蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 第一章 前言 牧 草 產(chǎn) 業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境中具有重要的地位和作用。 目前， 全國草原承包 面積占可利用面積的 70%。 2002 年以來 國家先后啟動(dòng)了天然 草原植被 恢復(fù) 、草原圍欄、草種基地建設(shè)等項(xiàng)目，項(xiàng)目區(qū)草原生態(tài)得到明顯恢復(fù)，取得良好效果。但是 ，病害 對 我國 牧草生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 煙草花葉 病毒 病 （ 是 煙草 主要 病害之一， 可以侵染紅豆草，苜蓿等豆科牧草，給我 國牧草 生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響，同時(shí)也對草地植被的健康成長造成了危害，大大縮短了天然草地的利用年限。 植物基因工程 是 20 世紀(jì) 80 年代 興起的新技術(shù)，它的發(fā)展為牧草改良提供了新的手段 。 用 基因 工程改良牧草有幾個(gè) 優(yōu)點(diǎn) ： 一是轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成熟，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已成為常規(guī)技術(shù) ， 成功地用于牧草轉(zhuǎn)化；二是抗旱苜蓿已在生產(chǎn)上 開始 應(yīng)用，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)；三是轉(zhuǎn)基因牧草主要在極端環(huán)境 條件 下 栽培， 可 用于改善 環(huán)境 。 從解決目前育種和生產(chǎn)中的兩個(gè)重要問題而言，由于對植物防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制的認(rèn)識還很匾乏，缺乏可用的相應(yīng)基因，因此上游工作的不足是牧草基因工程技術(shù)應(yīng)用的“瓶頸”所在。 煙草的野生品種 林煙草 （ 的 N基因 可以 對煙草花葉病毒產(chǎn)生抗性。 林煙草被 煙草花葉病毒侵染后，其葉片會產(chǎn)生超敏反應(yīng)， 將 煙草花葉病毒限制在被侵染葉片中，而同一株的其它葉片則不會產(chǎn)生花葉 癥狀 。 因此 ，對 N基因 的研究備受關(guān)注。 基于這些認(rèn)識， 為 確定林煙草 N基因?qū)?病信號途徑 。本論文以林煙草為材料， 從中分離 了植物 防衛(wèi)反應(yīng)調(diào)控元件的編碼基因 構(gòu)建了 這 8 個(gè) 基因的 物表達(dá)載體并遺傳轉(zhuǎn)化林煙草 ，希望這部分工作能為我國牧草抗病和品質(zhì)改良 的基因工程提供有用的基因資源和元件。 目前植物中調(diào)控抗病反應(yīng)的途徑主要有水楊酸 (A)、茉莉酸(乙烯 (T)途徑 ( 2003)。 盡管植物受到不同病原的浸染 ， 但似乎都是以一條共同的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控抗病反應(yīng)(et 2006; et 2008)。研究這些途徑的 上述 抗性反應(yīng)調(diào)控 元件 的特性 , 可以為植物的持久、廣譜性的抗性機(jī)理提供依據(jù)。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 第二章 文獻(xiàn)綜述 草花葉 病毒 煙草花葉病毒 (于煙草花葉病毒屬，是世界上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的病毒 ， 對 其 的研究歷史已超過 110 年，極大的促進(jìn)了病毒學(xué)甚至整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展，是病毒學(xué)領(lǐng)域的“開拓者” (et 1999； et 2011)。 草 花葉病毒的寄主范圍 侵染 苜蓿、紅豆草等 豆科 、 十字花科、茄科、菊科及莧科共 36 科350 種植物。 草 花葉病毒的結(jié)構(gòu)及基因 組 組成 常穩(wěn)定， 其穩(wěn)定性主要是由于緊密的病毒粒子結(jié)構(gòu)造成的， 提純的病毒粒子在 5條件下至少可以保存 50 年。