分類號 密級 編號 士學(xué)位論文 論文題目 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌銅抗 性相關(guān)基因的鑒定及分析 學(xué)科、專業(yè) 生 物 工 程 研究生姓名 羅焱杰 導(dǎo)師姓名及 專業(yè)技術(shù)職稱 邱冠周教授、劉學(xué)端教授 中 南 大 學(xué) 二八年五月 分類號 密級 碩士學(xué)位論文 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌銅抗性 相關(guān)基因的鑒定及分析 of 作者姓名： 羅焱杰 學(xué)科專業(yè)： 生物工程 學(xué)院（系、所） ：資源加工與生物工程學(xué)院 指導(dǎo)教師： 邱冠周教授、劉學(xué)端教授 論文答辯日期 答辯委員會主席 中 南 大 學(xué) 2008 年 5 月 碩士學(xué)位論文 摘要 I 摘 要 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（ 生物冶金工業(yè)中十分重要的一種細(xì)菌， 也是目前生物冶金的微生物菌群中研究得最多的細(xì)菌之一。盡管與大多數(shù)中性細(xì)菌相比， A. 耐受更高濃度的銅離子，但是其抗銅 的分子遺傳學(xué)機理仍不清楚。 最近， A. 全基因組已被測序，其全基因組注釋信息中，有四個基因被注釋為與銅抗性有關(guān)，但仍需實驗的證實。序列同源性分析結(jié)果顯示其中的兩個基因， 站上的登錄號分別為 有非常高的同源性（ 。本文以此兩個高同源性基因為對象，研究了它們與細(xì)菌銅抗性之間的關(guān)系，并鑒定了 這一過程中所表現(xiàn)出來的差別。實時定量 果顯示基因 銅脅迫的應(yīng)答非常敏感；使用 略，首次成功的鑒定了這兩個位于同一基因組中的高同源性基因之間的表達(dá)差異，結(jié)果顯示與 比，基因 銅離子環(huán)境中表達(dá)更多的譜表明 96的酶切泳道為 因表達(dá)的產(chǎn)物；生物信息學(xué)分析結(jié)果表明 達(dá)的蛋白質(zhì)具有 的所有特征序列， 是一種定位于膜上的離子泵，分子模建的結(jié)果進(jìn)一步顯示參與決定離子泵泵出何 種重金屬的保守氨基酸殘基位于跨膜結(jié)構(gòu)域的一個狹小區(qū)域內(nèi)； 功能互補實驗的結(jié)果顯示基因 提高銅敏感的 株的銅抗性；采用術(shù)，研究了 A. 準(zhǔn)菌株結(jié)果表明基因 起轉(zhuǎn)錄，處于同一個轉(zhuǎn)錄子；用 軟件對此轉(zhuǎn)錄子中的 明 編碼定位于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白基因， 析都沒有意義的同源性序列，其在銅抗性中的作用有待進(jìn)一步研究；用此轉(zhuǎn)錄子的引物擴增多種細(xì)菌 結(jié)果顯示此轉(zhuǎn)錄元件普遍存在于 A. 株基因組中。 所有以上結(jié)果表明相比 轉(zhuǎn)錄的碩士學(xué)位論文 摘要 因 細(xì)菌銅抗性中發(fā)揮著十分重要的作用，這為進(jìn)一步研究這種極端環(huán)境下生長的細(xì)菌的抗銅機理， 通過基因工程的手段提高A. 銅抗性以改良優(yōu)化生物冶金工藝奠定了理論基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 氧化亞鐵硫桿菌， P 型 ，抗銅，實時定量 士學(xué)位論文 as an in is of in . in a of is . in of of In we on To CR it to in a it NA in of 6% of by of 1a of to be to in of of in of 1be by by of . 