1、主講：鮑成滿,第十章 發(fā)酵染菌及其防治,知識(shí)目標(biāo) 掌握染菌對(duì)發(fā)酵過程的影響； 掌握發(fā)酵異常現(xiàn)象及原因分析 掌握雜菌污染的途徑 能力目標(biāo)： 能夠發(fā)現(xiàn)種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象； 能進(jìn)行染菌的檢查和判斷、發(fā)酵染菌原因分析； 能雜菌污染的挽救與處理措施。,第一節(jié) 染菌對(duì)發(fā)酵的影響 第二節(jié) 發(fā)酵染菌的分析 第三節(jié) 雜菌污染的途徑和防止染菌,第一節(jié) 染菌對(duì)發(fā)酵的影響,純種培養(yǎng)要求必須防止雜菌污染，為防止染菌，采取措施： 密閉式發(fā)酵罐、無 菌空氣、無菌室、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌、無菌操作,染菌率的統(tǒng)計(jì),以發(fā)酵罐染菌批（次）為基準(zhǔn)，染菌罐批（次）應(yīng)包括染菌重消的重復(fù)染菌批（次）在內(nèi)。整個(gè)發(fā)酵周期中，無論前期或后期染

2、菌，均作“染菌”論處。,一 染菌對(duì)不同發(fā)酵過程的影響,青霉素發(fā)酵：發(fā)酵前、中、后期都很容易感染能產(chǎn)青霉素酶的雜菌，能使青霉素迅速破壞，使發(fā)酵一無所獲。,檸檬酸發(fā)酵：產(chǎn)酸后，發(fā)酵液pH很低，不易染菌，主要防止前期染菌。但對(duì)于能在較低pH發(fā)酵液中生長(zhǎng)的雜菌來講，其對(duì)檸檬素發(fā)酵危害也很大，如青霉菌。,谷氨酸發(fā)酵：周期短，產(chǎn)酸快，培養(yǎng)基不太豐富，不易染菌，主要防噬菌體。一旦受到噬菌體污染，其蔓延迅速，難以防治，而且容易造成連續(xù)污染。,疫苗發(fā)酵：現(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。,肌苷、肌苷酸發(fā)酵：生產(chǎn)菌為

3、多種營(yíng)養(yǎng)缺陷型，生產(chǎn)能力差，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，易受到各種生長(zhǎng)較快的雜菌污染，如芽孢桿菌，而且染菌后培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分迅速消耗，嚴(yán)重抑制生長(zhǎng)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成。,二 不同時(shí)間發(fā)生染菌對(duì)發(fā)酵的影響,種子培養(yǎng)期染菌：培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，容易染菌，而且種子染菌對(duì)發(fā)酵危害較大，應(yīng)嚴(yán)格控制種子污染。,發(fā)酵前期染菌：較容易染菌，污染后雜菌迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)成分和氧，嚴(yán)重抑制生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)繁殖，最終導(dǎo)致產(chǎn)物的積累大大減少，甚至造成發(fā)酵失敗。,發(fā)酵中期染菌： 危害極大，不但影響生產(chǎn)菌的繼續(xù)生長(zhǎng)，還會(huì)嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的產(chǎn)物合成代謝，減少產(chǎn)物的生成。而且由于營(yíng)養(yǎng)成分大量消耗，發(fā)酵產(chǎn)物正在大量積累，一般挽救處理困難，危害

