 乳腺組織 疫苗: 大腸桿菌, 酵母, 大多數(shù)沿用細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行滅毒 單抗生產(chǎn): 雜交瘤細(xì)胞 工業(yè)酶生產(chǎn): 各種微生物,一、體外表達(dá)系統(tǒng)（無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)）,體外翻譯系統(tǒng)又稱無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，是一種相對(duì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)而言的開放型表達(dá)系統(tǒng)。 優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)源型mRNA干擾很小，操作

2、程序簡單，獲得重組蛋白周期很短。主要用于蛋白質(zhì)快速分析鑒定；基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控機(jī)理研究；分子間的相互作用的研究。 缺點(diǎn)： 昂貴； 操作要求高； 表達(dá)量不夠高。,主要的體外表達(dá)系統(tǒng)： 1、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)，由新西蘭大白兔制備。 2、麥胚提取物系統(tǒng)，可穩(wěn)定地表達(dá)一些在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中翻譯受到抑制的DNA。 3、原核體外翻譯系統(tǒng)（S30原核體外翻譯系統(tǒng)）， E.coli S30提取物由OmpT內(nèi)切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制備，所以在S30系統(tǒng)中表達(dá)基因可以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性。,目前多家公司有商業(yè)化產(chǎn)品，常見的有： RTS E.Coli 系統(tǒng); RTS100 wheat germ CEC

3、F系統(tǒng) (Roche) TNT快速偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng) (Promega)； Gold TNT T7 Express 96系統(tǒng) （Promega），該系統(tǒng)有SP6和T7兩種類型，適合在96孔板上進(jìn)行大規(guī)模高通量篩選分析； TNT T7 Quick for PCR DNA (promega)，PCR DNA 的TNT T7快速系統(tǒng)從PCR反應(yīng)液中直接取樣，無需純化DNA，直接用于偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)； TNT 偶聯(lián)小麥胚芽抽提系統(tǒng) (promega)。,二、原核表達(dá)系統(tǒng),特點(diǎn)：產(chǎn)量高、生長速度快、操作容易、成本低。 缺點(diǎn)： 翻譯后加工修飾體系不完善：無糖基化、酰基化等 一般表達(dá)獲得的蛋白常常以變性

4、狀態(tài)存在，不具有生物學(xué)活性。,（一）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),目前較常用的表達(dá)載體是具有可誘導(dǎo)的T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體，大部分蛋白均可獲得表達(dá)而且表達(dá)量較高，表達(dá)量可占細(xì)菌總蛋白的25以上。 T7RNA聚合酶來源于T7噬菌體，期活性高于大腸桿菌RNA聚合酶很多倍，而且較少發(fā)生轉(zhuǎn)錄中止 它只識(shí)別自己的啟動(dòng)序列，不能啟動(dòng)大腸桿菌DNA的轉(zhuǎn)錄，對(duì)抑制大腸桿菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的條件下，使目的基因得到大量擴(kuò)增 正常大腸桿菌并不表達(dá)T7RNA聚合酶，為了能利用T7啟動(dòng)子表達(dá)外源基因，將T7RNA聚合酶基因置于lacUV5啟動(dòng)子控制下，整合到大腸桿菌染色體，構(gòu)建了能被IPTG誘導(dǎo)

5、表達(dá)T7RNA聚合酶的大腸桿菌菌株 常用宿主細(xì)胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等 還有受溫度變化誘導(dǎo)的具有噬菌體PL啟動(dòng)子調(diào)控 的載體等。,按蛋白質(zhì)類型分 單純表達(dá): pJLA系列, 用NcoI/NdeI導(dǎo)入AUG的載體 融合表達(dá): 融合各種tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表達(dá): pel/ompT分泌肽 按啟動(dòng)子分 lac及衍生的tac , trc, pac, rac等啟動(dòng)子 IPTG誘導(dǎo) lamda phage PL和PR 啟動(dòng)子 熱誘導(dǎo) T7 啟動(dòng)子 IPTG誘導(dǎo) T5 啟動(dòng)子 IPTG誘導(dǎo) ara啟動(dòng)子 阿拉伯糖誘導(dǎo),大腸桿菌表達(dá)載體分類,常見的

6、大腸桿菌商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)有： 1、pET system and pETBlue system（Novagen公司），是原核蛋白表達(dá)中應(yīng)用最多的系統(tǒng)。具有可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運(yùn)和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌。目前共有包括40多種載體、15種不同宿主菌和配套齊全的用于有效檢測(cè)和純化目標(biāo)蛋白的相關(guān)產(chǎn)品。 基本結(jié)構(gòu)由T7啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、信號(hào)肽序列、多克隆位點(diǎn)、T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、氨芐青霉素抗性基因核質(zhì)粒復(fù)制位點(diǎn)等 有可以表達(dá)N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同質(zhì)粒。也可以表達(dá)非分泌性蛋白 2、pBAD表達(dá)系統(tǒng)（Invitrogen公司），可控制蛋白質(zhì)的生產(chǎn)水平低于其成為不溶性蛋白的域值

