結(jié)核分支桿菌特異性抗原重組蛋白MPT63檢測系統(tǒng)的建立程國平李克生張潤玲【摘要】目的建立規(guī)范的結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis,MTB)特異性抗原重組蛋白MPT63酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測系統(tǒng)。方法采用方陣法確定蛋白包被濃度和酶標(biāo)二抗?jié)舛?，以ROC（ReceiverOperatingCharacteristic）曲線法確定MPT63蛋白ELISA法檢測的cut-off值。探討規(guī)范的ELISA檢測系統(tǒng)建立的方法。結(jié)果ELISA檢測系統(tǒng)MPT63蛋白包被濃度1128000，酶濃度11000時(shí)為最佳；在cut-off值為0.35-0.4時(shí)檢測MPT63蛋白抗體的靈敏度和特異性最為理想，分別是75%和78.6%。結(jié)論用方陣法確定蛋白包被濃度和酶標(biāo)二抗?jié)舛?，并以ROC曲線法確立cut-off值是建立規(guī)范化的ELISA檢測系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。關(guān)鍵詞重組蛋白MPT63；ELISA；ROC曲線；cut-off值EstablishmentdetectionsystemofrecombinationproteinMPT63onmycobacteriumtuberculosisspecificantigenCHENGGuo-ping,DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology,Henan471000,ChinaLIKe-shengMedicalScienceResearchInstituteofGansuprovinceBiotechnologyCenter，ZhangRun-lingTheoriginalDepartmentofClinicalLaboratory,TheSecondAffiliatedHospitalofLanzhouUniversityLaboratory【Abstract】ObjectiveTosetupastandardtestingsystemofmycobacteriumtuberculosisspecificantigen-recombinatedMPT63proteinbyenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod.MethodsThesquarematrixmethodisusedtodeterminetheconcentrationofcoatedproteinandtheconcentrationofenzymelabelingantibody.ReceiverOperatingCharacteristicmethodisusedtodeterminethecut-offvalueofELISAdetectedMPT63protein.ToapproachaestablishmentofstandardELISAdetectionsystem.ResultsELISAdetectedMPT63proteinmayattainhighersensibilityandspecificitywhenthecoatedproteinisdilutedaccordingto1128000andtheenzymelabelingantibodyisdilutedby11000.ConclusionsThecriticalelementsinELISAdetectionsystemaretheapplicationofsquarematrixmethodtodeterminetheconcentrationofcoatedproteinandtheconcentrationofenzymelabelingantibodyandapplicationtheROCtodeterminecut-off.KeywordsRecombinationproteinMPT63；ELISA；ROC；Cut-off；結(jié)核?。═B）已成為我國乃至世界危害最嚴(yán)重的疾病之一1，2000年第四次1作者單位：471000河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（程國平）；甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院生物技術(shù)中心（李克生）；原蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（張潤玲）全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn),我國感染人數(shù)5.5億，活動性肺結(jié)核人數(shù)600萬，死亡人數(shù)25萬。但是目前對結(jié)核病早期快速準(zhǔn)確的診斷是臨床工作的難點(diǎn),制約結(jié)核病的治療和感染的控制。尋找一種快速、準(zhǔn)確和實(shí)用的結(jié)核病感染的診斷方法乃是當(dāng)務(wù)之急。