第一部分 文獻綜述 血管活性腸肽 簡介 血管活性腸肽 ( 是 一種由 28 個氨基酸組成的多肽， 20 世紀 70 年代早期由 1970)首次從豬十二指腸分離并命名。因一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu) 的相似性 ， 認為是胰高血糖素 見表 1)。胰高血糖素 7 和垂體腺苷酸環(huán)化激活多肽 (8(et 1989; et 1990)，胰高血糖素 (et 1978)，胰泌素 (1968)，胰高血糖素類似肽（ et 1987)，生長激素釋放因子 (1et 1982)和毒蜥素 ( et 1984)。 表 1 關(guān)肽的一級和二級結(jié)構(gòu) IP 源 5 10 15 20 25 30 8% 泌素 32% 高血糖素 21% 21% 25% 蜥素 54% 泛分布于中央神經(jīng)系統(tǒng)的類膽堿突觸前神經(jīng)細胞和外 周 肽能神經(jīng)細胞中 ，通過它可對 多種器官 進 行 神經(jīng)支配，比如心臟，肺，消化系統(tǒng)和泌尿生殖道，眼睛，皮膚，卵巢和甲狀腺 (et 2000)。 中樞 和 外周 神經(jīng)系統(tǒng)中是一種重要的信號肽，在生物體 內(nèi)涉及到多種 生物學功能 (et 2006)，包括 參與 新陳代謝 、 外分泌和內(nèi)分泌 、 細胞分化和平滑肌 舒張 (1991)、 激素分泌 (et 2001)和免疫應答調(diào)控(et 1999)?；谒亩喾N生物學功能，血管活性腸肽 (認為是一種對多種疾病包括糖尿病，哮喘，陽 痿和風濕 有治療 前 景的藥物候選物 (2003; 2004; et 2006)。 管活性腸肽的結(jié)構(gòu) 一種 由 28 個氨基酸組成的直鏈小分子神經(jīng)肽，相對分子量 為 3323 于胰高血糖素 因長度為 88371987)，定位 于 第 6 號染色體長臂 近末端處 ， 成熟的 由 170 個氨基酸組成的前激素原經(jīng)剪切得到。 管活性腸肽的來源 要是由外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，由副交感 神經(jīng)節(jié)后纖維釋放，并且與乙酰膽堿共同存在 (文衛(wèi)東等， 2000)。內(nèi)分泌細胞和胃腸粘膜分散的神經(jīng)中也存在 合成與釋放，另外分泌 經(jīng)纖維在生物體內(nèi)的大部分淋巴器官中也有發(fā)現(xiàn) (胡滿等，2000)。許多與免疫有關(guān)的細胞，如嗜酸粒細胞、肥大細胞和多形核細胞等也會產(chǎn)生少量外，如結(jié)腸癌細胞和胃癌細胞等腫瘤細胞，也可自分泌一定量的 翁躍頌，2006)。 體內(nèi)由肝臟分解，腎臟排泄，在體內(nèi)循環(huán)中的半衰期是 1鐘，正常時無法起到循環(huán)樣激素的作用 (1998)。 管 活性腸肽在體內(nèi)的分布 最初 從 小腸中分離出 后，又在各種淋巴組織及 外周 和中樞神經(jīng)系統(tǒng) ， 消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn) 存在 (姚泰， 2001； 李國華 ， 侯曉華， 2003； et 2003; 1998)。 在外周神經(jīng)系統(tǒng)中 ， 要分布 于 泌尿生殖道、淚腺、胰腺、胃腸道、肺、心等器官中 (et 1984)。 體內(nèi)廣泛分布 ，但其 濃度在體內(nèi)不同部位存在差異。在胃腸道中的 量最高 ， 外周神經(jīng)末梢和中樞神經(jīng)中 次之 ，外周血中 量最低（ 喻召才等， 1999）。外周血中 濃度顯著低于垂體門 靜 脈血 (et 1995)。 