士學(xué)位論文 V in a of in so it by a no be NA of to of it in . in . of in us to a in a us to . 士學(xué)位論文 第一章 目錄 V 目錄 摘 要. .錄. .一章 緒論. 1 物冶金概述. 生物冶金產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀. 生物冶金細(xì)菌學(xué)概述.生物抗重金屬研究進(jìn)展. 微生物抗重金屬的機理概述 . 微生物抗銅研究現(xiàn)狀.題的研究目的和研究內(nèi)容 . 依據(jù)和目的. 論文課題受資助情況. 論文的主要研究內(nèi)容.二章 不同基質(zhì)下銅抗性基因的差異表達(dá).言 .料與方法 . 菌株、引物和生長條件. 最佳銅離子濃度的鑒定. 取 . 成 . 實時定量（.果與討論 .三章 銅環(huán)境中高同源性的銅抗性基因之間的表達(dá)差異.言 .料與方法 . 菌株、質(zhì)粒、引物和生長條件. 取 . 成 . 隆策略 .士學(xué)位論文 第一章 目錄 果 .論 .第四章 銅抗性基因及所表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析.言 .料與方法 . 白序列的一般性分析 . 白的三維分子模建 .果與討論 . 白序列的一般性分析 . 白的三維分子模建 .五章 大腸桿菌突變體的功能互補實驗.言 .料與方法 . 菌株、質(zhì)粒、引物和生長條件. 粒構(gòu)建 . 重組子銅抗性鑒定.果與討論 .六章 銅抗性基因轉(zhuǎn)錄元件的鑒定及分析.料與方法 . 菌株和生長條件. 材料. 提取， 提取. . 生物信息學(xué)分析.果 . 同一個轉(zhuǎn)錄子中 . 錄元件廣泛分布在 A. 株基因組中 40 錄子的生物信息學(xué)分析 .論 .第七章 結(jié)論. 參考文獻(xiàn). 45 研究成果. 52 致 謝. .士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 物冶金概述 生物冶金是利用以礦物為營養(yǎng)基質(zhì)的微生物， 將礦物中金屬溶解， 進(jìn)而分離、富集、純化而提取金屬的濕法冶金技術(shù)。該技術(shù)因其流程短、成本低、低污染等優(yōu)點而十分適于處理貧礦、廢礦、表外礦及難采、難選、難冶礦的堆浸和就地浸出1它是綜合了濕法冶金，礦物加工，化學(xué)工程，環(huán)境工程和微生物學(xué)的多學(xué)科交叉領(lǐng)域3。 據(jù)文獻(xiàn)記載，中國是世界上最早采用生物冶金技術(shù)的國家，早在公元前六、七世紀(jì)，就在采銅、鐵過程中不自覺地利用了自發(fā)生長的某些自養(yǎng)細(xì)菌，唐朝時起，就有了官辦的濕法煉銅生產(chǎn)，到宋朝則發(fā)展更盛，北宋時的年產(chǎn)量最高時達(dá)到 100 多萬斤1。而在歐洲，這種技術(shù)的應(yīng)用至少始于公元二世紀(jì)，從 1687 年開始，瑞典中部 山的銅礦已經(jīng)浸出了 2 百萬噸銅4。開始人們對生物冶金反應(yīng)機理不清楚，僅憑經(jīng)驗，并不知道有細(xì)菌存在，浸礦技術(shù)發(fā)展十分緩慢。直到 1947 年， 首先發(fā)現(xiàn)酸性礦坑水中含有一種可將 化為 細(xì)菌， 指出這種細(xì)菌在金屬硫化礦的氧化和礦山坑道水酸化過程中起著重要作用。