1、.,第四章 微生物的生長與環(huán)境條件,.,微生物的生長與環(huán)境條件,一、微生物生長測定 二、微生物的生長規(guī)律 三、微生物的培養(yǎng) 四、微生物生長的環(huán)境條件 五、消毒與滅菌,.,第一節(jié)、微生物生長測定,一、測定單細(xì)胞微生物數(shù)量 （一）總菌數(shù)測定法 1.計數(shù)板測定法 2.比濁法 (二)活菌數(shù)測定法 1.平板菌落計數(shù)法 2.液體稀釋測定法 3.膜過濾計數(shù)法,.,二、測定微生物生長量和生理指標(biāo),1.干重法 2.蛋白質(zhì)含量測定法 3.其他生理指標(biāo)測定法,.,(一) 微生物數(shù)量的測定 1、顯微鏡直接計數(shù)法 使用細(xì)菌計數(shù)板或血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。 優(yōu)點：操作簡便，計數(shù)直觀。,一、微生物生長量的測定,.,(

2、一) 微生物數(shù)量的測定 2、稀釋平板計數(shù)法 對樣品稀釋培養(yǎng)，據(jù)形成的菌落數(shù)計數(shù)。 優(yōu)點：傳統(tǒng)計數(shù)方法。對設(shè)備要求不高。,一、微生物生長量的測定,10-3,10-5,10-4,10-6,.,(一) 微生物數(shù)量的測定 、比濁計數(shù)法 根據(jù)細(xì)菌懸浮液的吸光度測定其數(shù)量。 優(yōu)點：簡便，直接。,一、微生物生長量的測定,.,(二) 微生物重量的測定 1、稱重法 用離心或過濾的方法將菌體從培養(yǎng)基中分離、冼凈，稱濕重或干重。 優(yōu) 點：簡單可靠。,一、微生物生長量的測定,第二節(jié) 微生物純培養(yǎng)群體生長規(guī)律,在活性污泥法中采用的指標(biāo)： （1）混合液懸浮固體(MLSS)（粗放測定） 污泥干燥-稱重(W1) （2）揮發(fā)性

3、懸浮固體(MLVSS)（相對準(zhǔn)確） 上述已稱重污泥-馬福爐(500度2小時)-冷卻-稱重(W2),.,(二) 微生物重量的測定 2、蛋白質(zhì)含量測定法 根據(jù)樣品中菌體蛋白質(zhì)含量計算微生物重量的方法。,一、微生物生長量的測定,原理：（1）微生物蛋白質(zhì)含量穩(wěn)定 （2）氮是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定成分 (蛋白質(zhì)量=6.25總含N量),優(yōu)點：測定準(zhǔn)確。,.,微生物的生長規(guī)律,一、無分支單細(xì)胞微生物的群體生長規(guī)律 （一）生長曲線 1.延滯期 2.對數(shù)期 3.穩(wěn)定期 4.衰亡期 （二）生長曲線對發(fā)酵生產(chǎn)的指導(dǎo)意義（略）,.,根據(jù)細(xì)菌生長繁殖速率將生長曲線分四個階段：,第二節(jié) 微生物純培養(yǎng)群體生長規(guī)律,緩慢期 對數(shù)期 穩(wěn)

4、定期 衰亡期,二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律,.,第二節(jié) 微生物純培養(yǎng)群體生長規(guī)律,緩慢期（延遲期、滯留適應(yīng)期）,滯留適應(yīng)期,二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律,特 點：分裂遲緩、代謝活躍。,產(chǎn)生原因：,（2） 細(xì)胞分裂必需因子的缺乏,（1）接種時的機械損傷引,.,第二節(jié) 微生物純培養(yǎng)群體生長規(guī)律,緩慢期（延遲期、滯留適應(yīng)期）,4、菌株的遺傳性,滯留適應(yīng)期,二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律,研究滯留適期長短的意義？,影響滯留適應(yīng)期長短的因素,1、培養(yǎng)基成分,2、接種物菌齡,3、接種量,.,第二節(jié) 微生物純培養(yǎng)群體生長規(guī)律,對數(shù)期（指數(shù)生長期）,特點： （1）代謝活性強 （2）世代時短而穩(wěn)定,對數(shù)生長期,二

5、、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律,.,第二節(jié) 微生物純培養(yǎng)群體生長規(guī)律,對數(shù)期（指數(shù)生長期）,對數(shù)生長期,二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律,見教材P93,Nt=2n N0 n=3.33(lgNt-lgN0) G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0) n繁殖代數(shù) G世代時(每繁殖一代所需的時間) N0對數(shù)生長期開始微生物數(shù)量 Nt對數(shù)生長期經(jīng)過時間t后微生物數(shù)量,.,第二節(jié) 微生物純培養(yǎng)群體生長規(guī)律,穩(wěn)定期（最高生長量期）,最高生長量期,特 點： 1、細(xì)菌數(shù)量增加率為0。 2、部分細(xì)菌大量積累代謝產(chǎn)物。,細(xì)菌數(shù)量增加率為0的原因?,二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律,.,第二節(jié) 微生物純培養(yǎng)群體生長規(guī)律