管活性腸肽的受體 血管活性腸肽（ 垂體腺苷酸環(huán)化激活多肽 (受體是 G 蛋白偶聯(lián)受體的一種，是由 3 個細胞外 ( 旋和 3 個細胞內(nèi) ( 旋連接的 7 次跨膜結(jié)構(gòu)域， 以及 一個長 N 端細胞外結(jié)構(gòu)域和一個 C 端細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 構(gòu)成 。迄今為止，已有 3 種類型的 體 被克隆和分類，分別為 et 1998)。 于 著 相同的親和力 ( 1 主要通過腺苷酸環(huán)化途徑激活。 較高親和力 ( 0.5 是對 親和力較低（ 500 時具有腺苷酸環(huán)化酶活性和磷脂酶 C 活性 (2007; 2009; et 2009)。 3 種受體在 不同的組織和器官中表達存在差異 。 達于大腦（腦皮層和海馬體）和周邊 組織如肝、肺和腸， 在免疫細胞中 也有 表達。 達于中樞神經(jīng)系統(tǒng) (主要在丘腦和神經(jīng)叉上核，在海馬體、腦干、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)低水平表達 )，并且在許多 外周 組織中表達，如胰腺、骨骼肌、肺、心臟、腎臟、脂肪組織、睪丸、胃、血管和生殖系統(tǒng)。 要存在于腦部 (大腦嗅球、丘腦、海馬體、海馬體齒狀回和小腦 )，并且存在于腎上腺髓質(zhì)中。這些受體的廣泛存在表明了 括 中樞 神經(jīng)系統(tǒng) ( 外周 組織 在內(nèi)的許多器官都會產(chǎn)生影響 ，。 管活性腸肽的生物學功能 初被認為 是一種存在于腸道的激素 ，直到 1976 年在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了 疫反應陽性現(xiàn)象，才開始認識到 一種神經(jīng)遞質(zhì) (et 1976)。 隨著 對 究 的 深入 ， 發(fā)現(xiàn) 生物體中的 有多種生物學功能。比如，在神經(jīng)系統(tǒng)中作為神經(jīng)遞質(zhì)；在消化系統(tǒng)中作為胃腸激素；在免疫系統(tǒng)中， 與 免疫細胞相 應的受體結(jié)合，產(chǎn)生免疫效應 (王軼等， 2008)。但是在血漿中， 度低且 迅速降解。由此可以看出 旁分泌 起 局部作用的一種激素 ，而不是一種 循環(huán)激素 (楚更五， 2000)。 管活性腸肽的胃腸道激素功能 經(jīng)元按其功能的不同可分為分泌神經(jīng)元與運動神經(jīng)元，分泌神經(jīng)元可以調(diào)節(jié)腸胃吸收，保護腸黏膜，刺激腸液和胰液分泌；運動神經(jīng)元 能夠 則可以 舒張胃腸和括約肌 (趙智強等， 2006)。 胃腸道中主要以神經(jīng)遞質(zhì)的形式發(fā)揮局部作用， 可以 舒張血管和松弛平滑肌、促進腸道內(nèi)的電解質(zhì)和水的轉(zhuǎn)運、促進吸收和分泌，還可以刺激小腸液和胰液的生成 (2001)。 胰泌素 可以 刺激胰島釋放出胰島素，釋放肝糖 ， 抑制胃酸的分泌，在短時間內(nèi)將血漿葡萄糖水平升高 (李尋等， 1990)。 管活性腸肽的神經(jīng)肽功能 夠 激活腦組織的 升高體溫 、 引起覺醒效應； 它還 能 刺激胰高血糖素、生長抑制素、黃體生成素、生長激素等激素 的 釋放； 參與 調(diào)節(jié)人體的晝夜節(jié)律 ，并在外周神經(jīng)中起到神經(jīng)遞質(zhì)的作用。對于控制心房心律不齊的迷走神經(jīng)， 樣 起到了重要的作用 (胡仲明，柳巨雄， 2003)。 大量研究表明， 5節(jié) 作用 (et 2000)。 是一種 催乳素釋放因子 ， 具有調(diào)節(jié)催乳素釋放 的作用 (et 1989)。也有研究證明，在星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中 作用 是轉(zhuǎn)導信號， 它 可 以 有效地保護星形膠質(zhì)細胞 (2000)。 