體外受精失敗的原因及對策劉平，鄭曉英作者單位:北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，北京100191摘要:在接受體外受精胚胎移植治療的患者中，有時會出現(xiàn)全部獲取的卵母細胞均未受精現(xiàn)象，即受精失敗。其原因可能為精子與透明帶結(jié)合失敗和(或)精子穿透異常、卵母細胞激活失敗等。目前尚缺乏準確的預(yù)測受精失敗的方法，臨床上一旦出現(xiàn)受精失敗應(yīng)采取積極的補救措施，并根據(jù)患者病史、臨床特征、配子情況對患者以后的治療措施提出建議。早補救ICSI的有效性和安全性尚需進一步的臨床驗證。關(guān)鍵詞:受精；完全受精失敗；補救卵母細胞漿內(nèi)單精子注射；卵母細胞激活A(yù)bstract:Totalfertilizationfailures(TFF)arerareeventsofinvitrofertilization(IVF).Mostcasesoc-curduetolackordysfunctionofspermbindingto/penetratethezonapellucidaorfailureofoocyteacti-vation.Fertilizationfailureisnotpredictablebecauseoflackingaccuratelyandsensitivemethod.Theclin-icalvalueofrescueICSIshouldbefullyconsiderableaccordingtopatienthistory，clinicalcharacterandgametesquality.Longtermevaluationofbabiesre-sultingfromtheapplicationofearlyrescueICSIisneededtoconfirmempiricallythesafetyofthismeth-od.Keywords:fertilization；totalfertilizationfailure；res-cueICSI；oocyteactivation完全受精失敗(totalfertilizationfailures，TFF)指在體外受精包括常規(guī)體外受精(invitrofertilization，IVF)和卵母細胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmicsperminjecting，ICSI)的顯微受精后的一定時段內(nèi)，精卵沒能結(jié)合為合子，形態(tài)學(xué)上沒有看到精原核和卵原核形成的現(xiàn)象。多年來的ICSI應(yīng)用證實:雖然ICSI技術(shù)繞開了精子穿越透明帶、精卵質(zhì)膜融合等過程，將精子直接注入卵母細胞內(nèi)，仍有20%30%的卵母細胞不能正常受精。在IVF助孕治療中，個別患者會出現(xiàn)全部卵母細胞不受精的受精失敗，這種現(xiàn)象在常規(guī)IVF周期的發(fā)生率約為5%10%1，ICSI周期的發(fā)生率為1%3%2。受精失敗不僅與精子和卵的質(zhì)量、受精過程體外環(huán)境等因素有關(guān)，也可能是某些不明原因性不孕癥夫婦長期不能自然受孕的病因所在。當(dāng)一次取卵獲得的多個卵母細胞中有少部分未受精時，被認為是可接受的，但當(dāng)全部卵母細胞受精失敗時，整個治療過程不得不中斷，不僅使醫(yī)生和胚胎學(xué)家感到沮喪，對接受助孕治療的夫婦更是巨大的精神打擊。如何預(yù)防和避免受精失敗成為改善某些患者IVF結(jié)局的重要環(huán)節(jié)。1受精失敗原因分析受精失敗的原因大致可分為下列3種情況。1.1精子穿透失敗對IVF常規(guī)受精周期的未受精卵進行免疫熒光染色分析，發(fā)現(xiàn)56%92%的未受精卵母細胞中可見到清晰的卵母細胞的染色體，但是找不到精子的染色質(zhì)，提示精子透明帶(zonapellucida，ZP)結(jié)合和穿透異常是IVF受精失敗的常見原因1。精子與ZP的作用相當(dāng)復(fù)雜，通過精子表面的卵結(jié)合蛋白與ZP上的精子受體相互識別。如果先天或后天的卵結(jié)合蛋白、ZP糖蛋白異常都會影響精卵正常結(jié)合，致使受精失敗。Mannikko等3報道人ZP基因序列存在著多個單核苷酸多態(tài)(SNP)，其中ZP3SNP位點不同的基因型與IVF受精失敗相關(guān)。常規(guī)精液分析無法檢測精子透明帶結(jié)合或頂體反應(yīng)的異常，必須通過特殊檢查如精子透明帶結(jié)合/穿透實驗才能發(fā)現(xiàn)。但這類實驗操作繁瑣，材料來源困難，因此尚難以在臨床上大規(guī)模應(yīng)用。