6、,衰亡期,特 點：菌體活性降低、大量死亡； 細(xì)胞畸變、自溶 革蘭氏染色不穩(wěn)定,衰亡期,二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律,.,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),一、微生物純培養(yǎng)的概念,實驗室條件下， 由一個微生物細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖得到的后代。,.,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),二、微生物純培養(yǎng)技術(shù),純培養(yǎng)基本步驟：,(2) 培養(yǎng),(1) 分離,.,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),二、微生物純培養(yǎng)技術(shù),1、稀釋平板分離法：傾注平板法和涂布平板法。 基本過程：（1）梯度稀釋過程；（2）分離培養(yǎng)過程,涂布,傾注,梯 度 稀 釋 過 程,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,.,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),二、微生物純

7、培養(yǎng)技術(shù),4) 操作要點： 無菌操作,稀釋平板分離法使用過程中的幾個問題,1) 梯度稀釋度的確定： 需分離微生物在樣品中的數(shù)量,2) 選擇菌落接種的依據(jù)： a、菌落特征； b、菌體的特征,3) 微生物純培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)： 菌落特征一致性,.,2、單細(xì)胞挑取法： 從待分離材料中挑取一個細(xì)胞來培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)的過程。,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),二、微生物純培養(yǎng)技術(shù),.,3、平皿劃線法 (P圖-) 用接種環(huán)沾少許待分離的材料，在培養(yǎng)基表面進行多次平行劃線，使微生物細(xì)胞分開生長以獲得微生物純培養(yǎng)的過程。,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),二、微生物純培養(yǎng)技術(shù),.,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),三、目標(biāo)微生物純培養(yǎng)篩選的基本思路

8、,、待分離樣品的確定,、培養(yǎng)基的選擇,、純化過程環(huán)境條件的控制 （溫度、空氣、P、抑制劑）,（）,.,（一）純培養(yǎng)的保存 試管斜面培養(yǎng)基低溫、干燥、隔絕空氣,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),四、純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯,1、滅菌徹底 2、棉塞大小要合適 3、無菌操作,保存過程的注意點：防止雜菌污染。,.,（二）純培養(yǎng)的衰退與復(fù)壯,第三節(jié) 微生物純培養(yǎng),四、純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯,.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,極端環(huán)境條件對微生物的影響 死 亡,.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,一、溫度,1、溫度對微生物生長的影響,.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,2、高溫滅菌,一、溫度,高溫滅菌,濕熱滅菌,干熱滅菌：干燥條件，160維持

9、1-2h。,高壓蒸汽滅菌法：密閉條件下，水加熱蒸發(fā)形成高壓 的同時產(chǎn)生高溫。利用高溫殺死菌。,巴斯德消毒法：采用60-70的溫度處理15-30min 的消毒方法。,.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,3、低溫保藏,一、溫度,菌種保存（試管斜面或孢子砂土管）,食品保藏,特例：流感桿菌、腦膜炎球菌,.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,二、氧氣p94,專性好氧菌 Eh0.1V，而以0.3-0.4v為宜 兼性厭氧菌Eh0.1v行好氣呼吸 厭氧菌Eh值0.1V以下 耐氧菌 微好氧菌,.,專性好氧菌（strict aerobe）,必須在有分子氧的條件下才能生長，有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細(xì)胞含有超氧物歧

10、化酶（SOD，superoxide dismutase）和過氧化氫酶。,在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下生長得更好，在有氧時靠呼吸產(chǎn)能，無氧時接發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能；細(xì)胞含有SOD和過氧化氫酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能較低的氧分壓下才能正常生長，通過呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能,兼性好氧菌（facultative aerobe）,.,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下進行厭氧生活的厭氧菌。生活不需要氧，分子氧也對它無毒害。不具有呼吸鏈，依靠專性發(fā)酵獲得能量。細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶，但缺乏過氧化氫酶。,

11、厭氧菌（anaerobe）,分子氧對它有毒害，短期接觸空氣，也會抑制其生長甚至致死；在空氣或含有10%CO2的空氣中，在固體培養(yǎng)基表面上不能生長，只有在其深層的無氧或低氧化還原電勢的環(huán)境下才能生長；生命活動所需能量通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵提供；細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。,.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,三、水分,1、水分對微生物生長的影響： 細(xì)菌最適水的活度值：0.93-0.99 酵母菌最適水的活度值：0.88-0.91 霉菌最適水的活度值： 0.80,2、應(yīng)用：干燥法保存物品 食品的冷凍干燥,水的活度小于0.60-0.70時 休眠、部分出現(xiàn)細(xì)

12、胞脫水、蛋白質(zhì)變性(多數(shù)微生物),.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,三、輻 射,輻射：能量通過空間傳遞的一種物理現(xiàn)象。,1、可見光：（400nm800nm） 對微生物的作用：,光氧化作用：有氧條件下，光線被細(xì)胞內(nèi)色素吸收，使酶或其它敏感成分失活引起的微生物死亡。,（3）光氧化作用。,（1）能源,（2）刺激擔(dān)子菌子實體形成,.,2、紫外線： 殺菌波長范圍：240300nm 殺菌力最強范圍： 255265nm,三、輻 射,紫外線殺菌特點： 穿透力弱，用作表面消毒或空氣滅菌,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,.,3、電離輻射,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,三、輻 射,高能電磁波照射后發(fā)生的電離作用。,電離輻射對微生