4、性很大。故在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)快處理。,發(fā)酵后期染菌： 發(fā)酵后期產(chǎn)物積累較多，營(yíng)養(yǎng)接近耗盡，此時(shí)染菌影響相對(duì)小些，一般可繼續(xù)發(fā)酵；若污染嚴(yán)重，可采取提前放罐來減少損失。,三 染菌程度對(duì)發(fā)酵的影響,染菌程度越大，即進(jìn)入發(fā)酵罐的雜菌數(shù)目越多，對(duì)發(fā)酵的危害越大 染少量雜菌，有時(shí)可以容忍。,四 染菌對(duì)產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響 菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘、發(fā)臭，過濾困難,第二節(jié) 發(fā)酵染菌的分析,一 發(fā)酵染菌的異?，F(xiàn)象 指由于發(fā)酵染菌導(dǎo)致發(fā)酵過程中某些物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)或生物參數(shù)發(fā)生于原有規(guī)律不同的改變。 1 種子培養(yǎng)染菌后的異常現(xiàn)象 2 發(fā)酵染菌后的異?，F(xiàn)象,1 種子培養(yǎng)染菌后的異常現(xiàn)象,菌體濃度異常：包

5、括菌體濃度逐漸降低和菌體濃度迅速升高 理化指標(biāo)異常：雜菌生長(zhǎng)則導(dǎo)致宏觀理化指標(biāo)發(fā)生變化，如溫度、pH值等 代謝異常：碳源、氮源消耗速度發(fā)生變化。,2 發(fā)酵染菌后的異?，F(xiàn)象,菌體濃度異常：發(fā)酵中菌體或菌絲濃度是固有規(guī)律在變化 pH值過高或過低：pH值變化是所有代謝的綜合反映，固定發(fā)酵階段pH值具有一定規(guī)律,溶解氧和二氧化碳水平異常：可以斷定是發(fā)生染菌現(xiàn)象,泡沫過多：污染噬菌體非常容易產(chǎn)生過多泡沫,代謝異常：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用和產(chǎn)物的生成出現(xiàn)異常現(xiàn)象。,二 染菌的檢查與判斷 1.染菌的檢查,顯微鏡檢查法（最簡(jiǎn)單、最直接、最經(jīng)常） 平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法； 平板制好后，應(yīng)先保溫24小時(shí)，確定無菌,

6、肉湯培養(yǎng)基檢查法（酚紅變色pH6.8-8.4） 雙層平板培養(yǎng)法檢查,2.檢查法的不足,以上3種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯定未被染菌 原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較大的染菌情況（1個(gè)/ml）,三 染菌原因的分析,造成發(fā)酵染菌的原因有很多，歸納起來有：種子帶菌、無菌空氣帶菌、設(shè)備滲漏、原輔料滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理不善。,項(xiàng)目 百分率% 總空氣系統(tǒng)有菌 19.96 種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64 夾套穿孔 12.36 盤管穿孔 5.89 接種管穿孔 0.39 閥門滲漏 1.45 攪拌軸密封滲漏 2.09 罐蓋漏 1.54 其它設(shè)備滲漏 10.13 操作原因 10.15 接種時(shí)罐壓跌零

7、0.19 培養(yǎng)基滅菌不透 0.79 泡沫冒頂 0.48 原因不明 24.94,幾家抗生素工廠發(fā)酵染菌原因,上海第三制藥廠染菌原因分析,管理不善而染菌的有31個(gè)罐批，占25.08。經(jīng)分析有下列原因： 項(xiàng)目 百分率% 進(jìn)罐前未做設(shè)備嚴(yán)密度檢查 25.8 接種違反操作規(guī)程 25.8 檢修質(zhì)量缺乏驗(yàn)收制度 19.35 操作不熟練 19.35 配料違反工藝規(guī)程 6.45 調(diào)度不當(dāng) 3.25,上海第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析 項(xiàng)目 百分率% 空氣系統(tǒng)有菌 26.00 接種 11.00 管理問題 7.80 外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料） 8.20 設(shè)備穿孔 7.60 停電罐壓跌零 1.60 蒸汽壓力不足或蒸