隨著致病性結(jié)核桿菌全基因組的測序工作完成2，應(yīng)用雙向電泳、質(zhì)譜及生物信息學(xué)技術(shù)開展的結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究，多種結(jié)核分支桿菌特異性蛋白抗原不斷被發(fā)現(xiàn)3，為結(jié)核病血清學(xué)檢測奠定了基礎(chǔ)。血清學(xué)檢測中，ELISA以其靈敏,簡單，快速和廉價(jià)等特點(diǎn)在臨床檢驗(yàn)方面被廣泛應(yīng)用。本文以結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白MPT63為抗原，探討建立規(guī)范的檢測其抗體的ELISA檢測系統(tǒng)。1材料與方法1.1標(biāo)本來源本實(shí)驗(yàn)陽性和陰性對照血清由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；另外，收集2008年1月至2010年5月甘肅省肺科醫(yī)院按照結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)4確診為肺結(jié)核的患者血清，男性50例，年齡15-72歲；女性48例，年齡16-68歲；健康對照為健康體檢者98例：男性53例，年齡20-68歲；女性45例，年齡18-65歲。采集空腹靜脈血液3mL,立即分離血清儲存于-70備用。1.2試劑MTB特異性抗原重組MPT63蛋白由中國藥品生物制品鑒定所惠贈；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG購自北京中山生物公司；蛋白Marker為普利萊公司產(chǎn)品。1.3儀器酶標(biāo)儀（芬蘭產(chǎn)Thermolabsystems的MultiskanMK3）；洗板機(jī)（芬蘭產(chǎn)Thermolabsystems的MultiskanMK3）；蛋白測量儀；瓊脂糖凝膠電泳儀（法國西比亞）。2方法2.1MPT63蛋白的測定。蛋白測量儀測得MTB特異性抗原重組蛋白MPT63在260nm和280nm波長的OD值,依據(jù)公式:蛋白含量=OD2801.45+OD2600.74(mg/ml)計(jì)算出蛋白含量。瓊脂糖凝膠電泳觀察MPT63蛋白的純度并檢測其分子量。2.2用方陣的方法選擇ELISA檢測系統(tǒng)的抗原包被濃度和酶標(biāo)濃度。包被液（PH9.6）稀釋MPT63蛋白分別為：12000；4000；8000；16000；32000；64000；128000；256000八個(gè)濃度梯度，包被聚苯乙烯微孔板，置于4冰箱過夜；用含2.5%胎牛血清白蛋白和2.5%酪蛋白封閉液封閉微孔板，37孵育2h，干燥過夜，裝鋁箔袋，封口備用；用樣本稀釋液按120比例稀釋混合陽性血清和混合陰性血清,加入包被好的微孔板，37孵育0.5h；洗板機(jī)洗6次，將羊抗人IgG標(biāo)記的辣根過氧化物酶稀釋成1500；750；1000；1500；2000；3000六個(gè)濃度梯度即如微孔板，37孵育0.5h；洗板機(jī)洗6次。加入鄰苯二胺酶的底物溶液孵育,2MOL/lH2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀波長450nm處測OD值。以靈敏度為縱坐標(biāo)；假陽性率(1-特異性)為橫坐標(biāo)繪制各個(gè)抗原包被濃度和各個(gè)酶濃度下的ROC曲線，比較獲得最佳的抗原包被濃度和酶濃度。2.3以ROC曲線確定ELISA檢測系統(tǒng)的cut-off值。以上述選擇的最佳抗原包被濃度包被微孔板和最佳的酶標(biāo)濃度檢測98份陽性血清標(biāo)本和98份血清陰性標(biāo)本的吸光度（OD），以ROC曲線描述此檢驗(yàn)方法的靈敏度與假陽性率之間的關(guān)系。曲線下面積最大時(shí)的靈敏度與特異性的點(diǎn)對應(yīng)的OD值就是該抗原檢測的cut-off值，待測標(biāo)本OD該cut-off值為陽性,待測標(biāo)本OD該cut-off值為陰性。3結(jié)果3.1重組MPT63蛋白濃度為：4.172mg/ml,分子量16000。3.2不同包被抗原濃度與酶濃度下，檢測的OD值見表1。比較不同包被抗原濃度的ROC曲線得出：MPT63蛋白在包被濃度1128000時(shí)可使測定得到好的靈敏度和特異性5，見圖1。比較不同酶濃度的ROC曲線得出：酶濃度11000時(shí)可使測定得到好的靈敏度和特異性5，見圖2。表1不同包被抗原濃度與酶濃度的檢測OD值酶濃度包被抗原濃度120001400018000116000132000164000112800012560001：500+-0.110.150.330.160.230.250.180.120.270.190.390.280.560.390.70.711750+-0.370.240.190.130.180.290.150.180.210.140.330.180.420.240.470.3411000+-0.540.340.70.290.730.350.540.280.570.330.520.360.58*0.150.640.2311500+-0.30.190.270.140.310.150.320.150.460.300.340.170.740.300.660.5712000+-0.270.190.220.130.190.10.450.10.130.130.290.200.320.300.720.5513000+-0.120.130.130.420.130.040.150.020.250.140.140.080.250.20.350.39注：*為重組MPT63蛋白ELISA檢測系統(tǒng)的最佳抗原包被濃度和酶濃度所對應(yīng)cut-off值。