1、免疫組化基本操作,小 新,SP原理,免疫組化實(shí)驗(yàn)基本原理,免疫組化實(shí)驗(yàn)操作步驟,切片脫蠟至蒸餾水或PBS PBS沖洗2min3次，（如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)） 3%H2O2室溫孵育10分鐘。蒸餾水沖洗，PBS沖洗2min3 滴加一抗工作液，37孵育1.52h或4過(guò)夜。PBS沖洗， 2min3次 滴加適當(dāng)量的檢測(cè)系統(tǒng)，37孵育1530分鐘 PBS沖洗， 2min3次 DAB顯色劑顯色 自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明（如需要）、封 片,組織的前期處理,組織固定 烤片,固定時(shí)間對(duì)染色的影響,固定比較：Vimentin （V-9）,中性福爾馬林固定 72小時(shí),中性福爾馬林固定48小時(shí),固定時(shí)間

2、較長(zhǎng)的標(biāo)本，可通過(guò)加強(qiáng)修復(fù) 增強(qiáng)染色效果 取材后組織（1.01.40.4cm）推 薦后固定時(shí)間4-18小時(shí),Ci pH 6 10Min,Ci pH 6 30Min,TE pH 9 10Min,烤片的溫度不宜過(guò)高 烤片的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),烤片的影響因素,二個(gè)主要因素：,烤片的溫度和時(shí)間對(duì)組織內(nèi)抗原 的保存有一定的影響，尤其是細(xì) 胞核陽(yáng)性的抗原 推薦烤片溫度及時(shí)間68-70烤2-4 小時(shí),烤片的影響因素,抗原方式的選擇及操作方法 一抗的選擇及稀釋比 檢測(cè)系統(tǒng)的恰當(dāng)匹配,實(shí)驗(yàn)中需要注意的問(wèn)題,關(guān)鍵步驟：,溫度和時(shí)間的相關(guān)性 修復(fù)液的pH值亦很重要,抗原修復(fù)的主要方法,抗原熱修復(fù)的主要影響因素：,抗原熱修

3、復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系,MBI單克隆抗體免疫組化靈敏度實(shí)驗(yàn),抗原熱修復(fù)的有效性 =加熱溫度（T） 加熱時(shí)間（t）,高溫可以縮短修復(fù)時(shí)間 低溫需要更長(zhǎng)的修復(fù)時(shí)間 某些蛋白（抗原）需要較低溫度修復(fù),微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較,不同修復(fù)方式CD20的染色結(jié)果,單克隆抗體 CD20 高壓鍋修復(fù),單克隆抗體 CD20 微波修復(fù),抗原熱修復(fù):pH值的影響,pH6,A：CD20 B：Ki-67 C：HMB45 D: MOC31,pH8-9,A 穩(wěn)定型抗體：pH值改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果影響不大 B “V”型抗體：強(qiáng)酸強(qiáng)堿修復(fù)液效 果好，但強(qiáng)酸條件下，細(xì)胞皺縮 變形，影響觀察 C 上升型抗體：修復(fù)液pH值越高， 效果越

4、好 D下降型抗體：適用于酸性修復(fù)液,四種類型的抗體,抗 原 修 復(fù),Calponin: 用不同pH值修復(fù)液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,高壓修復(fù)： 將修復(fù)液燒開(kāi)后將切片放入高壓鍋中，然后 蓋好蓋子，加上氣壓閥，繼續(xù)加熱。待噴汽后開(kāi)始計(jì)時(shí)2.5分鐘后停止加熱，自然冷卻。 微波修復(fù)： 將切片放入修復(fù)液中，然后將修復(fù)液燒開(kāi)，此時(shí)降低火力持續(xù)20分鐘。然后自然冷卻。,抗原熱修復(fù)方式的推薦,不修復(fù) 熱修復(fù) ：微波、高壓、水浴 酶消化：胃酶、胰酶、蛋白酶K、 XXV酶 雙暴露：先熱處理后酶消化or先酶 消化后熱處理,選擇最佳修復(fù)方式,正確的克隆號(hào) 適當(dāng)?shù)南♂尪?推薦4過(guò)夜，可以選擇室溫1.52h或37 1h,一抗的選擇,檢測(cè)系統(tǒng)的選擇,針對(duì)不同的組織選擇不同的二抗 兩步法原理,單克隆抗體 Chromogranin A,多克隆抗體 Chromogranin A,CgA多克隆與兔單抗比較,針對(duì)不同組織選擇不同的二抗,對(duì)于肝臟、腎臟等生物素含量高的標(biāo) 本一定要選擇非生物素的檢測(cè)系統(tǒng) 酶標(biāo)二抗可以有效避免生物素的干