丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)技術(shù)國(guó)內(nèi)外臨床研究應(yīng)用情況（綜述）張賀秋丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）感染引起的一種重要的世界性傳染病。一般地，1520%左右的HCV感染者為自限性感染，可以很快的康復(fù)。但是，也有8085%的感染者發(fā)展為慢性丙型肝炎，其中又有20%的可發(fā)展為肝纖維化，最終有45%的肝纖維化患者發(fā)生肝細(xì)胞性肝癌，危害十分嚴(yán)重。目前，慢性丙型肝炎除了干擾素有確切的療效外，尚無(wú)其它有效的治療藥物。國(guó)際上近來(lái)報(bào)道，PEG修飾的干擾素加利巴韋林聯(lián)合治療可在4050%左右的患者獲得較好的反應(yīng)，但也有療程長(zhǎng)、價(jià)格昂貴、毒副作用大以及易反彈等缺點(diǎn)。此外，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV高度變異而困難重重，短期內(nèi)難有突破性進(jìn)展。因此，盡早檢出HCV感染者，阻斷HCV的傳播是當(dāng)務(wù)之急。1HCV檢測(cè)技術(shù)的現(xiàn)狀HCV一般通過(guò)被HCV污染的血液和血液制品傳播，現(xiàn)在常用的HCV檢測(cè)技術(shù)有兩種方式：（1）間接檢測(cè)，主要檢測(cè)抗HCV抗體；（2）直接檢測(cè)，通過(guò)定性或定量檢測(cè)HCV病毒粒子的組成成分確定病毒的存在，例如HCVRNA。這兩種檢測(cè)方式在確診HCV感染，選擇HCV感染者的治療方案以及評(píng)價(jià)抗HCV治療的療效方面起到了關(guān)鍵作用。1.1抗HCV抗體的檢測(cè)上世紀(jì)九十年代初，利用重組HCV抗原開(kāi)發(fā)出了抗HCV抗體檢測(cè)技術(shù)，即酶免疫分析（enzymeimmunoassays,EIAs）技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展到第三代。該技術(shù)可檢測(cè)樣本中針對(duì)不同HCV抗原（如C區(qū)、NS3區(qū)、NS4區(qū)和NS5區(qū)等）的混合抗體，目前檢測(cè)的特異性已高達(dá)99%以上。由于缺乏更敏感的金標(biāo)準(zhǔn)，抗HCVEIA技術(shù)的敏感性還很難確定。在免疫健全的患者中，抗HCVEIA的檢測(cè)敏感性高于99%，幾乎所有的HCV感染者都可以被檢測(cè)出來(lái)。但對(duì)于正進(jìn)行血液透析的患者和嚴(yán)重免疫缺損患者，雖然其體內(nèi)有HCV復(fù)制活躍，但EIA檢測(cè)可能就是陰性結(jié)果。為此，某些廠商又開(kāi)發(fā)了免疫條帶分析作為確證實(shí)驗(yàn)，如Ortho公司開(kāi)發(fā)的RIBA等。因第三代EIA在臨床檢測(cè)中表現(xiàn)良好，目前免疫條帶分析在臨床的實(shí)際應(yīng)用的意義已不是很大。但因?yàn)樵谘綞IA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（positivepredictivevalue,PPV）相對(duì)較低，其在血站仍然有很大的用武之地。1.2HCVRNA的檢測(cè)1.2.1定性檢測(cè)HCVRNA定性檢測(cè)中HCVRNA的存在被視為HCV病毒復(fù)制的標(biāo)志。因其敏感性比現(xiàn)有的任何一種定量檢測(cè)方法都要高，定性檢測(cè)HCVRNA是非常有用的一種直接檢測(cè)HCV是否存在的技術(shù)。該技術(shù)基于利用RT-PCR技術(shù)或轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（transcription-mediatedamplification,TMA）技術(shù)特異性擴(kuò)增HCV基因組RNA序列，又稱為核酸擴(kuò)增（nucleicacidamplificationtechniques,NAT）技術(shù)。目前市面上的HCVRNA定性檢測(cè)試劑的檢測(cè)臨界值為50HCVRNAIU/mL和10IU/mL，主要產(chǎn)品有Roche公司的CobasAmplicororAmplicorHCVTest,Version2.0；Chiron公司基于TMA技術(shù)的ProcleixaHIV-1/HCV，可一個(gè)反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)HIV-1RNA和HCVRNA。1.2.2定量檢測(cè)HCVRNA樣本中HCVRNA含量可通過(guò)NAT技術(shù)和信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)（分支DNA檢測(cè)）來(lái)確定。