7、。通過與硫氧還蛋白的融合來增加溶解度 3、QIAexpress Expression System（Qiagen公司 ）。,pJLA50X系列; pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周質(zhì)表達(dá), BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表達(dá), Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose誘導(dǎo)型),常用表達(dá)載體,pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs),BL21(DE3)/pLysS : 自身表達(dá)T7 RNA polymera

8、se 適用pET系列等帶T7啟動(dòng)子的載體 M15/SG13009 : 自身表達(dá)T5 RNA polymerase 適用pQE系列等帶T5啟動(dòng)子的載體 BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突變 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 雙突變 適合帶thioredoxin reductase的融合表達(dá)載體, 幫助形成更多的二硫鍵 BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表達(dá) BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表達(dá),特殊的表達(dá)用菌株,外源基因在原核細(xì)

9、胞中的表達(dá)形式,按表達(dá)蛋白的部位分： 分泌表達(dá)； 外周質(zhì)及膜上表達(dá) ； 胞內(nèi)表達(dá)。,外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)形式,在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因時(shí)，可產(chǎn)生融合型、非融合型。 原則上應(yīng)能夠使外源基因表達(dá)效率高，蛋白質(zhì)產(chǎn)量高，不易被細(xì)菌分解，而且產(chǎn)物易被提取、純化。,融合基因的表達(dá),外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的一種簡便方法是使其表達(dá)為融合蛋白，也就是說要表達(dá)的外源基因連接在一段原核基因的下游，蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由外源DNA的完整序列編碼，這樣的蛋白質(zhì)由1條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。,融合蛋白的特點(diǎn),轉(zhuǎn)錄和翻譯起始從正常的

10、大腸桿菌序列開始，故通常可以產(chǎn)生高水平的融合蛋白； 融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定； 產(chǎn)生的融合蛋白較大，容易從蛋白質(zhì)凝膠電泳中區(qū)別出夾，而且融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經(jīng)冷凍于燥，磨成粉末后即可作為抗原； 有些融合蛋白帶有信號(hào)肽，可以分泌到細(xì)胞外。這有助于蛋白質(zhì)的分離和純化。,融合方式,6His Tag融合 半乳糖苷酶融合 trpE融合蛋白 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）融合 硫氧還蛋白（Trx）融合 麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合 堿性磷酸酶（phoA）啟動(dòng)子和信號(hào)序列,Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding

11、 domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin *幫助二硫鍵形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫鍵的形成與 SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀,各種融

12、合蛋白表達(dá)載體,幫助可溶化,幫助分泌到周質(zhì),可用親和層析純化,His-tag (6-8 Histidine) T7-tag (MASMTGGQQMG) HSV-tag (QPELAPEDPED) S-tag (KETAAKFERQHMDS) VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK) HA-tag (YPYDVPDYA) Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL),各種用于抗體識(shí)別的標(biāo)記,如果所表達(dá)的蛋白質(zhì)有二硫鍵并需要正確的立體結(jié)構(gòu), 盡可能進(jìn)行可溶性表達(dá); 如果所表達(dá)的蛋白質(zhì)沒有二硫鍵或只用來制備抗血清, 采用包含體表達(dá)比較好; 如果希望表達(dá)的多肽

13、的分子量小于10 kDa, 一定要進(jìn)行融合表達(dá),采用MBD融合 采用GST融合 采用CBD融合 采用thioredoxin融合 采用Origami等宿主菌 降低菌體培養(yǎng)的速度 溫度 (15-30), 降低轉(zhuǎn)速,讓表達(dá)產(chǎn)物可溶化,采用CBD融合 (pET36/37) 采用Dsb融合 (pET39/40) 采用帶pelB/ompT引導(dǎo)肽的載體 (pET12/20/22) 采用帶MBD融合 (pMAL載體, Biolabs) 采用帶SUMO融合 (pET SUMO, Invitrogen),讓蛋白質(zhì)分泌到間質(zhì)去,融合表達(dá)的蛋白，在分離純化過程中往往需要去除表達(dá)時(shí)額外引入的融合片段。因此需要用不同方法

14、將其裂解，通常有： 1、化學(xué)裂解法：特異識(shí)別特定的氨基酸殘基或一組氨基酸殘基。但化學(xué)裂解法裂解位點(diǎn)的特異性低，有時(shí)可能對(duì)目標(biāo)蛋白產(chǎn)生不必要修飾 如：甲酸、溴化氰等 2、酶解法：反應(yīng)條件溫和，具有高度的特異性。常用的酶有Xa因子、凝血酶、腸激酶、凝乳酶、膠原酶等。但酶解法成本高 ，反應(yīng)時(shí)間長，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目標(biāo)蛋白中，造成新的污染，提高純化的復(fù)雜性。,DTT: intein的Cys 溴化氰: Met Thrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGR Enterokinase: DDDDK PreScissionTM protease: LEVLFQGP Gen

15、enase I TM PGAAHY TEV protease: ENLYFQ G,融合蛋白的專一性切割,3、IMPACT系統(tǒng)(intein mediated purification with an affinity chitin-binding Tag) 該系統(tǒng)是由枯草桿菌來源的幾丁質(zhì)結(jié)合域（5kD，chitin binding domain，用于親和純化）和酵母蛋白質(zhì)剪接元件 intein組成一個(gè)雙效的融合標(biāo)簽。 intein在較低的溫度和還原條件下發(fā)生自身介導(dǎo)的N端裂解，釋放出與之相連的目的蛋白。因此融合蛋白無需蛋白酶裂解即可實(shí)現(xiàn)目的蛋白與fusion tag的精確切割。但含有較多二硫鍵