13、物的作用：,糧食、果蔬、畜禽產(chǎn)品、飲料以及衛(wèi)生材料殺菌處理,低劑量(500倫琴)：促進生長、誘發(fā)變異,高劑量（10萬倫琴）：殺菌作用,實際應(yīng)用：,（X射線、射線等）,.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,四、化學(xué)藥物,1、重金屬鹽類,殺菌機理：,殺菌機理： 與帶陰電荷的菌體蛋白質(zhì)結(jié)合使其變性 （Hg、Ag鹽，與細(xì)菌酶蛋白的巰基結(jié)合）,2、有機化合物（酚、醇、醛）,蛋白質(zhì)變性,損傷細(xì)胞壁和膜,抑制酶系統(tǒng)(脫氫酶、氧化酶等)；,.,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,四、化學(xué)藥物,殺菌機理： 漂白粉Ca(OCl)2及氯氣 ：產(chǎn)生次氯酸鹽和原子氧； 碘：與酶分子中的酪氨酸結(jié)合。,3、氧化劑（高錳酸鉀、過氧化氫、過氧乙

14、酸）,4、鹵素（Cl、I常見）,.,具有降低表面張力效應(yīng)的物質(zhì)。,第四節(jié) 微生物的生活環(huán)境,四、化學(xué)藥物,直接干擾病原微生物的生長繁殖并用于治療感染性疾病的化學(xué)藥物。 （選擇性的殺菌或抑菌）,5、表面活性劑（新潔爾滅、消毒寧等）,殺菌機理：影響細(xì)胞生長、分裂,6、化學(xué)治療劑,抑制葉酸合成 如：磺胺類藥物等。,殺菌機理：,抑制蛋白質(zhì)合成 如：鏈霉素，紅霉素、四環(huán)素、氯霉素等,抑制肽聚糖合成 如：青霉素，萬古霉素等。,.,第五節(jié)：消毒與滅菌,幾個基本概念,滅菌（sterilization） 采用強烈的禮花因素是任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌。 消毒（disinfe

15、ction） 采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對人體有害的病原菌，而對被處理物體基本無害的措施，稱為消毒。 防腐（antisepsis） 利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止物品發(fā)生霉腐的措施，稱為防腐。 化療（chemotheraphy） 即化學(xué)治療。利用具有高度選擇毒力的化學(xué)物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病院微生物的生長繁殖，以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。,.,1、高溫滅菌（消毒）法是最常用的物理方法。高溫可引起蛋白質(zhì)、核酸等活性大分子氧化或變性失活而導(dǎo)致微生物死亡。,一、常用的滅菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法,（一）溫度,.,干熱滅菌法（dry heat steri

16、lization） 焚燒法（incineration）：是將被滅菌物品在火焰中燃燒，使所有的生物質(zhì)碳化。簡單、徹底，但對被滅菌物品的破壞極大。適用于無經(jīng)濟價值的物品滅菌，及不怕燒的實驗器具，如接種環(huán)、鑷子、試管或三角瓶口的滅菌等。 干燥熱空氣滅菌法(hot-air oven)：將物品放入烘箱內(nèi)，然后升溫至150170 ，維持12小時。適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌，不適合液體樣品，及棉花、紙張、纖維和橡膠類物質(zhì)的滅菌。 特點：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死，所以溫度高、時間長。,.,濕熱法(moist heat sterilization) ： 特點：溫度低、時間短、滅菌效果

17、高 原因： 1) 菌體內(nèi)含水量越高，則凝固溫度越低； 2) 蒸汽冷凝會放出潛熱； 3) 飽和水蒸汽穿透力強； 4) 濕熱易破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子的穩(wěn)定 性，主要破壞氫鍵結(jié)構(gòu)。,.,高壓蒸汽滅菌法 利用水的沸點隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達(dá)到100 以上高溫滅菌的方法。 方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）維持15-20min。 112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。 115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。 應(yīng)根據(jù)滅菌物品的性質(zhì)或成分選擇滅菌溫度 例如：生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基用121 。 含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培養(yǎng)基用112 。 適

18、用：耐高溫物品，玻璃儀器、含水或不含水的物品。,.,高 壓 蒸 汽 滅 菌 鍋,注意事項： 排凈冷空氣； 滅菌終了，緩慢降壓； 滅菌結(jié)束，趁熱取出物品。,.,消毒p100,.,煮沸消毒法 將水加熱至100，煮沸15min30min，可殺死所有營養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢，達(dá)到消毒物的目的。 巴斯德消毒法（Pasteurization）： 用較低的溫度來殺死其中的病源微生物，這樣既保持食品的營養(yǎng)風(fēng)味，又進行了消毒 該法一般是將待消毒的液體食品置于62處理30min，然后迅速冷卻。即可達(dá)到消毒目的。 低溫長時法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min處理牛奶 高溫瞬時法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.