其后， 這種細(xì)菌的生理特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌能將 化為 并能將礦物中的硫化物氧化為硫酸6 1954 年， L. C. J. V. 礦坑水中發(fā)現(xiàn)氧化亞鐵硫桿菌與氧化硫硫桿菌。 他們的實驗室研究結(jié)果表明氧化亞鐵硫桿菌能夠浸出各種硫化銅礦及輝鉬礦，但浸出輝鉬礦則必須要有黃鐵礦的存在8。 1955 年， R 等29首次申請了生物堆浸專利并將該專利授權(quán)給業(yè)公司， 該公司于 1958 年取得了第一個有關(guān)細(xì)菌浸出技術(shù)的專利9，標(biāo)志著生物冶金技術(shù)現(xiàn)代工業(yè)應(yīng)用的開端。 物冶金產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀 目前世界范圍內(nèi)，生物冶金成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要是銅、鈾和金銀等礦山， 使用范圍從堆浸法逐步擴展到了地浸法和原地破碎浸礦法， 正在向銅、 鈾、碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 金、錳、鉛、鎳、鉻、鈷、鐵、砷、鋅、鋁等幾乎所有硫化礦的浸出擴大410。產(chǎn)業(yè)化相對領(lǐng)先的國家有智利、澳大利亞、美國、南非、日本等，中國、歐盟也從近幾年先后投入大量資金開展生物冶金領(lǐng)域的研究11縱觀全球，生物冶金產(chǎn)業(yè)化主要在兩個方面取得主要進(jìn)展，并形成了三大主要浸出工藝。 兩個方面取得的主要進(jìn)展是： （一）難處理金礦的生物預(yù)氧化處理 全球黃金礦藏資源有約 1/3 屬于用傳統(tǒng)氰化浸出不能有效提取的難處理金礦1。鑒于此，必須對其進(jìn)行預(yù)處理，使載金礦體發(fā)生變化，將包裹其中的金解離出來，為下一步氰化浸出提供條件，傳統(tǒng)的預(yù)處理方法包括：氧化焙燒和加氧浸出等，而生物氧化以其投資成本低，環(huán)境友好成為優(yōu)選技術(shù)。從 20 世紀(jì) 80 年代以來， 難處理金礦的生物預(yù)氧化在產(chǎn)業(yè)方面取得了很大的進(jìn)展， 并形成了 大工藝13 （二）低品位硫化銅礦的生物浸出 目前，用生物法提取的銅約占世界總銅產(chǎn)量的 25%，在美國、加拿大、澳大利亞、智利等 20 多個國家實現(xiàn)了生物提銅產(chǎn)業(yè)化。我國已開采的銅礦中 85%屬于硫化礦， 在開采過程中受當(dāng)時選礦技術(shù)和經(jīng)濟成本的限制產(chǎn)生了大量的表外礦和廢石，廢石含銅通常為 。因此生物法提銅近年來也得到很大發(fā)展，例如江西德興銅礦建成的濕法銅廠于 1997 年 5 月投產(chǎn)，已正常運轉(zhuǎn)了幾年，生產(chǎn)的陰極銅質(zhì)量達(dá)到 A 級15。 福建紫金山銅礦也已建立了年產(chǎn) 300 t 陰極銅的試驗廠。表 1 1 列出了迄今為止世界上主要的生物浸銅廠礦16。 三大主要浸出工藝是： （一）堆浸法 堆浸法是從硫化礦礦石中快速提取金屬的有效方法。 按原料不同可以分為原礦堆浸（ 廢石堆浸（ 。隨著大量低品位銅礦的堆積，近年來生物浸銅越來越吸引人們的注意力17。此法是指把礦石堆積在礦坑外浸出的一種方法。為提高浸出后的浸出液的集水率，堆積場的地表需具有不透水性。把低品位塊礦從底部開始以階梯形式堆積起來，并弄平其上部。從上部噴射浸出液 ,隨著浸出的進(jìn)行，浸出液的金屬離子含量逐漸下降，此時在上部重新設(shè)置堆積層繼續(xù)進(jìn)行浸出。美國等國家實施大規(guī)格浸出的礦山中，有的堆積階梯總高度可達(dá) 300m。 碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 表 1 1生物浸銅廠礦一覽表 1of of 礦名稱 國家 礦石特點 工藝 規(guī)模（ t/d） 服務(wù)時間利 輝銅礦，含 堆浸 3500(1400015000t/a 9801996大利亞 輝銅礦與斑銅礦， 原位浸出 設(shè)計能力為 13000t/a 19991 至今 大利亞 含金輝銅礦，含t，t 1370 19921997利 輝銅礦， 含 堆浸 16000(60000t/a 1993 至今大利亞 輝銅礦，含 堆浸 2000(14000t/a 1993 至今大利亞 輝銅礦，含 堆浸 1500(1000012000t/a 1994 至今利 輝銅礦，含 堆浸 17300(75000t/a 1994 至今利 原生硫化銅礦，含1400015000 1994 至今魯 次生與原生，含 60000120000 1995 至今大利亞 次生硫化銅礦 16000 1996 至今利 輝銅礦 10000 1996 至今利 次生硫化銅礦 約 20000 1998 至今德興銅礦 江西 含銅廢石堆浸， 原生硫化銅礦，廢石堆浸 設(shè)計年產(chǎn)電銅 2000t 1997 至今紫金山銅礦 福建 礦含銅 輝銅礦占 60% 設(shè)計年產(chǎn)電銅10000t 2004 至今官房銅礦 云南 礦含銅 含t，原生硫化銅礦占 20%， 次生硫化銅礦占 70% 年產(chǎn) 2000t 電銅 2003 至今利 硫化銅精礦 0000t 電銅 2003 至今低品位銅礦石的微生物堆浸工藝目前具有很大的吸引力， 對許多老銅礦礦山碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 的生存起著極其重要的作用。銅礦的堆浸的商業(yè)化應(yīng)用始于 1980 年。智利的 從 1980用生物浸出的技術(shù)每天處理 16000 噸的礦物18。從那以后，越來越多的銅礦采用堆浸浸出銅礦物19。美國、智利、澳大利亞、加拿大、墨西哥、西班牙、巴西、秘魯、保加利亞、前蘇聯(lián)、南斯拉夫、印度、日本都曾進(jìn)行細(xì)菌堆浸回收低品位礦石和地下難采礦石中銅的生產(chǎn)。 據(jù)稱在美國至少有 19 個難采難選銅礦采用細(xì)菌堆浸或井下就地浸出提取其中的銅，處理礦石量從數(shù)百萬噸至數(shù)億噸不等，所產(chǎn)銅產(chǎn)量占美國年產(chǎn)總銅量的 11%以上，總產(chǎn)值已逾 5 億美元。 智利近年進(jìn)展也較快， 從低品位礦石中堆浸產(chǎn)出銅量已達(dá) 30 萬噸，占全國產(chǎn)銅量的 20 %。 （二）槽浸法 槽浸的工作方式分為連續(xù)式與半連續(xù)式兩種，一般用于大型冶煉廠，礦石需進(jìn)行預(yù)加工，此法的成本比堆浸高 ,但反應(yīng)速度快，金屬回收率高 ,控制比較容易。槽浸的浸出設(shè)備是攪拌反應(yīng)器 ,反應(yīng)器的攪拌可通過機械或空氣攪拌方式達(dá)到。槽浸的方法主要是應(yīng)用于難處理金礦的預(yù)處理以及銅硫化礦精礦的浸出。 近年來 ,用細(xì)菌氧化法處理難處理金礦發(fā)展迅速，目前世界上已建起了 20 多個不同規(guī)模的高砷金礦石的微生物氧化提金試驗廠和生產(chǎn)廠，南非有 3 個工廠，其中金科 (司的 礦是世界上第一個細(xì)菌氧化提金廠， 1986 年投產(chǎn)以來，效益越來越好，金礦的浸出率穩(wěn)定在 95%以上，氧化時間由原來的5 到 6 天縮至 3 到 4天，使原建浸出槽處理金精礦量由 12t/d 增至 20t/d20。