目前市面上的HCVRNA定量檢測(cè)試劑的最低檢測(cè)臨界值介于30IU/mL和615IU/mL之間，線性定量的上限在500,000IU/mL和7,700,000IU/mL之間。樣本中病毒水平高于檢測(cè)上限的，應(yīng)稀釋1/10或1/100后重新檢測(cè)。HCVRNA定量檢測(cè)結(jié)果不受HCV基因型的影響，而所謂的國(guó)際單位（internationalunit,IU）是按WHOHCVRNA標(biāo)準(zhǔn)參比血清來(lái)確定的。為了比較不同HCVRNA定量檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果和在全球推廣，在不久的將來(lái)所有的HCVRNA定量檢測(cè)試劑都應(yīng)該采用此標(biāo)準(zhǔn)。目前市面上的HCVRNA定量檢測(cè)試劑主要產(chǎn)品有基于分支DNA技術(shù)的Bayer公司VersantHCVRNA3.0；基于競(jìng)爭(zhēng)性PCR技術(shù)的Roche公司CobasAmplicororAmplicorHCVMonitorTest,Version2.0和Abbott公司LCxHCVRNAQuantitativeAssay。2現(xiàn)有常用檢測(cè)技術(shù)的局限性2.1抗HCVEIA檢測(cè)存在“窗口期”由于現(xiàn)有的第三代抗HCVEIA檢測(cè)技術(shù)的特異性和敏感性已經(jīng)很高，基本上能夠檢出所有的HCV感染者，使輸血后丙型肝炎的發(fā)生率大大降低（美國(guó)在19971999年間為1/230,000，同期法國(guó)為1/700,000）。但是，在HCV感染后至抗HCV抗體產(chǎn)生之前還有一段約4070天的較長(zhǎng)時(shí)期（平均66天）。此時(shí)，獻(xiàn)血員已被感染并具有感染性，應(yīng)用目前的第三代EIA檢測(cè)試劑不能檢出，稱為感染后血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前的窗口期（preseroconversionwindowphase,PWP）。PWP的存在，是輸血安全的重要威脅之一，使受血者依然有經(jīng)輸入抗HCV篩選陰性的血液而感染HCV的危險(xiǎn)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有關(guān)于輸入抗HCV篩選陰性的血液而感染HCV的報(bào)道。2.2HCVRNA檢測(cè)難以普及由于在HCV感染后615天（平均11天）HCVRNA就在感染者血液中出現(xiàn)，并在血清陽(yáng)轉(zhuǎn)之前達(dá)到一個(gè)較高的水平，RNA滴度在100,000至100,000,000拷貝/mL之間。為了降低PWP感染的危險(xiǎn)，縮短PWP以實(shí)現(xiàn)HCV感染的早期檢測(cè)，許多國(guó)家引入敏感性很高的NAT檢測(cè)技術(shù)對(duì)獻(xiàn)血員進(jìn)行常規(guī)篩選。敏感的NAT試劑可以檢測(cè)出100至500份樣品的混合血樣中的HCVRNA。美國(guó)已開(kāi)始對(duì)16至24份樣品的混合血樣進(jìn)行NAT篩選，目前已經(jīng)在16,300,000份血樣中篩選出62份HCVRNA陽(yáng)性血。盡管NAT檢測(cè)在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)成功的篩選出了感染性獻(xiàn)血員，但由于NAT技術(shù)需要昂貴精密的儀器、較高的實(shí)驗(yàn)技巧、試劑比較昂貴以及容易交叉污染導(dǎo)致假陽(yáng)性偏高，使其很難推廣到單個(gè)獻(xiàn)血員，在發(fā)展中國(guó)家的應(yīng)用也受到很大限制。3HCV核心抗原檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展3.1HCV核心抗原檢測(cè)技術(shù)HCV核心抗原也是在HCV感染者體內(nèi)出現(xiàn)的早期感染的標(biāo)志，幾乎與HCVRNA同時(shí)出現(xiàn)。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出兩種檢測(cè)HCV核心抗原的ELISA檢測(cè)試劑，一種是直接檢測(cè)血清或血漿樣品中的游離HCV核心抗原，另一種是檢測(cè)血清或血漿樣品中的總的HCV核心抗原。一般直接檢測(cè)血清或血漿樣品中的游離HCV核心抗原主要用于血液篩查以縮短窗口期，保證輸血安全。而檢測(cè)血清或血漿樣品中總HCV核心抗原則用途較廣，不僅可用于血液篩查，而且還可指導(dǎo)慢性丙型肝炎患者的治療，判斷預(yù)后。