管活性腸肽的免疫功能 能由淋巴細胞產(chǎn)生，并在外圍淋巴器官和中央淋巴器官中起到旁分泌的功能，說明 與了免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的雙向通訊。 為免疫調(diào)節(jié)肽，其受體基因在中央淋巴器官和外圍淋巴器官中 都有 表達 (1994)。 它 可以很好地調(diào)節(jié)機體免疫，尤其是 在 局部粘膜免疫的 調(diào)節(jié) 方面 (王偉，李偉毅， 2005)。 以通過對輔助性 T 淋巴細胞 ( 腺苷酰磷酸胞嘧啶核苷 (效應細胞 的 作用， 調(diào)節(jié)多種 胞特異性因子 的 水平 ， 同時 還 抑制 表達、阻止由抗原誘導產(chǎn)生 的 胞克隆的清除，幫助局部產(chǎn)生記憶 胞， 有 效 抵抗存活細胞的細胞凋亡，因此在體內(nèi)外 使 后 向 胞分化，之后產(chǎn)生以 主的免疫應答 (張 松照，2005)。 許多研究表明，淋巴細胞尤其是 T 淋巴細胞 (徑 )的活動明顯受 抑制?？梢哉{(diào)節(jié)胸腺細胞的成熟、分化和增殖 。 還有研究表明， 一定程度上可以影響免疫細胞的遷移、附著以及生物體 內(nèi)的 再分布 (et 2000)。 管活性腸肽的主要生理作用 管活性腸肽對胃腸道的作用 為促胰液素族成員， 它 對胃腸道起到 著 不可忽視的作用。 它可以 有效促進胰島素的分泌 ，同時也 能 抑制胃蠕動和胃 酸的分泌。 刺激胰腺使其分泌碳酸氫鹽和水分，這種作用和促胰液素相類似；它還能促進脂肪和糖元的分解，升高血糖； 刺激小腸上皮分泌 上 也擁有無法替代的作用， 它可使 腸液 電解質(zhì)的分泌明顯增加 (胡仲明，柳巨雄，2003)。 普遍認為 胃腸道平滑肌 具有 舒張 作用 。 管活性腸肽對心血管系統(tǒng)的作用 很多研究結(jié)果表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的 刺激 迷走神經(jīng)能夠 使其 釋放 靜脈注射 以強烈 地 降低血壓和舒張血管 (李 蓮軍等， 2001)。此外， 生理學作用 還 包括 使 心率加快、 增加 血管 的 通透性以及增強心肌的收縮力。研究還發(fā)現(xiàn) 心臟和動脈血管有較強的收縮作用， 它可以 降低血壓并促進全身血液的流動，以及降低外周血管的阻力 (楊鋼， 1996)。 一種內(nèi)源性的血管舒張劑。一定生理劑量的 藥于骨骼肌、消化腺、汗腺、肺和腎臟 ，可對這些部位 的血管產(chǎn)生舒張作用，還觀察到腦和心在使用了生理劑量的 舒張血管并隨血管的緊張度升高作用增強。腎上腺素能受體和膽堿能的阻斷劑 對 張血管的功效沒有影響，所以作為血管的舒張劑 非膽堿能、非 腎上腺素能的，膽堿和異丙腎上腺素對血管的舒張作用強于 作用時間要長于膽堿和異丙腎上腺素 (et 2000)。 管活性腸肽對腫瘤生長的影響 于一部分腫瘤的生長具有促進作用。陳潛 (1994)等發(fā)現(xiàn)帶有 體的胰腺癌細胞生長在 10-6 和 10-7 時得到 明顯的促進。 (2000)發(fā)現(xiàn)使用核素腫瘤受體 顯像 時 ， 胃癌原發(fā)灶的 體檢出率為 100%。 (1991)證實 100-5 的 外源 性 促使不同的胃癌細胞細胞株生成 是對于的 它們 生長并沒有明顯的影響。 管活性腸肽對于免疫 的影響 為一種免疫調(diào)節(jié)分子有著重要的作用，當存在強烈的致病因素誘導時， 主要免疫功能就 體現(xiàn)于它的抗炎作用 。當不存在強烈的致病因素誘導時，未成熟的樹突狀細胞在 誘導下成熟， 免疫應答得到促進，通過產(chǎn)生抗體提供保護作用，從而避免了急性炎癥的誘發(fā)。 抗炎作用是通過抑制重要的前炎性細胞 (比如中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞 )產(chǎn)生趨化因子和細胞因子，成熟后的樹突狀細 胞抗原呈遞功能通過抑制共刺激分子的表達而受到抑制，并抑制炎癥部位的 胞的聚集和促進胞的遷移，從而防止了慢性炎癥的發(fā)生和促進了急性炎癥的消退。