加拿大有一個廠處理含金、銀的尾礦，氧化處理時間 40h，金浸出率達(dá) 74 %。美國礦，槽浸容量最大 (槽高 13m，內(nèi)徑 17m)， 1990 年初處理能力達(dá) 500t/d。西澳 山運用澳大利亞 司開發(fā)出的 藝，建成了世界第一個中等嗜熱菌處理難浸金礦的生產(chǎn)廠。該廠處理浮選精礦含50t 金，日處理能力達(dá) 120t/d 精礦，反應(yīng)周期為 金的回收率是88% 運用槽浸的方法回收銅的浮選精礦中的銅的研究始于 20世紀(jì) 90年代末， 采用中溫菌浸出以次生硫化礦為主的銅精礦在工業(yè)上是可行的。 而黃銅礦精礦的攪拌槽浸出需要采用高溫菌在較高的溫度下進(jìn)行連續(xù)浸出方可以得到較好的浸出效果。 0000003年投產(chǎn)，該廠采用高溫菌連續(xù)攪拌浸出黃銅礦精礦，操作溫度為 70。 （三）原位浸出法 此法還可稱為原位置浸出或礦床內(nèi)浸出法， 是從低品位殘留礦床或未開采的碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 礦床中不用采礦作業(yè)回收金屬的一種方法。這種浸出在礦體中直接進(jìn)行，在礦體上按設(shè)計好的位置鉆孔，將浸礦菌液注入孔中，在一定的位置上設(shè)置集液孔收集浸出液。有時為了提高浸出液的流動性和浸出液與礦石的接觸面積，根據(jù)需要有時把礦體進(jìn)行破碎，多數(shù)礦堆是利用地面的自然形狀在礦場附近就地堆成的?？捎脟娏堋⒔n或豎管的方式將浸液引入礦堆，方式的選擇取決于氣候條件、礦物組成、礦堆高度和表面積以及生產(chǎn)規(guī)模。噴啉法可使浸液在礦物表面均勻分布，然而卻造成很大的蒸發(fā)損失，特別是在干燥的地區(qū)。 美國亞歷桑那州的 從 1988年就開始礦床中銅的就地浸出， 1995年靠原位浸出每年生產(chǎn) 2萬 。法國也有一些鈾礦用細(xì)菌進(jìn)行地下浸出， 1983年，成功地以原位浸出的方法從 2本小阪銅礦用細(xì)菌就地浸出已生產(chǎn)多年。 物冶金細(xì)菌學(xué)概述 生物冶金體系中所涉及到的微生物種類多種多樣，有化能自養(yǎng)菌、異養(yǎng)菌和真菌，其中主要是化能自養(yǎng)微生物，此類微生物可從無機物的氧化過程中獲得能量， 并以 表 1 2 中列出生物冶金中常見的細(xì)菌。 生物冶金細(xì)菌學(xué)早期研究主要集中在不同性能的高效浸礦菌的選育， 隨著分離到的細(xì)菌的種類和數(shù)目的增加，以及對細(xì)菌生理和浸礦特性研究的深入，研究人員開始關(guān)注不同環(huán)境中的浸礦微生物的群落間的關(guān)系。 主要集中在酸性礦坑水（ 境中的微生物群落組成和浸礦體系中的微生物組合的研究21并且有很多關(guān)于生物冶金細(xì)菌的生長代謝機制和產(chǎn)物的報道。近年來，更多的學(xué)者致力于中等嗜熱菌、高溫菌和耐金屬離子菌等高效浸礦菌種的馴化和選育24，在實際應(yīng)用中也有復(fù)合菌種浸礦的情況，浸礦效果大多好于純細(xì)菌浸礦。 在硫化礦生物浸出中應(yīng)用最多的為 硫化細(xì)菌，在有空氣、一定的 度及一定的含氮無機物情況下，硫化細(xì)菌就能生長繁殖，并將元素 S 和某些還原態(tài)的硫化物氧化成 中氧化亞鐵硫桿菌可以氧化 元素硫 ( 還原態(tài)硫化物；氧化硫硫桿菌能氧化元素硫，不能氧化 氧化亞鐵微螺菌能氧化 但不能氧化元素硫。在礦物浸出過程中，氧化亞鐵硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌通常與其他菌種混合使用，以提高礦物中有價金屬的浸出率25。