16、的蛋白不適合這一系統(tǒng)。,分泌型表達(dá),為減少所需蛋白質(zhì)在宿主體內(nèi)被蛋白酶降解?；蛘呤沟鞍踪|(zhì)能夠在體外正確折疊和便于提純，經(jīng)常需要將被表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，因此要用分泌型載體。,分泌型載體的優(yōu)點(diǎn),一些在胞內(nèi)被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)在細(xì)胞周質(zhì)中很穩(wěn)定； 一些在胞內(nèi)無活性的蛋白質(zhì)在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白質(zhì)能夠正確折疊； 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沒有氨基末端甲硫氨酸，因?yàn)榍懈钗稽c(diǎn)在信號(hào)肽與編碼序列之間，甲硫氨酸會(huì)影響許多蛋白質(zhì)的活性。,蛋白質(zhì)能夠在大腸桿菌中進(jìn)行分泌，至少要具備3個(gè)要素： 有一段信號(hào)肽； 在成熟蛋白質(zhì)內(nèi)有適當(dāng)?shù)呐c分泌相關(guān)的氨基酸序列； 細(xì)胞內(nèi)有相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。,信號(hào)肽長度一般為1530個(gè)氨

17、基酸殘基 真核生物和原核生物的信號(hào)肽在結(jié)構(gòu)上都有以下特征： 信號(hào)肽一般都不長，在氨基末端有一段帶正電荷的氨基酸序列，往往是精氨酸或賴氨酸殘基，其數(shù)目為13個(gè)； 有一個(gè)高度疏水的核心區(qū)，含亮氨酸或異亮氨酸殘基，位置可以從帶正電荷的氨基酸延伸到含切割位點(diǎn)的區(qū)域； 含有能被信號(hào)肽酶水解的切割位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)常常在丙氨酸之后，有的是在甘氨酸或絲氨酸之后,分泌型載體也有缺點(diǎn)，例如目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量往往很低，以及信號(hào)肽不能被切除或切在錯(cuò)誤位置上等。,非融合蛋白的表達(dá),指在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白質(zhì)mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細(xì)菌多肽序列。 優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。

18、 缺點(diǎn)：容易被細(xì)菌蛋白酶破壞。,包含體（包涵體）,表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)與細(xì)菌雜蛋白、核酸等成分形成不溶性聚合體即包含體（inclusion body），尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量10%時(shí)，就很容易形成包涵體 生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，影響了多肽鏈的正確折疊，導(dǎo)致疏水基團(tuán)外露等。,包含體的形成有利于防止蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解，并且非常有利于分離表達(dá)產(chǎn)物。但包含體形成后，表達(dá)蛋白不具有生物活性，因此必須溶解包含體并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性。,包含體的制備可通過常規(guī)方法如超聲波、勻漿等使菌體破碎后，離心就可得到。密度梯度離心后則可得到高純度的包

19、含體 包含體通常不溶于水，加入強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑后方可溶解 根據(jù)包含體中蛋白質(zhì)種類的不同，通常用68molL鹽酸胍或910molL尿素溶解包含體。采用pH 2045的酸性溶液也可使包含體溶解。,形成包含體的表達(dá)蛋白恢復(fù)其活性的過程稱為包含體蛋白質(zhì)復(fù)性 其基本原理是隨著變性劑濃度的降低，表達(dá)蛋白恢復(fù)其天然構(gòu)型 常用的復(fù)性方法有逐步稀釋法或透析法等。,透析法: 簡單; 但費(fèi)時(shí), 費(fèi)緩沖液, 蛋白質(zhì)濃度不能過高(容易產(chǎn)生沉淀) 快速稀釋法: 最常用的小規(guī)模復(fù)性方法; 但比較費(fèi)時(shí),費(fèi)緩沖液, 蛋白質(zhì)的濃度不能高(容易產(chǎn)生沉淀) 超濾透析法: 比較省緩沖液, 處理量大; 但費(fèi)時(shí), 要控制好蛋白質(zhì)濃度 凝膠過

20、濾法: 快速, 可重復(fù)性高, 不會(huì)產(chǎn)生沉淀, 操作復(fù)雜一點(diǎn) 親和層析復(fù)性法, 水相二相法, etc,包含體來源蛋白質(zhì)的復(fù)性,（二）枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng),Spizizen于1958年發(fā)現(xiàn)枯草桿菌168菌株為可轉(zhuǎn)化菌株以來，枯草桿菌的遺傳學(xué)工作不斷深入和發(fā)展 枯草桿菌的研究之所以領(lǐng)先于其他芽孢桿菌的種，主要是由于他的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)方法較完善，以及大量的衍生菌株 A.芽孢桿菌的分類除枯草桿菌外，已報(bào)導(dǎo)用作宿主表達(dá)克隆基因的有：嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和耐堿的芽孢桿菌以及病原菌炭疽芽孢桿菌等12種 B.