還有一點 就是 ，過耐受型樹突狀細胞發(fā)揮誘導作用誘導抗原特異性免疫耐受。由于樹突狀細胞能否有效地將抗原呈遞給 T 淋巴細胞直接受到其在體內(nèi)的遷移過程的影響，免疫應答的發(fā)展和發(fā)生從而也受到影響，因此，關(guān)于樹突狀細胞免疫受 調(diào)節(jié)作用的一個重要方向就是對于樹突狀細胞趨化因子與其受體的表達受到 調(diào)控。 管活性腸肽在免疫細胞的表達和內(nèi)源 性 在淋巴器官中 兩個不同的來源，也就是自身神經(jīng)系統(tǒng)和免疫細胞本身。 淋巴組織中的 要來源于其本身的免疫細胞 。免疫細胞特別是 細胞表達 加工 前體和分泌 熟肽。產(chǎn)生 多的是 2 細胞，用來應答抗原刺激 (2001a, 2001b, 2001c)。有趣的是 ， 中性粒細胞和肥大細胞分泌的 段 ( 體 不起到 信號 作用， 但在最近被發(fā)現(xiàn)具有抗菌活 性 (et 2008; et 2009)。 由免疫細胞生成的內(nèi)源性 調(diào)控方面起著重要的作用。早期的研究表明 敗血癥和類風濕性關(guān)節(jié)炎 中 高 很可能是在試圖抑制免疫反應 (et 1989; et 1994)。在患有自身免疫性甲狀腺炎和紅斑狼瘡的病患體內(nèi)，存在低水平的高水平的 ，這些現(xiàn)象都表明了 平降低可能導致疾病的 發(fā)展 或加劇(et 2003)。 體內(nèi) 乏的 小鼠對脂多糖 (發(fā)的敗血性休克更為敏感，并且更容易發(fā)展為支氣管哮喘和肺部高血壓，它們有更高數(shù)量的免疫細胞 浸潤 ，并在支氣管肺泡灌洗液中有更高水平的促炎細胞因子 (et 2006; et 2006)。這 一結(jié)果 與之前發(fā)現(xiàn)的外 源性 少促炎細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生 ， 使 非特異性 免疫細胞特別是巨噬細胞失活 相一致。 管活性腸肽在炎癥和自身免疫性疾病中的作用 限制炎癥和免疫 應答 的進行 中 起 到了 重要 的 作用 ， 并能促進炎癥的識別。 使用外源 性 療 很多 病理 實驗模型 可 以減少發(fā)病頻率及減輕癥狀的嚴重程度 ，如敗血癥、胰腺炎、肝炎、呼吸道炎癥性疾病、神經(jīng)變性失常、類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、 型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、 肖格倫綜合征和自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎。在以 惡化 的炎癥反應為特點的疾病中， 有益影響表現(xiàn)為 可 在全身或局部范圍內(nèi) 廣泛 下調(diào)炎性細胞因子、趨化因子和氧化應激 介質(zhì)的水平 。 過抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活 ， 對神經(jīng)變性如脊椎損傷 (et 1999; et 2000)、腦創(chuàng)傷 (2003a, 2003b, 2003c; et 2007)和帕金森綜合癥 (2003a, 2003b, 2003c; et 2006; et 2010)也 同樣 具有治療作用 。 在自身免疫性疾病中， 治療效果 與 引發(fā)自身免疫的早期 炎癥反應的 下調(diào) 和 對慢性激活的 晚期 炎癥反應 的 下調(diào) 緊密相關(guān) 。在體內(nèi)， 弱自身反應 胞 的發(fā)育和它們向靶 器官 的遷移 ， 減少 促炎細胞因 子和趨化因子 的 釋放， 導致 巨噬細胞和中性粒細胞 的 召 募與 激活 下降 ，并且誘導 產(chǎn)生 。 T 細胞分化和功能的影響 是 直接或間接的通過樹突 狀 細胞的免疫調(diào)節(jié)完成。 