8、汽量不足 0.60 操作違反規(guī)程 1.60 種子帶菌 0.60 原因不明 35.00,一般染菌原因分析,不同染菌時(shí)間分析 不同染菌類型分析 不同染菌幅度分析,（1）染菌的時(shí)間分析 種子培養(yǎng)階段：種子，滅菌，操作； 發(fā)酵前期：種子，滅菌，操作； 發(fā)酵后期：空氣，補(bǔ)料，設(shè)備滲漏，泡沫,（2）染菌的雜菌種類分析： 雜菌是耐熱的芽孢桿菌（滅菌、死角） 雜菌是不耐熱菌（種子帶菌、空氣帶菌，設(shè)備滲漏，管理操作等） 雜菌是真菌,（3）染菌的規(guī)模分析 大批量發(fā)酵罐染菌：種子、空氣； 前期：種子帶菌，滅菌問題； 中后期：空氣帶菌； 部分發(fā)酵罐染菌： 個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備滲漏,第三節(jié) 雜菌污染的途徑和防止染菌

9、,種子帶菌及防治 空氣帶菌及防治 培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治 操作失誤和設(shè)備滲漏導(dǎo)致的染菌及防治 噬菌體污染及防治 染菌的挽救與處理,1、種子帶菌的防治,菌種在培養(yǎng)或保存過程中受污染（試管塞，查看的時(shí)候要注意） 培養(yǎng)基及用具滅菌要徹底，應(yīng)防止假壓 菌種在轉(zhuǎn)接過程中受污染：操作不當(dāng)，管理不嚴(yán)；（緩沖間）,2、無菌空氣帶菌及其防止： 流程設(shè)計(jì)，介質(zhì)滅菌,3、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治,原料性狀：淀粉質(zhì)原料，升溫過快或混合不均勻，易結(jié)塊，團(tuán)塊中包埋的活菌不易殺滅；可升溫前攪拌和加淀粉酶 實(shí)罐滅菌時(shí)未充分排除罐內(nèi)空氣：造成假壓，升溫時(shí)，應(yīng)打開排氣等閥門放氣。,連續(xù)滅菌時(shí)，蒸汽壓力波

10、動(dòng)大，培養(yǎng)基未達(dá)到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底 設(shè)備和管道存在“死角” 死角：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達(dá)或不能充分到達(dá)預(yù)定應(yīng)該到達(dá)的局部滅菌部位，從而不能達(dá)到徹底滅菌的要求。,常見的設(shè)備、管道“死角” 發(fā)酵罐的“死角”：不銹鋼襯里破裂造成死角，發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢。,4、設(shè)備滲漏引起的染菌及其防止,發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門長(zhǎng)期使用，由于腐蝕、摩擦和振動(dòng)等原因，造成滲漏 微小滲漏的檢查：加入堿性水，用浸濕酚酞 指示劑的白布擦，有滲漏則白布顯紅色。,5、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治,滅菌過程中嚴(yán)防泡沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫大量產(chǎn)生 傳感器探頭用化學(xué)試劑浸泡法滅

11、菌可能導(dǎo)致滅菌不徹底。,滅菌過程中嚴(yán)防泡沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫大量產(chǎn)生 傳感器探頭用化學(xué)試劑浸泡法滅菌可能導(dǎo)致滅菌不徹底。,6、噬菌體污染和防治,（1）噬菌體污染的預(yù)防 嚴(yán)格活菌體排放，切斷噬菌體的糧源 做好環(huán)境衛(wèi)生，消滅噬菌體與雜菌 嚴(yán)防噬菌體與雜菌進(jìn)入種子罐或發(fā)酵罐內(nèi) 抑制罐內(nèi)噬菌體的生長(zhǎng),（2）污染噬菌體后的處理方法 并罐法 轉(zhuǎn)換使用菌種或使用抗性菌株 放罐重消法 低溫重消重接種法 添加噬菌體抑制劑的方法,五、染菌的挽救與處理,種子培養(yǎng)期染菌的處理 滅菌、重新制種、倒種 發(fā)酵前期染菌的處理,發(fā)酵中后期染菌的處理 廢液應(yīng)加熱至120，保持30min才能放罐 染菌后對(duì)設(shè)備的處理 重新使用前