Abbott公司的Muerhoff等研究出了一種基于微球的自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光免疫分析：PRISMHCV核心抗原檢測(cè)試劑，該方法首先以抗HCV核心抗原的單抗包被微球捕捉血清或血漿中的核心抗原，然后以丫啶色素結(jié)合的單抗檢測(cè)捕獲的抗原，利用單通道化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀確定結(jié)果。檢測(cè)14套血清陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清盤(pán)和1004名獻(xiàn)血員的結(jié)果表明，該方法的特異性達(dá)99.9%，與HCVRNA檢測(cè)的符合率為98.6%（69/70），平均可縮短窗口期32.7天，只比NAT檢測(cè)時(shí)間晚0.66天（平均），這與其它報(bào)道HCV核心抗原檢測(cè)檢出時(shí)間比NAT檢出時(shí)間晚1天左右是一致的。日本的Kashiwakuma等人也利用重組HCV核心抗原免疫BALB/c小鼠制備單抗建立了類似的熒光酶免疫分析技術(shù)，其所用的二抗是半乳糖苷酶結(jié)合的單抗，與相應(yīng)的底物作用檢測(cè)熒光。初步檢測(cè)結(jié)果表明，該方法檢測(cè)的HCV核心抗原定量與HCVRNA水平顯著相關(guān)，可用于總HCV核心抗原的定量檢測(cè)。3.1游離HCV核心抗原檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用游離HCV抗原檢測(cè)試劑尤其適于在血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前使用，可縮短HCV感染檢測(cè)的窗口期約4050天，應(yīng)用于獻(xiàn)血員篩查可顯著改善輸血安全。Ortho公司的Peterson等人為了評(píng)價(jià)一種可檢測(cè)血清中HCV核心抗原的ELISA檢測(cè)試劑原型，通過(guò)24份血清陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清對(duì)抗HCV抗體、HCVRNA和HCV抗原出現(xiàn)時(shí)間進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，83%（20/24）的樣品中HCV核心抗原與HCVRNA同時(shí)檢出。HCV核心抗原的平均檢出時(shí)間只比HCVRNA晚約1天。總體來(lái)講，87%的HCVRNA陽(yáng)性樣品中含有可檢測(cè)到的HCV核心抗原。Peterson等認(rèn)為，HCV核心抗原可在HCV感染后抗體陰性的窗口期通過(guò)常規(guī)的ELISA技術(shù)檢出，對(duì)于縮短檢測(cè)窗口期非常有用。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院與景達(dá)基因公司的張賀秋等人利用其研制的HCV核心抗原ELISA檢測(cè)試劑盒，通過(guò)對(duì)2.75萬(wàn)人獻(xiàn)漿員，采用抗HCV、HCVRNA和HCVcAg檢測(cè)試劑進(jìn)行連續(xù)兩年的HCV感染狀況跟蹤研究。研究表明，對(duì)兩年內(nèi)確診的11例HCV感染，HCV核心抗原診斷試劑、HCVRNA檢測(cè)試劑較HCV抗體檢測(cè)試劑對(duì)HCV感染后的檢出時(shí)間縮短。HCV核心抗原診斷試劑較HCV抗體檢測(cè)對(duì)HCV感染的陽(yáng)性檢測(cè)提前1468天，平均35.2天；HCVRNA診斷試劑較HCV抗體檢測(cè)時(shí)間對(duì)HCV感染的陽(yáng)性檢測(cè)提前1968天，平均39.3天；HCVRNA診斷試劑較HCV抗原檢測(cè)對(duì)HCV感染的陽(yáng)性檢測(cè)提前017天，平均4.1天。說(shuō)明HCV抗原檢測(cè)是一種適合我國(guó)國(guó)情縮短檢測(cè)“窗口期”的簡(jiǎn)單有效經(jīng)濟(jì)的方法。Ortho公司、景達(dá)基因公司推出了商業(yè)化的游離HCV核心抗原ELISA檢測(cè)試劑，資料顯示試劑可比已有的HCV抗體檢測(cè)試劑早35天以上檢測(cè)出HCV感染。更為重要的是，該方法操作快速、簡(jiǎn)便，可在3小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果，并且與現(xiàn)有的儀器設(shè)備兼容，適合用于獻(xiàn)血員的大規(guī)模篩選。然而，一旦HCV感染者體內(nèi)產(chǎn)生抗體發(fā)生血清陽(yáng)轉(zhuǎn)，抗核心抗原抗體與HCVcAg之間便可形成抗原抗體復(fù)合物，其檢測(cè)的敏感性就大大降低了。