管活性腸肽在炎癥和自身免疫疾病方面的應用 治療炎癥、自身免疫性疾病方面 有 廣泛 研究， 主要 集中于 治療感染性休克、炎癥性腸病和類風濕性關(guān)節(jié)炎 和 一些其他的炎癥 。在治療 自身免疫性疾病方面 ，有報道采用制 T 細胞的增殖和 產(chǎn)生等 ， 從而對肉芽腫的形成進行調(diào)節(jié) (991)。抑制肺組織中的 活性，阻止肺上皮細胞 的 凋亡，還可 抵 抗肺部的氧化和炎癥狀態(tài)，保持氣道、肺部上皮的完整性 。 治療肺部疾病如急性呼吸窘迫癥等具有重要的意義 (000)。 對于 其 它 具有自身免疫和慢性炎癥表現(xiàn)的疾病如多發(fā)性硬化和糖尿病等的防治上 ， 樣被認為 是有 價值 的 (et 2003)。 感染性休克是一種臨床常見疾病，導致休克的急、慢性炎癥主要由革蘭氏陰性菌感染所引起。其他類型的細菌、霉菌、原蟲及病毒也可引起這種感染。在感染性休克 時， 促炎因子 通過 抑制血液中的 升高抗炎癥因子如 平防止感染性休克發(fā)生。 炎癥性腸病 (為一種慢性疾病其主要 表 現(xiàn)為腸道炎癥，包括克隆氏病 (潰瘍性結(jié)腸炎 (在 病的作用中免疫學因素已得到肯定并已有深入的研究，特別是粘膜的固有免疫和神經(jīng)肽的免疫調(diào)節(jié)方面 (et 1996)。 (1994)研究指出類神經(jīng)肽如 水平 ， 從而 發(fā)揮了 保護性粘膜固有免疫調(diào)節(jié) 功能，因此 以用于慢性 治療。 類風濕性關(guān)節(jié)炎 (一種對人類健康嚴重威脅的自身免疫性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為骨和軟骨破壞以及慢性對稱性多關(guān)節(jié)炎，骨及關(guān)節(jié)軟骨破壞、炎性細胞浸潤、滑膜增生、功能喪失甚至殘疾是其最顯著的病理特點。 發(fā)病機制目前尚不清楚，但是自身免疫和炎癥反應已被證實是引起骨和軟骨損傷及類風濕性關(guān)節(jié)炎 (兩大主要因素。以通過對炎癥和自身免疫這兩條途徑的下調(diào)有效防治類風濕性關(guān)節(jié)炎 (et 2001d)。 清抵抗素 血清抵抗素 (一種肽激素，它以分泌蛋白的形式出現(xiàn)， 富 含 半胱氨酸，是因的編碼產(chǎn)物，在人體內(nèi)是一段 108 個氨基酸的前肽，在分泌前被剪切 形成抵抗素 。在外周血中的抵抗素主要是以二聚體結(jié)構(gòu)存在，其二聚體結(jié)構(gòu)是由兩段 92 個氨基酸構(gòu)成的多肽組成，這兩段多肽通過 二硫鍵連接。抵抗素很可能就是 胰島素 抵抗和 肥胖 之間的重要聯(lián)系。小鼠體內(nèi)的血清抵抗素在脂肪細胞、骨骼肌細胞和干細胞中發(fā)揮功能，使這些細胞對胰島素的 敏感性 降低，小鼠的血 清抵抗素 由 脂肪細胞 產(chǎn)生和分泌。 抵抗素 可抑制 胰島素 刺激 的糖攝取 ， 血清抵抗素的含量在 肥 胖 小鼠體內(nèi)有所提高，在使用抗糖尿病藥 物 或者對小鼠禁食后抵抗素含量會降低 (et 2009)。 清抵抗素的表達調(diào)控 甾體類激素、神經(jīng)肽 Y、高血糖、生長激素等 可誘導 抵抗素 組織或脂肪細胞中 的 表達 ，衰老因素也具有相似的作用 ?？崭?、內(nèi)皮素 狀腺素、異丙腎上腺素和腎上腺素 可以使抵抗素的表達受到抑制 。 與 炎癥和動脈粥樣硬化 密切相關(guān)的 因素 對于調(diào)節(jié)人單核巨噬細胞中 抵抗素的表達具有重要的意 義 (et 2009)。 清抵抗素與胰島素抵抗 抵抗素 可降低 一些細胞 ，如 脂肪細胞、骨骼細胞和肝細胞 對于胰島素 的 敏感度 ，從而誘發(fā)胰島素抵抗，進而可 導致糖耐 受 量降低，空腹血糖含量升高 (et 2007)。 在 7 天后 ，隨著血清中抵抗素水平的升高， 抵抗素過表達 的 小鼠葡萄糖灌注率降低13%肝糖的輸出降低 27%游離脂肪酸的水平被胰島素抑制降低了 7%，存在胰島素抵抗現(xiàn)象。