21、枯草芽孢桿菌168的基因組序列測(cè)定已完成,芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)-相對(duì)于大腸桿菌 1、非致病性：除個(gè)別種（炭疽芽孢桿菌和臘樣芽孢桿菌）外對(duì)人畜無害 2、轉(zhuǎn)化外源DNA的感受態(tài)系統(tǒng)也同樣適用于轉(zhuǎn)化重組DNA 3、質(zhì)粒和噬菌體都可以作為克隆的載體 4、細(xì)胞壁的組成簡單，只含有肽聚糖和磷璧質(zhì)，因此在分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會(huì)混雜有胞被內(nèi)毒素（熱源性脂多糖），而這一點(diǎn)是大腸桿菌無法比擬的 5、能夠大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越細(xì)胞膜后，被加工和直接釋放到培養(yǎng)基中而不發(fā)生聚集，回收和純化蛋白較為簡單。例如：淀粉酶、蛋白酶及殺蟲晶體蛋白等 與革蘭氏陰性（大腸桿菌）相比，陽性菌（芽孢桿菌）簡單的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)賦予了

22、它高效地向胞外分泌目的蛋白的能力,這樣從而使得目的蛋白的純化相對(duì)比較簡單 芽孢桿菌擁有一套高效的分泌信號(hào)肽及分子伴侶系統(tǒng)?？赏瓿赡康牡鞍椎母咝Х置诒磉_(dá)，從而避免包涵體形成 6、良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，在相對(duì)簡單的培養(yǎng)基中能生長到很高的密度,芽孢桿菌的缺點(diǎn)如下： 1、能夠產(chǎn)生大量的胞外蛋白酶，往往造成表達(dá)產(chǎn)物的大量降解。 2、能自發(fā)形成感受的的菌株極少，感受態(tài)持續(xù)時(shí)間短暫，分子克隆效率低 3、存在限制和修飾系統(tǒng)，重組質(zhì)粒不穩(wěn)定。,芽孢桿菌常用的宿主 已報(bào)導(dǎo)用作宿主表達(dá)克隆基因的有Brevibacillus brevis（短短芽孢桿菌）、嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大

23、芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和耐堿的芽孢桿菌以及病原菌炭疽芽孢桿菌等 短短芽孢桿菌作為表達(dá)菌株的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)： 1、幾乎不向胞外分泌蛋白酶（枯草芽孢桿菌至少分泌8種不同的蛋白酶），利于目的蛋白的穩(wěn)定性 2、細(xì)胞壁相對(duì)于枯草桿菌來講更薄，有利于外源蛋白的分泌 3、據(jù)研究其發(fā)酵液中存在著可以促進(jìn)蛋白中二硫鍵形成的因子，可以促進(jìn)外源蛋白的折疊,載體： 目前，芽孢桿菌中常用的載體主要有自主復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒和噬菌體三種 從芽孢桿菌中分離的自主復(fù)制質(zhì)粒，除極少數(shù)以外（例如pBC16），均為無抗性標(biāo)志的隱秘質(zhì)粒 帶有抗性標(biāo)志的自主復(fù)制質(zhì)粒主要來自其它G+細(xì)菌，特別是來

24、自金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒。其中廣泛使用的有pUB110、pC194和pE194等。迄今 已在上述質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙標(biāo)記質(zhì)粒、芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒、整合質(zhì)粒和探針質(zhì)粒等,絕大多數(shù)的載體在陽性菌中的拷貝數(shù)都非常低。采用整合質(zhì)粒將克隆基因整合到宿主染色體，是克服芽孢桿菌質(zhì)粒不穩(wěn)定性的一個(gè)有效的途徑 整合的目的一般通過同源重組或者轉(zhuǎn)座子插入來實(shí)現(xiàn)。這種質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)是在大腸桿菌質(zhì)粒的基礎(chǔ)上增加一個(gè)芽孢桿菌的抗性標(biāo)志，以及待整合的目的基因。 它在大腸桿菌中進(jìn)行基因克隆或亞克隆操作。整合質(zhì)粒導(dǎo)入芽孢桿菌后，由于它沒有芽孢桿菌質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)而不能自主復(fù)制，只有插入到宿主體后，隨著細(xì)胞復(fù)制而復(fù)

25、制。在含有整合質(zhì)粒中芽孢桿菌抗性標(biāo)志的抗生素的培養(yǎng)基上，就可以很容易挑出這種整合體 整合質(zhì)粒另一個(gè)重要的用途是用于目的基因的敲除。不少噬菌體都可用作載體，如105噬菌體，SP噬菌體及其它噬菌體。其中 105噬菌體應(yīng)用較多，它是一個(gè)溫和噬菌體，基因組約為39.2Kb，從中發(fā)展了不少載體。目的基因一般在體外“包裝”之后，經(jīng)噬菌體介導(dǎo)（轉(zhuǎn)導(dǎo)）而進(jìn)入宿主菌進(jìn)行表達(dá),其 他,乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙門氏菌 (Salmonella typhimurium) 蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis),三、真核表達(dá)系統(tǒng),（一）酵母表達(dá)系統(tǒng),優(yōu)點(diǎn)： 1、基因背

26、景了解清楚，上游操作簡單，生長迅速，非常適于大規(guī)模發(fā)酵。 2、具有一定的加工及修飾能力：如二硫鍵的正確形成，前體蛋白的水解加工。表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白相同或類似。 3、可將異源蛋白基因與N-末端前導(dǎo)肽等信號(hào)肽融合，指導(dǎo)新生肽的分泌，在分泌中可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾，但其修飾糖鏈與高等真核細(xì)胞并不相同。 4、可移去起始甲硫氨酸，避免了作為藥物使用可能引起的免疫反應(yīng)問題。,缺點(diǎn)： 產(chǎn)糖量過多因而損壞蛋白質(zhì)的生物活性、安全性等； 糖基化修飾與高等真核細(xì)胞并不相同。,載體：均為大腸桿菌和酵母菌的“穿梭”質(zhì)粒。有附加體型載體和整合體型載體兩種。常用啟動(dòng)子：GAL1、AOX1、AUG1、TEF1 等。 酵

27、母表達(dá)系統(tǒng)載體有： 1、整合型載體: 導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞后與酵母細(xì)胞染色體基因組DNA整合，穩(wěn)定性高，但基因拷貝數(shù)低。 2、附加體型載體：在酵母宿主中拷貝數(shù)量大，但在傳代過程中易丟失，影響重組菌的穩(wěn)定性和表達(dá)量。,常見宿主有：釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、巴氏畢赤酵母等。 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)多為附加型載體，巴氏畢赤酵母，多形漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)為整合型載體?？唆斁S酵母表達(dá)系統(tǒng)則兼而有之 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，分泌效率差，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失 目前，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng) 它以甲醇作為唯一的碳源。產(chǎn)量較高。翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物 。如日本綠十字公司利用該系統(tǒng)可以達(dá)到公

28、斤級(jí)水平的人血清白蛋白的生產(chǎn)。,商品化酵母表達(dá)系統(tǒng)有畢赤酵母（Pichia）系統(tǒng) （invitrogen）和Saccharomyces釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)（invitrogen） 畢赤酵母系統(tǒng)重組蛋白表達(dá)量可高達(dá)12 g /L，表達(dá)量最高。,（二）昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是以桿狀病毒為載體，昆蟲細(xì)胞為宿主的表達(dá)系統(tǒng)。 1、表達(dá)效率高。重組蛋白的表達(dá)水平最高可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50。 2、屬于真核表達(dá)系統(tǒng)。有糖基化作用、脂肪酸?；饔?、氨基末端乙?；饔靡约傲姿峄?，有利于表達(dá)產(chǎn)物形成天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)，保持原有的生物活性與功能。 3、桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖。,4、桿狀

29、病毒屬于昆蟲病毒。具有高度特異的宿主范圍，對(duì)脊椎動(dòng)物和植物均無致病性。病毒重組因失去多角體保護(hù)，在自然界的生存能力很弱，因此比較安全。 5、應(yīng)用晚期多角體蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)外源基因可表達(dá)毒性蛋白。 6、桿狀病毒表達(dá)載體通用性廣。可表達(dá)來自病毒、細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物幾乎所有的蛋白，并且能表達(dá)帶有內(nèi)含子的外源基因。 7、重組桿狀病毒除在體外昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)外源基因外，還能感染昆蟲活體，在體內(nèi)高效表達(dá)外源蛋白。,缺點(diǎn)： 宿主細(xì)胞生長慢 培養(yǎng)基昂貴 含有免疫宿主蛋白、 桿狀病毒感染會(huì)導(dǎo)致宿主死亡、因此每一輪蛋白合成均需重新感染 昆蟲細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式與脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式有一定的差異，其糖蛋白

30、的糖鏈結(jié)構(gòu)多為簡單的不分支結(jié)構(gòu)。,啟動(dòng)子采用多角體蛋白啟動(dòng)子。宿主細(xì)胞通常來源于雙翅目昆蟲，包括果蠅、蚊子。來源于草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）的Sf9細(xì)胞系是最常用的宿主細(xì)胞。 商品化系統(tǒng)： BaculoDirect 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（invitrogen），典型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是利用大腸桿菌中位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)座或昆蟲細(xì)胞中的同源重組來產(chǎn)生重組桿狀病毒。 DES-Drosophila expression system 結(jié)合了昆蟲細(xì)胞高表達(dá)水平和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。,（三）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)天然蛋白的理想表達(dá)系統(tǒng)，是目前應(yīng)用最廣泛

31、的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都極其顯著。產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等后加工最精確。一般會(huì)產(chǎn)生正確加工的、有活性的蛋白。,但該表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平較低、培養(yǎng)基昂貴、生長緩慢、含有過敏物質(zhì)等缺點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用過程中較難避免。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)通常用來生產(chǎn)用常規(guī)方法無法獲得的真核細(xì)胞蛋白。如EPO，TNF受體，基因工程單抗等。 CHO（中國倉鼠卵巢）是目前重組糖蛋白生產(chǎn)的首選體系。,載體： 1、病毒性載體系統(tǒng)，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其它DNA病毒載體。 優(yōu)點(diǎn)：能夠高效導(dǎo)入外源基因。 缺點(diǎn)：包裝時(shí)對(duì)其基因組的長度有嚴(yán)格的限制，插入外源基因一般較短。 2、質(zhì)粒性載體系統(tǒng)。 優(yōu)點(diǎn)

