臨 床 細(xì) 菌 檢 驗(yàn) 常用的幾種試驗(yàn),常做的實(shí)驗(yàn)方法,革蘭氏染色法拉絲試驗(yàn)抗酸染色法氧化酶試驗(yàn)觸酶試驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn)奧普妥辛實(shí)驗(yàn)衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)CAMP桿菌肽敏感實(shí)驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)DNA酶試驗(yàn)生化反應(yīng)血清學(xué)分型(志賀,沙門，霍亂、鏈球菌),革 蘭 氏 染 色,快速染色法：1、初染：結(jié)晶紫染色10秒，水洗，甩干；2、媒染：革蘭氏碘液染色10秒，水洗，甩干；3、脫色：95%酒精脫色1020秒，水洗，甩干；4、復(fù)染：沙黃或復(fù)紅染色10秒，水洗，干后鏡檢。5、結(jié)果判定：G +呈紫色，G-菌呈紅色,G+菌 G-菌,氫氧化鉀拉絲試驗(yàn),“氫氧化鉀拉絲試驗(yàn)”快速鑒定革蘭氏陽性菌1、原理：由于革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖層數(shù)少于稀堿溶液內(nèi)易于破裂，而釋放出未斷裂的DNA螺旋，使KOH菌懸液呈現(xiàn)粘性，可有攪拌后拉出絲來，而革蘭陽性菌在稀堿溶液中仍保持不變。2、試劑：4%KOH水溶液。應(yīng)新鮮配制。3、方法：取1滴4%KOH水溶液于潔凈玻片上，用接種環(huán)于固體培養(yǎng)基上取新鮮配制菌落少許，于KOH溶液中攪拌混勻，并每隔幾秒鐘上提接種環(huán)，觀察能否拉出絲來。4、結(jié)果：能用接種環(huán)拉出絲來為陽性，仍為混懸液則為陰性。大多數(shù)革蘭陰性菌于5到10秒內(nèi)出現(xiàn)陽性，有的需30到45秒。革蘭陽性菌于60秒以后仍陰性。,抗 酸 染 色,1、初染：石炭酸復(fù)紅加熱染色3-5分鐘，水 洗，甩干；2、脫色：3%鹽酸酒精脫色3060秒，水 洗，甩干；3、復(fù)染：堿性美蘭60秒，水洗，干后鏡檢。4、結(jié)果判定：抗酸菌呈紅色 ，非抗酸菌呈蘭色5、意義：用于鑒別抗酸菌與非抗酸菌,抗酸染色-抗酸菌,氧化酶試驗(yàn),原理：具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。方法：取一潔凈的濾紙一小塊，涂抹菌苔少許，加一滴氧化酶試劑（對(duì)苯二胺溶液）于菌上，觀察顏色變化。判斷：立即呈粉紅色并迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色為陽性，不變色為陰性。意義：腸桿菌科細(xì)菌與氣單胞、假單胞菌的鑒別,觸酶試驗(yàn),1.原理：具有觸酶（過氧化氫酶）的細(xì)菌，能催化過氧化氫，放出新生態(tài)氧，繼而形成分子氧，出現(xiàn)氣泡。2.方法：用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上的菌落置于潔凈的玻片上，然后滴加3%過氧化氫溶液一滴，觀察結(jié)果。3.結(jié)果判斷：在5秒內(nèi)釋放大量的氣泡為陽性。4.意義：大多數(shù)球菌觸酶試驗(yàn)陽性，但鏈球菌為陰性，主要用于鑒別葡萄球菌與鏈球菌。,血漿凝固酶試驗(yàn),1.原理：金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶。一種是結(jié)合凝固酶，結(jié)合在細(xì)胞壁上，使血漿中纖維蛋白原變成纖維蛋白附著于細(xì)菌表面上，發(fā)生凝集，用玻片法測出。另一種是菌體生成后釋放與培養(yǎng)基中的游離凝固酶，能使凝固酶原變成凝血酶類物質(zhì)，從而使血漿凝固，可用試管法測出。2.方法： （1）玻片法：取血漿和生理鹽水各一滴分別滴到清潔玻片上，挑去待檢菌落分別與血漿及鹽水混合，如血漿中出現(xiàn)明顯凝集顆粒而鹽水中無自凝現(xiàn)象者為陽性。 （2）試管法：取試管兩支，分別加入0.5ml的血漿（經(jīng)生理鹽水1：4稀釋）挑去菌落數(shù)個(gè)加入測定管充分研磨混勻，用一只陽性菌株加入對(duì)照管，373-4小時(shí)。血漿凝固者為陽性。,奧普妥辛實(shí)驗(yàn)（OP試驗(yàn)）,1.原理：肺炎鏈球菌對(duì)Optochin（乙基氫化去甲奎寧）十分敏感，作用機(jī)理是干擾肺炎鏈球菌葉酸的合成，可抑制其生長，其他鏈球菌如草綠色鏈球菌對(duì)其不敏感。借此可對(duì)肺炎鏈球菌與草綠色鏈球菌加以鑒別。2.方法：將待檢的a溶血的鏈球菌均勻的涂布于血平板上，貼放Optochin紙片（含藥5mg)35孵育18-24小時(shí)，觀察抑菌圈的大小。3.結(jié)果判斷：抑菌圈14mm為肺炎鏈球菌，無或見很窄的抑菌圈為草綠色鏈球菌。,衛(wèi)星試驗(yàn),1.原理：流感嗜血桿菌生長時(shí)需要X、V兩種因子，在血平板上形成極小、圓形透明的菌落，若與金葡菌同時(shí)培養(yǎng)，由于金葡菌產(chǎn)生V因子，促進(jìn)流感嗜血桿菌的生長，在金葡菌周圍的細(xì)菌菌落較大，形成衛(wèi)星生長現(xiàn)象。在普通培養(yǎng)基上不生長。2.方法：用取菌環(huán)挑去可疑菌落分別接種在血平板、MH平板上，再用取菌針挑取金葡菌與原劃線垂直劃一直線接種在平板上。3524小時(shí)觀察結(jié)果。3.結(jié)果判斷：金葡菌周圍的細(xì)菌菌落較大，衛(wèi)星試驗(yàn)陽性4.意義：僅血平板上出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象-流感嗜血桿菌； 血平板與MH均呈衛(wèi)星現(xiàn)象-副流感嗜血桿菌。借此用于鑒別流感與副流感嗜血桿菌。,CAMP試驗(yàn),1.原理：B群鏈球菌在血平板上能產(chǎn)生CAMP因子，可促使金黃色葡萄球菌 溶血素的活性，故在血平板上兩種細(xì)菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明狀溶血區(qū)。其他鏈球菌一般不產(chǎn)生CAMP因子，故此試驗(yàn)可作為B群鏈球菌的鑒定指標(biāo)之一。2.方法：在血平板上，用金黃色葡萄球菌劃一條橫線，再于該直線相距5mm左右用被檢菌接種一或兩條垂直短線，3524小時(shí)觀察結(jié)果。3.結(jié)果觀察：在被檢菌接種線與金葡菌接種線之間有一個(gè)箭頭形或半月形透明溶血區(qū)為陽性，可推斷為B群鏈球菌。無溶血區(qū)為陰性。,桿菌肽敏感試驗(yàn),1.原理：A群鏈球菌對(duì)桿菌肽非常敏感，而其他鏈球菌對(duì)桿菌肽通常耐藥，故此試驗(yàn)可鑒別鏈球菌。2.方法：將被檢鏈球菌，密涂于血平板上，將桿菌肽紙片貼于血平板表面，3524小時(shí)觀察結(jié)果。3.在桿菌肽周圍出現(xiàn)明顯抑菌環(huán) 10mm為陽性，則被推斷為A群鏈球菌,10mm 為陰性，為其他群的鏈球菌。,硝酸鹽還原試驗(yàn),1.原理：某些細(xì)菌能還原培養(yǎng)基中的硝酸鹽生成亞硝酸鹽、氨和氮等。亞硝酸鹽與醋酸作用生成亞硝酸，亞硝酸再與對(duì)氨基苯磺酸作用形成重氮苯磺酸，它可與a-萘胺結(jié)合成紅色的N-a-奈氨苯磺酸。2.方法：將待檢菌接種硝酸鹽培養(yǎng)基中，3524小時(shí)，加入硝酸鹽還原試劑甲液（對(duì)氨基苯磺酸和醋酸）和乙液（ a-萘胺和醋酸）各一滴后觀察結(jié)果。3.判斷結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性。若不出現(xiàn)紅色，則加入少許鋅粉，仍不出現(xiàn)紅色者為陽性，出現(xiàn)紅色為陰性。4.意義：腸桿菌科細(xì)菌，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性,DNA 酶試驗(yàn),1.原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生DNA 酶。 DNA 酶能將DNA 長鏈水解成有幾個(gè)單核苷酸組成的寡核苷酸鏈。水解形成的寡核苷酸可溶于酸，在DNA平板上加入酸后，可在菌落周圍形成