一些組織中 如 骨骼肌、肝臟和脂肪組織中的蛋白激酶途徑的激活 受到顯著 的抑制。血清抵抗素 可以 引發(fā)胰島素的全身抵抗，從而導致慢性高胰島素血病癥與高三酰甘油血病癥。 人的胰島素敏感性和人血清抵抗素呈現(xiàn)出 顯著 負相關(guān)性，抵抗素引發(fā)胰島素抵抗 (張望，張健， 2007)， 其可能的機制是抵抗素可以減弱胰島素刺激的脂肪細胞攝糖作用從而引發(fā)胰島素抵抗 。并且，在抵抗素高度表達的動物模型中，骨骼肌和肝臟對葡萄糖的攝取可以被高抵抗素血癥減少，使骨骼肌細胞和肝臟細胞中的胰島素的信號轉(zhuǎn)導途徑減少，這包括了使 活減少， 活減少， 酸化及蛋白含量減少 (et 2006)。這些說明了，在骨骼肌、肝臟及脂肪組織中 ，抵抗素作為一種信號，使胰島素作用下的葡萄糖攝取減緩從而減弱了胰島素的作用，引發(fā)了 胰島素抵抗。 清抵抗素與炎癥 近年來研究已經(jīng)表明 ， 炎癥因子和血清抵抗素的關(guān)系呈現(xiàn)出正相關(guān)性， 并認為 炎癥狀態(tài)就是一種抵抗素水平升高的狀態(tài)。在外周單核細胞有血清抵抗素的表達，當使用諸如內(nèi)毒素等炎癥刺激因子作用于外周單核細胞時，可以檢測到抵抗素表達水平顯著升高，在急性內(nèi)毒素敗血癥患者體內(nèi)的血清抵抗素含量可提高達正常值的七倍 (章建梁等， 2009)。類風濕性關(guān)節(jié)炎患者 體內(nèi)有血清抵抗素的聚集，其聚集在患病者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并且炎癥指示物的水平與血清抵抗素的含量 之 間具有關(guān)聯(lián) (杜娟 和 王純瑩， 2007)。 清抵抗素與高血壓 人體胰島素抵抗是肥胖、高血壓、糖尿病等疾病發(fā)病的基礎(chǔ)。但是高血壓與血清抵抗素之間的關(guān)系還不明確。研究表明 (李志臻，傅祖植， 2006)，血清抵抗素非編碼區(qū)部分基因的單核苷酸 多態(tài)性與許多因素有關(guān)，這些相關(guān)因素包括肥胖、腰圍、胰島素的敏感性和高血壓等 (劉玉嵐等， 2006； et 2008)。還有研究表明，脂肪細胞的活性能夠 顯著 的被某 些 高，這和細胞的氧化應激存在著潛在的關(guān)聯(lián)。肥胖和 型糖尿病的引發(fā)有可能和血清抵抗素的分泌水平 升 高有關(guān)。血清抵抗素的表達、分泌和功能受到血清抵抗素基因的多態(tài)性影響，從而影響到糖尿病的病發(fā)，因此胰島素的敏感性也可以間接或直接的受到影響，從而與糖尿病和高血壓產(chǎn)生了聯(lián)系。 清抵抗素與動脈粥樣硬化 許多的研究結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化是由白介素 腫瘤壞死因子 白介素 一些炎癥刺激因子參與形成，在動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展過程中，這些炎癥刺激因子起 到了重要的作用。同時人單核細胞的抵抗素 達水平也可以被這些炎癥刺激因子上調(diào)，這表明 了這些炎癥刺激因子影響到動脈粥樣硬化的另一個機理就是調(diào)節(jié)抵抗素 表達 (et 2009)。 動脈粥樣硬化是一種具有炎癥表現(xiàn)的慢性疾病，動脈粥樣硬化斑塊是許多因素相互作用引起的，這些因素包括了單核 /巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、 種細胞因子、生長因子。炎癥因子能夠顯著 地 誘導血清抵抗素的表達 ，同時和動脈粥樣硬化有關(guān)的炎癥 過程也有血清抵抗素的參與，從而引發(fā)了一系列的生理和病理結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)血管壁的主要成 分如核 /巨噬細胞和內(nèi)皮細胞等均直接受到血清抵抗素的作用從而促進動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化相關(guān)的病理形成過程也可能有血清抵抗素的參與 (張遠梅， 2012)。 