它的病毒粒子由一條單一的基因組子構(gòu)成，包裹在在其圓柱形的外殼蛋白中 (et 1999; et 2011)。 世界上第一個(gè)被完整測序的植物 毒。 1982 年， 首次完成了 通株系 (基因組序列（ 6395 測定 (et 1982)； 因組呈單鏈線性，含有 6400 個(gè)堿基 ， 編 碼了四種蛋白 復(fù)制酶（ 30運(yùn)動(dòng)蛋白（ 外殼蛋白（ 。 為煙草花葉病毒復(fù)制酶的組成部分 (1986)，是從基因組 接翻譯得到的； 通讀 終止子得到的 (1978)。 別從 基因組 譯得到?；蚪M 5非翻譯區(qū) (端為 子結(jié)構(gòu)，而 3疊形成類 構(gòu)，末端 (3常與組氨酸 (價(jià)連接(et 1999)。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 圖 因組結(jié)構(gòu)圖 上圖顯示基因組 部顯示含有共同 3末端的亞基因組。由開放閱讀框架編碼的蛋白質(zhì)的分子量以千道爾頓標(biāo)出，未知功能的獨(dú)立基因也被標(biāo)明（假定的 54星號表示通讀密碼子 (1999)。 草花葉 病毒的傳播方式 及 危害 在我國煙草上， 能借助昆蟲、線 蟲或其它載體傳播， 主要是通過田間的農(nóng)事操作進(jìn)行傳播，并且 傳播流行特點(diǎn)上表現(xiàn)為積年流行病害，所以在生產(chǎn)上多數(shù)表現(xiàn)為逐年加重的現(xiàn)象。 染 豆科牧草 造成 的 苜蓿花葉?。ɡ顗翕O等 ， 2005；南志標(biāo) ， 2001） 。 由核酸 (外殼蛋白 (成 ， 由于其核酸中含有致病基因而對寄主植物具有致病性 。 植物病毒是通過核酸基因組插入或整合到寄主細(xì)胞的核酸基因組中 ， 引導(dǎo)寄主的核酸基因組復(fù)制出大量病毒組成的核酸分子和蛋白亞基 ， 再利用寄主細(xì)胞的酶系統(tǒng)將其核酸與蛋白質(zhì)亞基組裝成病毒 粒體 ，因此病毒對寄主的危害并不是與寄主爭奪養(yǎng)分或產(chǎn)生毒素 ， 而是通過干擾寄主細(xì)胞的正常代謝途徑或代謝過程 ,促使細(xì)胞產(chǎn)生一些對正常生命活動(dòng)有害的物質(zhì)造成的 （沈建國 ， 2005； 陸家云， 1997）。 染寄主后 ， 導(dǎo)致寄主生理代謝異常 ， 進(jìn)而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化 ， 造成寄主光合作用 、 呼吸代謝 、 核酸代謝 、 蛋白質(zhì)代謝 、 激素失調(diào)和花葉 、 變色 、 環(huán)斑 、 壞死和畸形等癥狀的形成 。 一般年份 ， 植物病毒病可使農(nóng)產(chǎn)品減產(chǎn) 20%一30%， 嚴(yán)重的年份減產(chǎn)達(dá) 50%以上 ， 甚至絕產(chǎn) ， 而且對農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)造成不同程度的影響 ， 已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平的提高 （何 永明， 2007；劉 國坤， 2003）。 目前，對 煙草花葉病毒的防治主要有藥劑防治、 利用 植物天然提取物防治 和選用 抗病品 種，其中轉(zhuǎn)基因育種是最有效便捷的方法 。 物 抗病基因 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 物 抗病 基 因 種類 根據(jù) 抗病 基因 編碼 蛋白質(zhì) 保守結(jié)構(gòu)域的不同，大多數(shù)植物抗病基因歸為 5類 （王友紅 等， 2005）： 即核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨 酸重復(fù)的胞內(nèi)受體蛋白； 根據(jù) 核酸結(jié)合 位點(diǎn) 前端 (的不同結(jié)構(gòu)， 碼的這一類基因在植物中主要被分成兩大類 (et 1999) ， 型基因 和 非 型 基 因 。即胞外富亮氨酸重復(fù)的跨膜受體蛋白，如 。即胞 外 富 亮 氨 酸 重 復(fù) 和 胞 內(nèi) 的 絲 氨 酸 / 蘇 氨 酸 激 酶 ， 如 即絲氨酸 /蘇氨酸激酶，如 。 物抗病基因的結(jié)構(gòu) 根據(jù) 生物信息學(xué)分析，目前已克隆的 大部分 抗病 基因編碼蛋白同屬于族。 