在有關(guān)生物冶金的論文中，報道氧化亞鐵硫桿菌為浸礦菌種的論文占大多數(shù)26 碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 表 1 2 常見的浸礦微生物生理生化特性 of 生物名稱 生長溫度 （最佳） 生長 最佳 ) 形態(tài)學(xué)特征 生理學(xué)特性 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 A 40 （ 2835） 革蘭氏陰性，短桿狀，兩頭鈍圓 1150.8 嚴(yán)格好氧，嚴(yán)格無機化能自養(yǎng)，可氧化亞鐵，還原態(tài)硫（ 2,及金屬硫化礦 氧化硫硫桿菌 40 （ 2830） 革蘭陰性，桿狀，.0 鞭毛可動 同上， 但不能氧化亞鐵及硫化礦 氧化亞鐵鉤端螺旋菌 050 （ 30） 革蘭氏陰性，螺旋狀， 1.1 鞭毛可動 兼性好氧，嚴(yán)格無機化能自養(yǎng)，可利用亞鐵和黃鐵礦為能源，但不能氧化硫 氧化鐵鐵桿菌 570 23 多形態(tài)，.5 不運動 兼性好氧，嚴(yán)格無機化能自養(yǎng)，可氧化亞鐵，還原態(tài)硫（ 2,酵母汁及硫化礦 生物抗重金屬研究進(jìn)展 隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，重金屬的用途日趨廣泛，用量日益增加，因此，提高重金屬的有效開采率與副礦利用率顯得尤其重要。 但同時由于重金屬所具有的毒害性，進(jìn)入環(huán)境中的重金屬會導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)的嚴(yán)重破壞。目前，利用微生物治理重金屬污染已經(jīng)被人們認(rèn)為是一種有效的手段，并被廣泛應(yīng)用。微生物抗重金屬機理的研究也已成為當(dāng)今的熱點。 這為我們對微生物冶金中浸礦微生物的抗重金屬研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。 生物抗重金屬的機理概述 微生物抗重金屬的高低除了與微生物生長環(huán)境的化學(xué)因素有關(guān)， 更重要的是由微生物本身的生理結(jié)構(gòu)與遺傳特性決定的。其主要表現(xiàn)在以下三個方面： （一）細(xì)胞吸附沉積 碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 細(xì)菌表面載負(fù)電荷，并存在多種極性官能團，可通過靜電吸附和各種官能團的絡(luò)合作用固定重金屬離子。微生物吸附重金屬的機理十分復(fù)雜，它們對金屬的作用可分為微生物吸著和微生物累積兩個不同的生物化學(xué)階段。 微生物吸著是重金屬在細(xì)胞表面吸附和吸收即微生物吸著階段， 主要是指重金屬離子與生物體細(xì)胞壁表面的一些基團如 H、 通過絡(luò)合、整合、離子交換、靜電吸附、共價吸附等作用中的一種或幾種相結(jié)合的過程28。這一過程是細(xì)胞成分對金屬的被動吸收，其特點是快速、可逆、不依賴于生物細(xì)胞的能量代謝，典型的生物吸著過程在幾分鐘內(nèi)就可以完成。微生物累積是一種主動過程，它僅發(fā)生在活細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)活細(xì)胞生存在環(huán)境中時，它可以通過多種機理，包括運輸以及細(xì)胞內(nèi)外的吸附來提高本身的金屬含量。已提出的金屬運送的機制有：脂類過度氧化、復(fù)合物滲透、載體協(xié)助、離子泵等。微生物累積過程是通過微生物的新陳代謝伴隨著能量的消耗進(jìn)行的，它比微生物吸著慢得多29。 