3.2總HCV核心抗原檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用為了克服游離HCV核心抗原檢測(cè)試劑的不足，Aoyagi等對(duì)樣品進(jìn)行了一步簡(jiǎn)單的預(yù)處理，將免疫復(fù)合物解離及病毒顆粒裂解后再行檢測(cè)。預(yù)處理的方法十分簡(jiǎn)便，可以很好地與常規(guī)ELISA方法整合，使該方法可在更廣泛的人群中應(yīng)用，也進(jìn)一步擴(kuò)大了方法的用途。Ortho公司開(kāi)發(fā)了可定量檢測(cè)血清或血漿中總HCV核心抗原的檢測(cè)試劑Track-C，無(wú)論抗HCV抗體存在與否均可使用。Laperche等的研究發(fā)現(xiàn)，其敏感性比第一代用于血液篩查的檢測(cè)游離HCV核心抗原ELISA試劑還要高，可以作為NAT試劑的替代產(chǎn)品用于窗口期HCV感染的診斷。Veillon等人通過(guò)與兩種HCVRNA定量分析方法：QuantiplexHCVRNA2.0（bDNAv2.0）或VersantHCVRNA3.0（bDNAv3.0）和CobasAmplicorHCVMonitorversion2.0（HCMV2.0）進(jìn)行比較研究，對(duì)該方法的敏感性、特異性和可重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，對(duì)于不同的HCV基因型樣品，該方法都取得了較好的結(jié)果，檢測(cè)的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5.11%和9.95%，在獻(xiàn)血員中檢測(cè)的特異性為99.5%，與兩種HCVRNA定量方法相比較有較好的相關(guān)性。Maynard等為確定總HCV核心抗原定量檢測(cè)在預(yù)測(cè)PEG修飾的干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療的反應(yīng)性上的效果，利用Ortho公司的總HCV核心抗原檢測(cè)試劑和HCVRNA定量檢測(cè)技術(shù)共同檢測(cè)了116位接受聯(lián)合治療的患者的病毒血癥情況。他們發(fā)現(xiàn)，在治療前和治療3個(gè)月后，總HCV核心抗原檢測(cè)的反應(yīng)預(yù)測(cè)性與HCVRNA檢測(cè)相同，似乎總HCV核心抗原檢測(cè)的效果在治療早期（4周以內(nèi)）要優(yōu)于HCVRNA檢測(cè)，在3個(gè)月后達(dá)到最佳效果。與HCVRNA檢測(cè)相比，在監(jiān)測(cè)治療和預(yù)測(cè)PEG修飾的干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療的反應(yīng)性上，監(jiān)測(cè)血清中總HCV核心抗原水平是一種精確和可靠的方法，可代替HCVRNA定量檢測(cè)。4結(jié)語(yǔ)抗HCV抗體檢測(cè)、HCVRNA檢測(cè)和HCV基因分型技術(shù)已在臨床和血站廣為應(yīng)用，為保證血供安全做出了重要貢獻(xiàn)。而HCV核心抗原檢測(cè)是近兩年得到快速發(fā)展的一種新的檢測(cè)HCV復(fù)制的間接指標(biāo)，它的出現(xiàn)使克服抗HCVEIA篩選的局限縮短窗口期成為可能，而且總HCV核心抗原檢測(cè)還可用于監(jiān)控慢性丙型肝炎患者體內(nèi)病毒載量，評(píng)價(jià)抗HCV治療的效果。參考文獻(xiàn)1.ZanettiAR,RomanoL,brunetoM,etal.TotalHCVcoreantigenassay:anewmarkerofhepatitisCviremiaformonitoringtheprogressoftherapy.JMedvirol,2003；70:27-30.2.PetersonJ,GrenG,IidaK,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigenintheantibodynegativewindowphaseofhepatitsCinfection.VoxSang,2000,78:80-85.3.LapercheS,LeMarrecN,SimonN,etal.AnewHCVcoreantigenassaybasedondisassociationofimmunecomplexes:analternativetomolecularbiologyinthediagnosisofearlyHCVinfection.Transfusion.2003,43(7):958-62.4.VeillonP,Payanc,PicchioG,etal.ComparativeevaluationofthetotalhepatitisCviruscoreantigen,branched-DNA,andAmplicorMonitorassaysindeterminingviremiaforpatientswithchronichepatitisCduringinterferonplusribavirincombinationtherapy.JclinMicrobiol,2003,41(7):3212-3220.5.MaynardM,PradatP,BerthillonP,etal.ClinicalrelevanceoftotalHCVcoreantigentestingforhepatitisCmonitoringandforpredictingpatientsresponsetotherapy.JViralHepat.2003；10(4):318-23.6.ZanettiAR,RomanoL,BrunettoM,etal.TotalHCVcoreantigenassay:anewmarkerofhepatitisCviremiaformonitoringtheprogressoftherapy.JMedVirol.2003；70(1):27-30.7.EirasA,FrancoE,MontoroJA,etal.HCVNAT(minipoolRT-PCR)andHCVcoreantigenELISA.Transfusion.2003；43(1):118；authorreply118-119.8.LaggingLM,GarciaCE,WestinJ,etal.ComparisonofserumhepatitisCvirusRNAandcoreantigenconcentrationsanddeterminationofwhetherlevelsareassociatedwithliverhistologyoraffectedbyspecimenstoragetime.JClinMicrobiol.2002；40(11):4224-4229.9.Bouvier-aliasMPatelK,DahariH,etal.ClinicalutilityoftotalHCVcoreantigenquantification:anewindirectmarkerofHCVreplication.Hepatology,2002；36(1):211-218.10.NublingCM,UngerG,ChudyM,etal.SensitivityofHCVcoreantigenandHCVRNAdetectionintheearlyinfectionphase.Transfusion.2002；42(8):1037-1045.11.GrantPR,SimsCM,TedderRS.QuantificationofHCVRNAlevelsanddetectionofcoreantigenindonationsbeforeseroconversion.Transfusion.2002；42(8):1032-1036.12.WidellA,MolnegrenV,PieksmaF,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigeninserumorplasmaasamarkerofhepatitisCviraemiaintheserologicalwindow-phase.TransfusMed.2002；12(2):107-11313.MuerhoffAS,JiangL,ShahDO,etal.DetectionofHCVcoreantigeninhumanserumandplasmawithanautomatedchemiluminescentimmunoassay.Transfusion.2002；42(3):349-356.14.WidellA,MolnegrenV,PieksmaF,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigeninserumorplasmaasamarkerofhepatitisCviraemiaintheserologicalwindow-phase.TransfusMed.2002；12(2):107-13.15.AoyagiK,IidaK,OhueC,etal.PerformanceofaconventionalenzymeimmunoassayforhepatitisCviruscoreantigenintheearlyphasesofhepatitisCinfection.ClinLab.2001；47(3-4):119-27.16.CourouceAM,LeMarrecN,BouchardeauF,EfficacyofHCVcoreantigendetectionduringthepreseroconversionperiod.Transfusion.2000；40(10):1198-1202.17.AoyagiK,OhueC,IidaK,D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