白最常見的結(jié)構(gòu)域，在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中還有一個(gè)R 構(gòu)域 (1998)。 構(gòu)域共同組成一個(gè)核酸結(jié)合口袋，這個(gè)口袋可以結(jié)合、水解 et 2002)。 包含一些功能未知的保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可能參與下游防衛(wèi)信號的激活。當(dāng) 白的 構(gòu)域過量表達(dá)的時(shí)候，可以非常有效的誘導(dǎo)植物發(fā)生防衛(wèi)反應(yīng) (2007; et 2008)。 根據(jù) N 端結(jié)構(gòu)域之間的不同特征， 白主要被分為兩類 (et 2002; et 1999)。第一類 白的 N 端含有類果蠅 白/白細(xì)胞介素 體結(jié)構(gòu)域（ 被稱作二類 白的 N 端含有一個(gè)復(fù)式螺旋（ 構(gòu)域，因此被稱為 白的 N 端結(jié)構(gòu)域被當(dāng)作信號區(qū)域 (2007)。實(shí)際上，一些 構(gòu)域的過量表達(dá)可以誘導(dǎo)防衛(wèi)信號 (et 2004; et 2009)，但是目前沒有報(bào)道 構(gòu)域的過量表達(dá)有相似的功能。 白的 C 端是富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)（ (1997)。 構(gòu)域參與并特異識別 白 (et 1998; et 1998; 2002; et 1999)。 同的結(jié)構(gòu)域之間存在 互作。 構(gòu)域都和它們各自的 N 端相互作用 (et 2007; et 2005; et 2002; 2006; et 2006)。 構(gòu)蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 域也和 構(gòu)域發(fā)生功能互作 (2006)。 物抗病基因作用方式假說 R 蛋白與 子的 特異性互作是 生 的 必要 條件 ，而其 互作 主要 存在兩種模式 ： 直接 作用 模式 與間接作用 模式。直接 作用 模式即激發(fā)子 /受體模式：子 （激發(fā)子）直接與 R 蛋白（受體）相互作用，從而觸發(fā)受侵染部位細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞過程，激活其他防衛(wèi)基因的表達(dá)，產(chǎn)生超敏反應(yīng)。 植物 R 蛋白也可以間接的識別病原物 白，即 間接 作用 模式 。 目前科研人員針對此模式提出如下 3 種假說。 1）防衛(wèi)假說：病原物 因編碼的蛋白主要作用于“衛(wèi)兵蛋白”，抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)。 R 蛋白發(fā)現(xiàn)衛(wèi)兵蛋白受到攻擊后，能激活植物的防衛(wèi)反應(yīng)，限制病原物在植物體內(nèi)的擴(kuò)散 (2001; 1998)。如：丁香假單胞菌的 擬南芥的 白（衛(wèi)兵蛋白）相互作用，激活了 白 et 2002)； 切 以激活 蛋白 2003; et 2003)；切擬南芥的 白，可以激活 蛋白 et 2003)； 馬鈴薯的 白相互作用，可以激活 蛋白 2003)。 2）“陷阱”模型：病原物 因編碼的蛋白（也稱為病原物效應(yīng)子）誤將與靶蛋白相似的蛋白作為靶標(biāo)，即假靶標(biāo)充當(dāng)了病原物效應(yīng)子的陷阱。假靶標(biāo)只是誤導(dǎo) 別，并沒有具體的功能。假靶標(biāo)的出現(xiàn)是自然選擇的結(jié)果，當(dāng)植物含有 R 基因時(shí)，保衛(wèi)蛋白與病原物效應(yīng)子相結(jié)合，增強(qiáng)對病原物的識別；當(dāng)植物不含 R 基因時(shí)，假靶標(biāo)與病原物效應(yīng)子競爭性結(jié)合，保衛(wèi)蛋白傾向于不和效應(yīng)子蛋白相結(jié)合，避免被效應(yīng)蛋白修飾。假靶標(biāo)和病原 物效應(yīng)子結(jié)合后，不會引發(fā)抗病反應(yīng)，但不會增加植物的感病性 (2008)。 3）誘餌開關(guān)模式： R 蛋白通常處于失活狀態(tài)。