金屬硫蛋白是一種研究的比較多的金屬結(jié)合蛋白，它是一種低分子量、富含半胱氨酸但不含芳香族氨基酸和組氨酸的蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物中30。金屬離子通過和金屬硫蛋白中半胱氨酸的巰基結(jié)合形成生物學(xué)上穩(wěn)定的形式沉積下來31 隨著分子生物學(xué)研究手段的發(fā)展， 采用人工合成物對重金屬進(jìn)行吸附已經(jīng)成為一種快速、有效的方法。已發(fā)現(xiàn)人工合成 結(jié)構(gòu)使合成產(chǎn)物表達(dá)于細(xì)胞表面33，能提高機體吸附重金屬的能力。 （二）重金屬的轉(zhuǎn)化作用 微生物能通過氧化還原、甲基化和去甲基化作用轉(zhuǎn)化重金屬，將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化成無毒或低毒物質(zhì)。其中微生物對汞的轉(zhuǎn)化作用最常見且研究得最清楚，它主要有兩種作用方式：汞的甲基化和將 原為 4。 微生物通過有機汞裂解酶催化有機 汞的碳汞鍵斷裂，再由依賴 輔酶的二聚體酶汞還原酶把無機 原為 之揮發(fā)離開菌體細(xì)胞， 這一過程是可誘導(dǎo)的， 有機汞裂解酶和汞還原酶的底物都是其酶的誘導(dǎo)劑。與運輸汞有關(guān)的基因組成的調(diào)控、吸收和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，能將 特定的時期快速地還原成 低 細(xì)胞的毒性。 （三）輸出輸入系統(tǒng)對重金屬的作用 某些二價金屬離子由于沒有足夠的還原酶所需的 缺乏甲基化或其他共價修飾機制，因此不能像 可以借助于輸出系統(tǒng)完碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 8 成這一任務(wù)，其中有三種典型的系統(tǒng)（ P 型 ）介導(dǎo)二價金屬陽離子排出細(xì)胞35，目前這種輸出機制主要用于抗鎘和抗銅系統(tǒng)。 重金屬輸出系統(tǒng)往往包含幾種運輸?shù)鞍准易澹?這些能夠通過生物膜運輸帶電金屬離子的蛋白質(zhì)大都出現(xiàn)在生命早期，有的利用 6 438和 的利用質(zhì)子梯度作為驅(qū)動金屬離子運輸?shù)膭恿Γ?9還有的金屬離子運輸?shù)尿?qū)動力不很清楚，例如 1。 生物抗銅研究現(xiàn)狀 對所有的細(xì)胞來說，銅是一種必不可少的微量元素42。它作為許多氧化還原酶的輔因子，如細(xì)胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、多巴氨 羥化酶等，在生物體的新陳代謝中，發(fā)揮著十分重要的作用43。但是，過高濃度的銅離子卻對生物有毒害作用，這主要是因為銅離子能使脂類和蛋白質(zhì)氧化，產(chǎn)生過多的自由基，這對生物體是非常不利的44 因此，維持機體銅的平衡對所有生物體來說就顯得十分重要46。研究生物體維持銅平衡的機理也一直是基礎(chǔ)研究中的重要領(lǐng)域47 到目前為止，己經(jīng)鑒定并克隆了多個抗銅基因。其中，有三種細(xì)菌是研究的比較多的， 它們是 中革蘭氏陽性病原菌 研究的最多的細(xì)菌之一，他包含了銅轉(zhuǎn)運和抗性系統(tǒng)49，其中有兩個基因 別屬于離子泵入和泵出的 P 型 。在 兩個調(diào)控基因 4個結(jié)構(gòu)基因 們是由質(zhì)?？刂频?0。而在 ，基因染色體上的基因 被認(rèn)為與銅抗性有關(guān)51，52。 對于氧化亞鐵硫桿菌，盡管已經(jīng)得到了多株抗銅菌株53但是， A. 抗性機理的遺傳學(xué)研究，目前報導(dǎo)還比較少55 研究顯示銅可能是通