1.2卵母細胞激活失敗當(dāng)精子進入卵母細胞后，卵胞質(zhì)中的精核去凝集因子清除精子染色質(zhì)中精蛋白二硫鍵，使精蛋白被組蛋白替代，染色質(zhì)去致密，與此同時精子頭部腫脹，釋放卵母細胞活化因子，誘導(dǎo)鈣震蕩并刺激IP3的產(chǎn)生，激活卵母細胞，誘發(fā)一系列復(fù)雜的生理過程包括釋放皮質(zhì)顆粒、恢復(fù)減數(shù)分裂、排出第二極體等，完成第二次減數(shù)分裂。卵母細胞激活失敗是ICSI后受精失敗的常見原因，通過熒光染色在卵母細胞內(nèi)可以見到不同去凝集狀態(tài)的精子染色質(zhì)，證實精子已經(jīng)進入卵母細胞，但由于各種原因不能誘發(fā)鈣震蕩或震蕩頻率異常等不能激活卵母細胞，包括:(1)卵母細胞胞質(zhì)不成熟致活化異常；雖然卵母細胞已經(jīng)排出第一極體達到了核成熟，但是胞核和胞質(zhì)成熟不同步，不能完成第二次減數(shù)分裂。胞質(zhì)內(nèi)含有的凝集因子(如MPF)使精子出現(xiàn)早熟染色體凝集(prematurechromosomalcondensation，PCC)，不能轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌栽耍?2)精子異常:近年來的實驗證實:精子的赤道板區(qū)含有一種特殊的磷脂酶PLCzeta，將其直接注入卵母細胞可以誘發(fā)與受精過程相類似的鈣震蕩4；缺乏PLCzeta的精子則不能誘發(fā)鈣震蕩，從而導(dǎo)致受精失敗5。但PLCzeta是不是引起鈣震蕩的唯一物質(zhì)還待證實。1.3原核形成和(或)遷移缺陷核膜重建是原核形成的關(guān)鍵事件，受到卵胞質(zhì)中多種磷酸酶和蛋白激酶的共同調(diào)節(jié)。卵母細胞胞質(zhì)不成熟將影響原核的形成6。雌雄原核形成后雌原核沿精子星狀體微管向雄原核移動，直到兩者相遇然后共同向卵母細胞中央遷移。圍繞雄性中心粒聚集的微管功能缺失時，可能出現(xiàn)原核遷移缺陷。2受精失敗的挽救在常規(guī)IVF受精完全失敗之后，是否應(yīng)該行補救ICSI(rescueICSI)使精卵有另一次機會結(jié)合完成受精，一直頗有爭議。補救ICSI確實可使部分卵母細胞獲得受精并形成胚胎，得到胚胎移植的機會，而且有獲得健康后代的可能7，但補救ICSI后的著床率和妊娠率均明顯降低8。我院總結(jié)了75個補救ICSI周期，雖然70周期獲得了可移植的胚胎，新鮮胚胎移植后僅有4例(5.71%)獲活嬰分娩9。一些文獻報道的補救ICSI周期中甚至無一例妊娠。補救ICSI的妊娠率較低的原因有:(1)補救ICSI時機多在IVF受精后1524h，卵母細胞老化錯過了最佳受精時機，影響胚胎的發(fā)育潛力；(2)受精后1524h相當(dāng)于取卵后1828h行補救ICSI受精，致使胚胎的發(fā)育與子宮內(nèi)膜的發(fā)育不同步，取卵后D3移植的往往是24細胞期胚胎。我們近期的臨床資料顯示將補救ICSI胚胎凍存，復(fù)蘇周期根據(jù)胚齡計算移植時機，可以獲得優(yōu)于新鮮周期移植的臨床妊娠率。我們認為補救ICSI的治療方案是否有臨床應(yīng)用價值應(yīng)結(jié)合患者病史、卵母細胞數(shù)量和成熟度、精子情況綜合分析。如果是由于取卵日卵母細胞成熟不佳引起的受精失敗，經(jīng)過一天的培養(yǎng)后卵母細胞成熟，在此基礎(chǔ)上盡早行補救ICSI，極有可能獲得妊娠和分娩；或者由于精子功能異常引起受精失敗，補救性的ICSI能夠幫助跨越精卵結(jié)合屏障，也是有意義的；對卵母細胞較少、精子和(或)卵母細胞無明顯異常的常規(guī)受精失敗周期來說，補救ICSI的作用有限。由于卵母細胞老化是影響補救ICSI臨床結(jié)局的關(guān)鍵因素，Chen等11提出應(yīng)該在常規(guī)IVF后盡早判斷卵母細胞受精與否，在卵母細胞老化前及時進行補救ICSI。在精卵混合培養(yǎng)后6h，機械剝除卵丘和放射冠等卵周圍的結(jié)構(gòu)，觀察以第二極體排出作為標(biāo)志的受精早期跡象，如果所有卵母細胞均未出現(xiàn)第二極體則擬判為全部受精失敗，立即行補救ICSI，獲得了48.5%的臨床妊娠率，明顯優(yōu)于受精后22h行補救ICSI組。隨后國內(nèi)同仁的工作也提示早補救ICSI可以得到較滿意的臨床結(jié)局12。但是，早補救ICSI方法也同樣引起了人們的擔(dān)憂和質(zhì)疑。常規(guī)受精后6h是卵母細胞激活、原核形成的關(guān)鍵時期，此時進行觀察是否會干擾胚胎的正常發(fā)育過程?如何鑒別第二極體與碎裂的第一極體?早補救ICSI會不會導(dǎo)致多精受精率的增加?理論上所有受精卵均應(yīng)在受精8h內(nèi)排出第二極體，在受精后6h觀察，可能會有10%左右的卵母細胞由于第二極體排出延遲而被誤認為未受精。因此Chen等11提出將觀察時間由受精后6h改為8h將大大降低判斷錯誤的風(fēng)險。