32、：適用于多種細(xì)胞；安全。 缺點(diǎn)：導(dǎo)入外源基因的效率不如逆轉(zhuǎn)錄病毒。,商品化系統(tǒng)： ViraPower慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，是第一次實(shí)現(xiàn)在不分裂的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定的高水平基因表達(dá)。 Adeno-X 表達(dá)系統(tǒng)最有效的腺病毒系統(tǒng)之一。BD Adeno-X Expression System (Clontech)可以在2周內(nèi)獲得高效價(jià)的腺病毒，其效率遠(yuǎn)高于其他腺病毒系統(tǒng)。 BD Adeno-X Tet-On & Adeno-X Tet-Off Expression Systems (Clontech) 可表達(dá)毒性蛋白質(zhì)。BD RevTet-On & RevTet-Off Gene Expression

33、 Systems (Clontech) 表達(dá)效率高。,新霉素抗性選擇系統(tǒng),新霉素是細(xì)菌抗生素，它可以干擾原核生物的核糖體，使其蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行，而真核細(xì)胞核糖體則不受新霉索的影響。新霉素的一種類似物G418(geneticin)對(duì)真核細(xì)胞和原核細(xì)胞均有毒性。,細(xì)菌的新霉素抗性基因(neor)能在真核細(xì)胞表達(dá)。neor基因編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，這種酶能使G418失活。所以，當(dāng)細(xì)胞表達(dá)了這種neo抗性基因后就會(huì)在含有G418的選擇培養(yǎng)基中存活，這種選擇系統(tǒng)適用于所有的細(xì)胞類型。,外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞,目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細(xì)胞中才能繁殖擴(kuò)增，再經(jīng)過篩選，才能獲得重組DNA分子克隆

34、，不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相同。,轉(zhuǎn)染方法,（一）質(zhì)粒為載體的物理化學(xué)轉(zhuǎn)染法 （二）以病毒為載體的生物學(xué)轉(zhuǎn)染法,磷酸鈣法,其利用的基本現(xiàn)象是：DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現(xiàn)時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞攝取DNA的效率會(huì)顯著提高。用電穿孔法處理培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞也能提高細(xì)胞攝取DNA能力，但所用外加電場(chǎng)的強(qiáng)度、電脈沖的長度等條件與處理細(xì)菌者都很不相同。,脂質(zhì)體,近年來用人工脂質(zhì)膜包裹DNA，形成的脂質(zhì)體（Liposome）可以通過與細(xì)胞膜融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，方法簡單而有效，現(xiàn)有商售的脂質(zhì)體試劑，使用日益廣泛。,顯微注射法,是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種

35、方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個(gè)細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時(shí)。,電穿孔轉(zhuǎn)染法（electroporation）,用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率。,以病毒為載體的生物學(xué)轉(zhuǎn)染法,將目的基因插入病毒載體，在病毒調(diào)控元件作用下進(jìn)行表達(dá)。作為運(yùn)載工具的病毒有SV40，人腺病毒，牛乳頭瘤病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等。,外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)方式,常用的表達(dá)方式有兩大類： 1、瞬時(shí)表達(dá) 2、穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng),瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),瞬時(shí)表達(dá)的效率取決于吸收DNA的細(xì)胞數(shù)、基因拷貝數(shù)和基因的表達(dá)水平，在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，吸收DNA的細(xì)胞數(shù)約為5%50%。因?yàn)闆]有整合，隨著細(xì)胞的生長，細(xì)胞群體中外源基因的含量逐步減少，最后消

36、失。因此瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)只能使用數(shù)天。,瞬時(shí)表達(dá)常用于下列方面：根據(jù)表達(dá)活性確證分離到的基因；研究誘變對(duì)蛋白質(zhì)活性和功能的影響；分離cDNA文庫中的基因。這種系統(tǒng)的缺點(diǎn)是不能大量繁殖能產(chǎn)生特異蛋白質(zhì)的細(xì)胞，故不能獲得大量的蛋白質(zhì)(1mg)，也不能用于研究在特定條件下才能表達(dá)的基因。,穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng),如果在轉(zhuǎn)染DNA后進(jìn)行篩選。則可能得到外源基因整合到染色體中的穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。不同品系的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和整合DNA的能力不同，而在篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞過程中，整合的能力比轉(zhuǎn)染的能力更重要。,（四）轉(zhuǎn)基因植物,與微生物和動(dòng)物生物生物反應(yīng)器相比,植物生物反應(yīng)器有不可替代的優(yōu)越性 1.生產(chǎn)成本較低,易于大規(guī)模工業(yè)生