管活性腸肽對血清抵抗素的作用 近些年來 有 研究證實， 自身炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著極其重要的作用(2001)。血清抵抗素作為一種脂肪因子 具 有促進炎癥的功能。血清抵抗素的基因可被 過一系列的級聯(lián)反應誘導表達，這一系列的級聯(lián)反應包括了分泌促進炎癥的細胞因子。 有調(diào)節(jié)免疫和抗炎的作用， 通過其 受體 以 顯著下調(diào)由 導的急性炎癥狀態(tài)下產(chǎn)生的促炎因子血清抵抗素 (水平 (謝珊珊等， 2009； et 2009)。 題的提出 有廣泛的生物學活性 ， 提示 有廣闊的臨床應用前景。 但 是，到目前為止只開 展了 少數(shù)臨床實驗。 床 應用的 一個主要障礙 就 是 它 在在體內(nèi) 受到蛋白 酶 作用 、抗體 中和、 自發(fā)水解而 半衰期很短 ， 這使 體內(nèi)半衰期 不足 1 分鐘。 嘗試提高 穩(wěn)定性的方法， 包括 對其母體進行化學修飾、使用穩(wěn)定的 體激動 劑或 似物、 肽酶抑制劑組合使用或?qū)?確地嵌入到微?；蚣{米粒子中 (et 2010)。 氨基酸的化學修飾或替換作為一種常用的方法早已被提出并用來增加神經(jīng)肽的穩(wěn)定性 (er 2010)。 他的同事最近得到了兩個 衍生物具有相當可觀的穩(wěn)定性 (在 40 超過 60 天 )，它被做成可吸入的粉末制劑在哮喘和慢性阻塞性肺病 (型上具有一定功效 (et 2009; et 2010)。但是這些 衍生物在治療其他疾病上面受到了限制。之前也有提出使用微膠?；蛑|(zhì)體包埋神經(jīng)肽使其在體內(nèi)緩慢釋放，近期這種方法也被用于 體內(nèi)抗炎模型的應用上(er 2009)。然而這種脂質(zhì)體包埋的神經(jīng)肽進入目標器官受到了其顆粒大小的限制。為了克服這個潛在的問題，一個近期的研究描述了一種將 埋于由銀保護的納米粒子，它的功能和體內(nèi)固定 小神經(jīng)膠質(zhì)細胞相類似 (2009)，這項研究第一次提供了使用金屬納米粒子對神經(jīng)肽靶向給藥的資料，但是在炎 癥狀態(tài)下的基于納米粒子的治療效果還需進一步證明。雖然已有多種延長 體內(nèi)半衰期的方法，但是仍需找到一種簡單、經(jīng)濟且安全可靠的方法。 人血清白蛋白 (為人血清的主要成分，對體內(nèi)血漿體積和滲透壓的維持起到了至關(guān)重要的作用。 分子量為 非糖基化蛋白，它具有非常低的腎清除率，在人體內(nèi)的半衰期為 1420 天。 體內(nèi)常作為體內(nèi)因子和藥物的轉(zhuǎn)運的載體。所以， 以作為小分子蛋白在血液中的載體從而延長小分子蛋白在人體內(nèi)的半衰期 (唱韶紅等， 2006)。 的研究發(fā)現(xiàn)，通過克魯維氏酵母表達的合蛋白在以家兔作為動物模型的實驗中，其半衰期達到了 體的 140 倍(et 1992)。通過維氏酵母表達的 的半衰期在獼猴體內(nèi)比8 倍 (et 2002; et 2003)。 為了延 長 體內(nèi)的半衰期，我們希望通過構(gòu)建重組 表達載體，將 連，從而延長 體內(nèi)的半衰期。之后將表達載體轉(zhuǎn)染入 胞表達得到 目標 重組蛋 白。 目前， 要的臨床應用是 對治療炎癥、感染性休克 、 自身免疫性疾病方面。 血清抵抗素作為一種脂肪因子 具 有促進炎癥的功能。 有調(diào)節(jié)免疫和抗炎的作用， 通過其受體 導 可以 顯著下調(diào)由 導的急性炎癥狀態(tài)下產(chǎn)生的促炎因子血清抵抗素 (水平 (謝珊珊等， 2009； et 2009)。 