為了避免碎裂極體對受精觀察的混淆，有研究仍以觀察原核的方法來推測受精，觀察發(fā)現(xiàn)在與精子接觸46h之間即可有個別卵開始出現(xiàn)原核，精卵混合培養(yǎng)8h，受精正常的病例至少會有一個卵出現(xiàn)原核13。否則，應(yīng)警惕受精失敗或受精率低的可能，結(jié)合第二極體出現(xiàn)情況，采取早期補救ICSI。但是8h可能錯過最佳受精窗口期，雖然可以獲得較好的受精率，妊娠率卻顯著降低14。盡管早補救ICSI的臨床結(jié)局優(yōu)于傳統(tǒng)的補救ICSI，但早補救ICSI與IVF正常受精周期的臨床結(jié)局是否接近報道不一致。Nagy等15在早補救ICSI周期中繼續(xù)發(fā)育到妊娠中期的胚胎僅為移植胚胎數(shù)目的8%，認為早補救ICSI技術(shù)的臨床結(jié)局差。早補救ICSI臨床應(yīng)用價值和安全性有待進一步驗證，目前已出生嬰兒的情況與常規(guī)IVF周期比較沒有差別16。3對既往受精失敗史患者的治療對于既往IVF助孕治療時曾發(fā)生過常規(guī)受精失敗的病例，文獻報道再次發(fā)生受精失敗的風(fēng)險可達30%50%17，應(yīng)結(jié)合患者年齡、不孕癥病史、控制性超排卵方案、卵母細胞形態(tài)、數(shù)量與成熟度、以及精子功能檢測綜合分析受精失敗原因。如果是精子穿透異常未能進入卵母細胞所引起，下一周期采取ICSI受精方式可以有效提高受精率和臨床妊娠率。卵母細胞質(zhì)量或成熟欠佳引起的受精失敗，采用ICSI并不能改善臨床結(jié)局，臨床卵巢刺激方案的調(diào)整可能起到一些作用。在無法區(qū)別卵母細胞因素或精子因素導(dǎo)致的受精失敗的情況下，可與患者充分溝通，建議選擇部分卵母細胞ICSI減少再次受精失敗風(fēng)險17。有文獻認為因既往有受精失敗史而行ICSI患者的臨床結(jié)局顯著低于因男性因素不孕而行ICSI者，提示這類患者可能存在卵母細胞的某些功能缺陷，ICSI不能改變其受精失敗的命運18；但也有不同觀點，Kinzer等19總結(jié)了281例既往受精失敗史患者繼續(xù)治療后的臨床結(jié)局，每移植周期的妊娠率達到25%，與同期因男性因素不孕第二次行ICSI治療的臨床結(jié)局(24%)相同，說明不同刺激周期卵母細胞質(zhì)量的變化是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。ICSI后受精失敗的真正原因目前尚不清楚。事實上，對成熟的卵母細胞ICSI后仍有大約有30%不能受精20。因為ICSI僅能在幫助精子進入卵母細胞這個環(huán)節(jié)上起作用，而精子必須在穿透卵母細胞后完成卵子激活，第二極體排出，精子DNA去緊密化和精卵原核形成等一系列的細胞和分子水平的變化，才能完成受精過程，ICSI后的受精過程是在卵母細胞主導(dǎo)下完成的。對于曾經(jīng)在某次IVF治療中發(fā)生TFF患者，如果能獲得一定數(shù)量、形態(tài)正常的卵母細胞和精子，可以建議患者再次治療時直接采用ICSI，85%的患者出現(xiàn)正常受精，1/3的患者可以獲得妊娠21-22。如反復(fù)ICSI受精失敗，可能與卵母細胞未激活有關(guān)，可試用各種輔助方法激活卵母細胞，包括ICSI后用鈣離子載體，用含高濃度鈣離子的培養(yǎng)基、用電刺激輔助激活卵母細胞等，可提高受精率，目前已有個別成功分娩的病例報道23-24。但是該技術(shù)在有效性和對子代安全性方面尚不明確，應(yīng)慎重應(yīng)用。在目前尚無準確預(yù)測受精失敗的手段的情況下，應(yīng)加強對受精過程的基礎(chǔ)和臨床研究，在實際工作中，一旦出現(xiàn)受精失敗，應(yīng)采取積極措施應(yīng)對，包括盡早利用補救ICSI對本次治療結(jié)局的挽救，以及通過對患者的病史、臨床特征、配子質(zhì)量和數(shù)量綜合評價，對該患者今后的治療提出積極建議。事實證明，有過受精失敗史的夫婦再次助孕治療依然有機會得到自己的后代。參考文獻1MahutteNG，AriciA.Failedfertilization:isitpredictable?J.CurrOpinObstetGynecol，2003，15:211-218.2FlahertySP，PayneD，MatthewsCD.FertilizationfailuresandabnormalfertilizationafterintracytoplasmicsperminjectionJ.HumReprod，1998，13:155-164.3MannikkoM，TormalaRM，TuuriT，etal.AssociationbetweensequencevariationsingenesencodinghumanzonapellucidaglycoproteinsandfertilizationfailureinIVFJ.HumReprod，2005，20(6):1578-1585.4SaundersCM.PLCf:asperm-specifictriggerofCa(2+)oscillationsineggsandembryodevelopmentJ.Development，2002，129，3533-3544.5YoonSY，JelleretteT，SalicioniAMJ，etal.HumanspermdevoidofPLC，zeta1failtoinduceCa(2+)releaseandareunabletoinitiatethefirststepofembryodevelopmentJ.JClinInvest，2008，118，3671-3681.6SwainJE，PoolTB.ARTfailure:oocytecontributionstounsuccessfulfertilizationJ.HumanReproductionUpdate，2008，14:431-446.7LombardiE，TiveronM，InzaR，etal.Livebirthandnormal12yearfollowupofababybornaftertransferofcryopreservedembryosfromrescueintracytoplasmicsperminjectionof12day2oldoocytesJ.FertilSteril，2003，80(3):646-648.8KuczynskiW，DhontM，GrygorukC，etal.RescueICSIofunfertilizedoocytesafterIVFJ.HumReprod，2002，17(9):2423-22427.9李明，宋瑋，劉平，等.75例常規(guī)IVF失敗后補救ICSI臨床結(jié)局分析J.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2008，16(6):112.10李曉虹，于叢一，麥美琪.常規(guī)IVF不受精周期行補救卵母細胞單精子注射J.中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2007，28(2):188-191.11ChenC，KatteraS.RescueICSIofoocytesthatfailedtoextrudethesecondpolarbody6hpost-inseminationinconventionalIVFJ.HumReprod，2003，18:2118-2121.12張寧媛，孫海翔，胡婭莉.短時受精聯(lián)合早期補救性卵細胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射在完全受精失敗周期的臨床應(yīng)用J.中華男科學(xué)雜志，2009，15(6):538-541.13紀冬梅，張愛軍，孫貽娟，等.短時體外受精后原核形成觀察的相關(guān)研究J.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2009，17(12):93-95.14嚴正杰，蔡令波，馮婷，等.對體外受精失敗后不同授精時間進行補救ICSI的結(jié)局比較J.生殖與避孕，2009，29:329-332.15NagyZP，RienziLF，UbaldiFM，etal.EffectofreducedoocyteagingontheoutcomeofrescueintracytoplasmicsperminjectionJ.FertilSteril，2006，85:901-906.16孫海翔.早期補救ICSI的安全性和應(yīng)用價值J.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2009，18:195-197.17vanderWesterlakenL，HelmerhorstF，DiebenS.IntracytoplasmicsperminjectionasatreatmentforunexplainedtotalfertilizationfailureorlowfertilizationafterconventionalinvitrofertilizationJ.FertilSteril，2005，83(3):612-617.18TomasC，Orava1M，TuomivaaraL，etal.Lowpregnancyrateisachievedinpatientstreatedwithintracytoplasmicsperminjec-tioJ.HumReprod，1998，13(1):65-70.19KinzerDR，BarrettCB，PowersRD.Prognosisforclinicalpregnancyanddeliveryaftertotalfertilizationfailureduringconven