37、產(chǎn)。植物能進(jìn)行光合作用,僅需要來自土壤的礦物質(zhì)和水分便可在適宜的條件下獲得大量人們所需的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物 2.植物細(xì)胞具有全能性,易于獲得再生植株,遺傳操作相對(duì)簡單,培養(yǎng)周期較短 3.轉(zhuǎn)基因植物通過自交得到的后代遺傳性狀穩(wěn)定,從而可以在植物體內(nèi)積累多基因 4.產(chǎn)物貯藏在種子、果實(shí)和塊莖中便于貯運(yùn),其中那些能直接食用的植物疫苗不需特殊貯存條件,5.無毒副作用,安全性好 細(xì)菌作為生物反應(yīng)器時(shí),不能對(duì)真核生物的蛋白進(jìn)行有效的翻譯后加工,而且本身可能是人類病原物 動(dòng)物作為生物反應(yīng)器時(shí),在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能感染上動(dòng)物病毒而對(duì)人類健康造成潛在危害 植物作為生物反應(yīng)器被認(rèn)為是相對(duì)安全的,因?yàn)橹参矬w只表達(dá)病原菌的部

38、分免疫蛋白,不含致病微生物或潛在的致病微生物,對(duì)人蓄安全,大大提高了表達(dá)產(chǎn)物的生物安全性 6.植物中的蛋白加工途徑相對(duì)保守,表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行正確的糖基化、磷酸化、酰胺化及翻譯后加工過程,因此表達(dá)產(chǎn)物具有與高等動(dòng)物細(xì)胞一樣的免疫原性和生物活性,植物轉(zhuǎn)基因主要方法 農(nóng)桿菌導(dǎo)入法這種方法是將農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共同培養(yǎng) , 用農(nóng)桿菌整合的目的基因的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞 , 然后通過組織培養(yǎng) , 獲得轉(zhuǎn)基因植株 基因槍法這種方法用表面附著DNA分子 (含目的基因) 的金屬微粒 , 經(jīng)過加速裝置 , 轟擊植物細(xì)胞 , 將DNA直接射入植物帶壁的細(xì)胞 , 轉(zhuǎn)化率可達(dá) 8 %10 %。這種方法不受受體種類限制 ,快

39、速簡單 , 但設(shè)備昂貴 花粉管通道法將目的基因整合后 , 在植株開化時(shí)利用花粉管通道直接導(dǎo)入受體植株。這是我國科學(xué)工作者發(fā)明的方法 , 主要用于棉花轉(zhuǎn)基因研究。,轉(zhuǎn)基因植物在醫(yī)藥中的應(yīng)用 疫苗 藥用蛋白,轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)體系的問題及解決方案,1、外源蛋白表達(dá)量低 蛋白質(zhì)靶向定位 定位到合適的亞細(xì)胞部位，如細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、葉綠體、液泡等。外源基因整合到葉綠體基因組后表達(dá)量最大可達(dá)到葉片可溶性蛋白的46.1% 對(duì)外源基因進(jìn)行優(yōu)化 使用植物偏好密碼子 優(yōu)化前導(dǎo)肽序列，取出mRNA中不穩(wěn)定序列和無效抑制序列，并同時(shí)表達(dá)有助于正確折疊的酶或蛋白質(zhì)，如分子伴侶等 合理選擇啟動(dòng)子并加以改造 使用增強(qiáng)子序列，

40、利用組織特異性的啟動(dòng)子，或者人工構(gòu)建復(fù)合式啟動(dòng)子 如與花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子相比，增強(qiáng)型雙35S啟動(dòng)子可以使外源基因轉(zhuǎn)錄效率高出10倍,使用核基質(zhì)附著區(qū)MAR序列 利用染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，將MAR連接于外源基因兩側(cè)，可使外源基因稱為一獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元，減少周邊序列的影響。即可避免外源基因表達(dá)的位置效應(yīng)，又可提高外源基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的穩(wěn)定性和表達(dá)水平 使用植物病毒表達(dá)載體 病毒載體在宿主細(xì)胞中能夠反復(fù)復(fù)制且繁殖速度快，可使外源基因在短時(shí)間內(nèi)大量積累并高效表達(dá),2、下游加工成本高 對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行提純費(fèi)用較高 合理選擇受體系統(tǒng)，如將外源基因整合到直接是用的植物中或植物的可食器官即可避免或部分

41、避免表達(dá)產(chǎn)物的加工 如香蕉：易消化、口感好，且在熱帶和亞熱帶常年生長，是食用疫苗的理想宿主 3、安全性問題 植物種類的安全性，如煙草的煙堿污染 外源基因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境的影響,（五）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)及其新藥研發(fā)中的應(yīng)用,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)始于80年代初，所謂轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就是指以實(shí)驗(yàn)方法將外源基因?qū)雱?dòng)物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。近十年來，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究發(fā)展十分迅速，已先后建立了許多整合有外源基因的轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠，轉(zhuǎn)基因魚、兔、豬、羊、牛等也已誕生。 由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體系打破了自然繁殖中的種間隔離，使基因能在種系關(guān)系很遠(yuǎn)的機(jī)體間流動(dòng)，它將對(duì)整個(gè)生命科學(xué)產(chǎn)生全局性影響，因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在