因此，我們考慮 利用 征 重組 血管活性腸肽（ 融合 蛋白的生物活性。 文獻顯示 (謝珊珊等，2009)，在給體重 20 g 左右的小鼠按照 5 g/g 體重注射 以使小鼠體內(nèi)的血清抵抗素由正常的 10 g/L 左右升高至 35 g/L 左右，當 同作用時可以使小鼠體內(nèi)血清抵抗素降低至 5 g/L 左右 。我們給小鼠注射 其血清抵抗素 被 誘導升高，再給小鼠注射重組 白，收集小鼠血清，使用小鼠血清抵抗素 劑盒檢測小鼠血清中的抵抗素含量，希望通過注射重組 白能夠降低其被 導升高的血清抵抗素含量，從而驗證重組 白的生物學活性。 同時對小鼠進行行為學的觀察，用來輔助評價 組蛋白的生物學活性。 第二部分 重組血管活性腸肽克隆的 構(gòu)建及表達 為一種重要的小分子 信號肽，在生物體 內(nèi)涉及到多種 生物學功能 (et 2006)。 基于它的多種生物學功能， 認為 在 對多種疾病 如 糖尿病，哮喘，陽痿和風濕 等的 治療 上 都 具有廣闊的前景 (2003; 2004; et 2006)。 但是由于 體內(nèi)的半衰期不到 1 分鐘 (1998) ，它在應用方面受到了限制。目前采用 化學修飾、使用穩(wěn)定的 體激動劑或 似物、 肽酶抑制劑組合使用或 將 埋到 微?；蚣{米粒子中 (et 2010)，但這些方法都具有一定的局限性。 為載體蛋白延長小分子蛋白在血液中的半衰期是目前的一種通行技術(shù) (唱韶紅等， 2006)。許多相關(guān)研究已表明 小分子蛋白的融合蛋白在體內(nèi)的半衰期相比小分子多肽單體延長了數(shù)倍 (et 1992； et 2002; et 2003)。 本實驗將構(gòu)建以 為載體蛋白的 合蛋白克隆表達載體，我們將 段通過一段 連接肽連接并插入到 體上，篩選出正確克隆后轉(zhuǎn)染 胞，表達得到目標重組蛋白。 驗材料 驗儀器 移液槍、超凈工作臺 (安泰 )、磁力攪拌器、微波爐、高溫蒸汽滅菌鍋、 低溫冰箱(超純水儀 (制冰機、離心機 ( 恒溫金屬浴、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (上海一恒 )、 ( 臺式冷凍離心機 ( 電泳儀 (伯樂 )、 00 型凝膠成像儀 (。 段與載體 本實驗所用質(zhì)粒 美國 司產(chǎn)品 (圖 1)，帶有 本 實驗室 儲藏 (圖 2)。帶有 段的質(zhì)粒為華大基因公司全合成 。 圖 1 粒圖譜 2 粒圖譜 片段 2196 個堿基組成，其序列如下： 合成的 段帶有 酶切位點，全長 114 序列如下： () 種及細胞株 大腸桿菌 胞株均為實驗室已有。 游引物 ： 游引物 ： 主要試劑 本實驗所用到主要試劑見表 2。 表 2 主要試劑 劑名稱 公司名稱 司 司 司 合酶 司 合酶 司 接酶 司 司 司 司 柱式質(zhì)粒 量抽提試劑盒 生工生物工程有限公司 柱式 回收試劑盒 生工生物工程有限公司 柱式 物純化試劑盒 生工生物工程有限公司 酵母提取物 粒 量提取 試劑盒 司 氨芐青霉素 生工生物工程有限公司 普通試劑如 瓊脂糖 、甘油、無水乙醇、 白胨、 于國內(nèi)試劑公司 。 要溶液的配置 按照表 3 稱取蛋白胨、酵母提取物和 900 餾水，置于磁力攪拌器上充分溶解，用 1 N 的 定容至 1000 入高溫蒸汽滅菌鍋中 121 滅菌 20 分鐘，冷卻后保存于 4 備用。 表 3 養(yǎng)基的配置 B 養(yǎng)基 蛋白胨 酵母膏 餾水 B 培養(yǎng)基（ 1 L） 10 g 5 g 10 g 1000 B 體培養(yǎng)基的配置 配置好 體培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后在無菌工作臺內(nèi)將氨芐青霉素 (入到 氨芐青霉素終濃度為 100 g /勻后保存于 4 備用。 體 配置好 體培養(yǎng) 基并調(diào)完 ，向 100 B 液體培養(yǎng)基中加