圖1抗原包被濃度1128000反應(yīng)曲線圖二酶濃度11000反應(yīng)曲線3.3根據(jù)假設(shè)的不同cut-off值區(qū)間，計(jì)算各區(qū)間的靈敏度和特異性，見表2，所對應(yīng)的ROC曲線見圖3。由圖3可看出ELISA檢測MPT63蛋白，在靈敏度75%和特異性78.6%時(shí)的點(diǎn)曲線下面積最大，此點(diǎn)所對應(yīng)的cut-off值為0.35-0.4。表2不同cut-off值檢測的靈敏度和特異性O(shè)D界值特異性靈敏度OD界值特異性靈敏度0-0.0501000.7-0.7510019.120.05-0.117.861000.75-0.810014.760.1-0.1532.1497.060.8-0.8510014.710.15-0.25094.120.85-0.910013.240.2-0.2564.2989.710.9-0.9510011.770.25-0.371.4382.350.95-110010.290.3-0.357577.941-1.051007.350.35-0.478.57751.05-1.11007.350.4-0.4582.1463.241.1-1.151004.410.45-0.589.2951.471.15-1.21002.940.5-0.5592.8642.651.2-1.251002.940.55-0.692.8632.351.25-1.31001.470.6-0.6596.4330.881.3-1.351001.470.65-0.710020.591.35-1.41001.47圖3抗原包被濃度1128000與酶濃度11000時(shí)反應(yīng)曲線cut-off值為靈敏度75%、特異性78.6%的點(diǎn)所對應(yīng)的OD值即0.35-0.44討論：4.1在ELISA抗原固相化過程中，蛋白抗原通過疏水性相互作用吸附于聚苯乙烯等固相表面，這種非共價(jià)被動吸附過程中,由于蛋白吸附于固相的隨意性，吸附于固相表面的蛋白結(jié)構(gòu)可能由于折疊、功能行結(jié)合部位朝向固相等而發(fā)生嚴(yán)重的改變。此外，在固相的不同位點(diǎn)它們與固相的結(jié)合程度也有差異，結(jié)合疏松的容易發(fā)生脫吸附（測定中68%被動吸附的抗原或抗體可能會發(fā)生脫吸附）。脫吸附的抗原或抗體會成為免疫反應(yīng)中的競爭物，從而導(dǎo)致免疫測定的精密度降低5。以最適濃度固相化抗原或抗體是減少這種影響的簡單、有效措施，而以最適濃度固相化抗原，正是本試驗(yàn)的核心環(huán)節(jié)之一。4.2在抗原或抗體的被動吸附包被過程中，不管加入的抗原或抗體的量多大，聚苯乙烯塑料表面吸附的最大限度為1.5ng/mm2，占整個(gè)固相表面的1/3，處于次限度的抗原或抗體蛋白分子均勻分布。一旦包被用抗原或抗體蛋白過量，由于蛋白-蛋白的相互作用疊集而致固相上多層蛋白的形成，則會出現(xiàn)大于固相最大結(jié)合限度的吸附，這種因蛋白間的相互作用而形成的次級吸附很不穩(wěn)定，從而干擾免疫測定5。因此本試驗(yàn)采用八個(gè)包被抗原濃度梯度，比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗原包被濃度在1128000時(shí)，其實(shí)際包被抗原的含量為3.2g/ml,較其他七個(gè)包被濃度靈敏度和特異性相對高。這與文獻(xiàn)5報(bào)道的：用于包被抗原或抗體的理想濃度通常在110g/ml之間也相吻合。以六個(gè)酶濃度梯度調(diào)試，得出了相對最為合適的MPT63蛋白ELISA檢測的酶濃度。此MPT63蛋白ELISA檢測系統(tǒng)科學(xué)的的保證了抗原以適當(dāng)?shù)臐舛劝挥诠滔噍d體；參與反應(yīng)的酶適量。因此，最大限度避免了常見的包被抗原蛋白疊集和所用酶不適量的情況。4.3目前國內(nèi)以ELISA為研究方法的大多采用測定標(biāo)本對陰性比值法(testtonegativeratio,TNR)：假定在每批測定中包含大量的陰性控制樣本,于是每份測定標(biāo)本均可以與陰性控制樣本值的中值的比值來表示,設(shè)標(biāo)本的測定值為Y,陰性對照值的中值為M,一般將Y/M2或3定為陽性，cut-off值計(jì)算公式為2或3（陰性對照值的中值），這種設(shè)定方法對避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)較好，但假陰性可能比例較高，該方法是一種粗糙的cut-off值設(shè)定方法5。4.4結(jié)核分枝桿菌特異性抗原MPT63蛋白是結(jié)核分枝桿菌的重要抗原之一，以ROC曲線法建立MPT63蛋白系統(tǒng)，為結(jié)核分枝桿菌其他抗原建立規(guī)范的ELISA檢測提供了理論依據(jù)和嘗試。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原蛋白，聯(lián)合多種抗原進(jìn)行檢測，在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于提高診斷的敏感性。如果均能采取這種規(guī)范的方法，建立起各個(gè)