42、1991年第一次國際基因定位會(huì)議上被公認(rèn)為遺傳學(xué)中繼連鎖分析、體細(xì)胞遺傳和基因克隆之后的第四代技術(shù)，被列為生物學(xué)發(fā)展史上126年中第14個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。,一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)研究,步驟： 構(gòu)建功能基因 轉(zhuǎn)移 生殖細(xì)胞 假孕母體發(fā)育 表型分析 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,方法：,原核DNA顯微注射法(Pronuclear DNA microinjection) 多能性干細(xì)胞法（Pluripotent stem cells） 病毒載體法（viral vectors） 精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Sperm-mediated gene transfer） 核轉(zhuǎn)移法（nuclear transfer）,1.原核顯微注射法,原核顯

43、微注射法優(yōu)缺點(diǎn)：,優(yōu)點(diǎn)： 1.整合效率高； 2.外源基因長度可達(dá)數(shù)百Kb； 3.直接獲得純系動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)較短。 缺點(diǎn)： 1.設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜； 2.隨機(jī)整合、拷貝數(shù)無法控制； 3.常造成插入位點(diǎn)附近宿主DNA大片段缺失、重組等突變，出現(xiàn)動(dòng)物嚴(yán)重生理缺陷。,2多能性干細(xì)胞法,主要是胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cell，ESC），是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細(xì)胞系，具有胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特征。在適當(dāng)?shù)臈l件下可參與胚胎構(gòu)成，從而產(chǎn)生嵌合體動(dòng)物。 ESC法是在基因組相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行同源重組或置換，而將外源DNA定向整合到內(nèi)源基因組中表達(dá)。,胚胎干細(xì)胞法的

44、優(yōu)缺點(diǎn)：,優(yōu)點(diǎn)： 在將胚胎干細(xì)胞植入胚胎前，可以在體外選擇一個(gè)特殊的基因型； 用外源DNA轉(zhuǎn)染以后，胚胎干細(xì)胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細(xì)胞用于細(xì)胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。,缺點(diǎn)： 許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生殖細(xì)胞內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因，須進(jìn)一步雜交才能獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。,3病毒載體法,將目的基因以RNA分子的形式重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染的目的。然后在逆轉(zhuǎn)錄整合酶和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組末端的特異性核酸序列的作用下，目的基因?qū)⒈环崔D(zhuǎn)錄并整合到宿主基因組中去。,

45、病毒載體法優(yōu)缺點(diǎn)：,優(yōu)點(diǎn)： 1.目的基因呈單一位點(diǎn)單拷貝整合、整合率高 ； 2.插入位點(diǎn)克隆分析較容易 ； 缺點(diǎn)： 1.不安全； 2.轉(zhuǎn)入基因的承載能力有限，一般小于10Kb ； 3.所得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的嵌合性很高，建立轉(zhuǎn)基因系需要廣泛的雜交 ； 4.逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組兩側(cè)的長末端重復(fù)序列（longterminal repeats, LTRs）會(huì)影響哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子或引起錯(cuò)誤表達(dá)，其甲基化狀態(tài)常使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)缺失,4精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法,在精子后頂體區(qū)域有一種DNA結(jié)合蛋白（DBPs），它可以介導(dǎo)外源DNA與精子表面結(jié)合。受精后外源DNA即可整合于染色體中。 簡單、方便，依靠生理受精過程，免去了原核

46、的損傷。 主要有三種方式：胞質(zhì)內(nèi)精子注射途徑（ICSI）、電轉(zhuǎn)移或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染途徑、睪丸體內(nèi)轉(zhuǎn)染途徑,5核轉(zhuǎn)移法,1996年，Schnieke用人類因子IX（human factor IX）轉(zhuǎn)染綿羊胎兒纖維母細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核通過核轉(zhuǎn)移得到HF IX轉(zhuǎn)基因綿羊。 將供體細(xì)胞核轉(zhuǎn)入到受精卵的胞質(zhì)或MII期卵母細(xì)胞中，供體細(xì)胞的核以及胞質(zhì)成分，包括線粒體等，就都會(huì)被轉(zhuǎn)移。后者可能會(huì)促使胚胎重構(gòu)、胎兒發(fā)育以及分娩新生個(gè)體。,與DNA顯微注射法相比：,1.根據(jù)具體方案的要求可選擇雄性或雌性細(xì)胞株； 2.序列的整合和表達(dá)在轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞用于核供體之前就可以檢測(cè)； 3.轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以凍存長期保存； 4.在一個(gè)克隆動(dòng)物體內(nèi)的所有細(xì)胞都含有目的基因，避免了遺傳差異性，并確保生殖細(xì)胞也轉(zhuǎn)移了目的基因； 5.得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率比顯微注射幾乎高一倍。,6. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),外源基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)后，其過量表達(dá)常常會(huì)對(duì)胚胎的發(fā)育產(chǎn)生毒性作用甚至致死作用，從而影響了表型的分析甚至無法獲得轉(zhuǎn)基因系。 目前發(fā)展比較成熟的轉(zhuǎn)基因可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)主要有兩種18：四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)（tet系統(tǒng)）和Cre/loxP重組酶系統(tǒng)。,這兩個(gè)系統(tǒng)均需要制備兩個(gè)系列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，一個(gè)系列表達(dá)具有選擇性組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控下的激動(dòng)子依賴于四