病原物效應(yīng)子先和“誘餌蛋白”相互作用，當(dāng) R 蛋白監(jiān)視到誘餌蛋白發(fā)生變化后， R 蛋白的 構(gòu)域結(jié)合 除分子內(nèi)的相互作用， 構(gòu)域從失活狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)狀態(tài)，即開關(guān)被打開，進(jìn)而激活防衛(wèi)反應(yīng)。 物抗病基因作用途徑 當(dāng)植物的 R 基因和病原物 因發(fā)生互作后，植物被侵染的組織會產(chǎn)生而誘導(dǎo)未被侵染的植物組織產(chǎn)生抗性 ，即系統(tǒng)獲得抗性（ 產(chǎn)生經(jīng)歷了一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過程，需要植物防衛(wèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。植物主要的防衛(wèi)信號途徑至少有兩個(gè)：水楊酸（ 賴途徑和非 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 依賴 （ 茉莉酸 /乙烯（ ） 途徑 (998;001)。 徑 ： 介導(dǎo)植物局部防衛(wèi)反應(yīng)（ ， 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生 信號分子。當(dāng)植物受到侵染后，侵染點(diǎn)附近細(xì)胞中的 量上升。隨后，植物其它組織中的 量也會上升，一些 程相關(guān)）蛋白開始表達(dá)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。在植物與病毒互作中， 沒有通過降低胞間連絲的排阻極限來抑制病原物 在體內(nèi)的擴(kuò)展 ，但 卻 對病原物在表皮細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生抑制作用(2002)。 水楊酸羥化酶可以使 成兒茶酚，減少 植物體內(nèi)的積累。當(dāng) 因后，不能積累 病性增強(qiáng)。盡管這些轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞仍然發(fā)生 是在接種 et 2000;et 1997)。 對感病煙草植株進(jìn)行阿司匹林或者 理，可以減少其體內(nèi)的積累 ( 1997; et 1983)。在 導(dǎo)下，被染過的心葉煙（ 成胼胝質(zhì)，可能用來影響胞間連絲的通過能力，提高抗病性 ( 2002)。在被 染的 因型煙草中，傷誘導(dǎo)蛋白激酶）被激活，當(dāng)把這種物質(zhì)以納摩爾的濃度應(yīng)用在葉片上時(shí)， 導(dǎo)蛋白激酶）被激活，相關(guān)防衛(wèi)基因的轉(zhuǎn)錄子不斷積累，葉片對 染的抗性增強(qiáng) (et 2003)。 徑： 攜帶 陷基因的寄主植物在受到軟化腐爛真菌侵染時(shí)，感病性并沒有增強(qiáng)，這說明植物還有其它一些防衛(wèi)途徑， 即 徑。 在擬南芥中， 同調(diào)控 因的表達(dá)， 如 其中 表達(dá)伴隨著 號途徑的激活。在茉莉酸的合成過程中，會產(chǎn)生有生物活性的中間體，類似于茉莉酸的衍生物。這些化合物影響各種生理過程，包括果實(shí)成熟、不同花粉的產(chǎn)生、根的生長、卷須盤繞、植物對昆蟲和病原物的防衛(wèi)反應(yīng) (1997)。 誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ 是必需的。 防衛(wèi)反應(yīng)中的功能是由 現(xiàn)的，他們提供了植物受傷、茉莉酸形成和蛋白激酶抑制子基因誘導(dǎo)之間的證據(jù) (1992)。茉莉酸在植物受到傷害和昆蟲取食時(shí)產(chǎn)生的反應(yīng)中有重要作用 (1995)；而乙烯和茉莉酸能夠相互作用，誘導(dǎo)馬鈴薯對損傷產(chǎn)生反應(yīng) (O1996)。當(dāng)植物受到傷害時(shí)，乙烯會在葉片中瞬間迅速的產(chǎn)生。通過采用突變體或者涂抹化學(xué)抑制子，可以抑制植株乙烯的產(chǎn)生或者對乙烯的敏感性 ，都會對茉莉酸途徑的誘導(dǎo)產(chǎn)生負(fù)面影響。 物 抗病 反應(yīng)的 信號元件 在植物的防衛(wèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，不管是 徑還是 徑，都有很多信號 元件 調(diào)節(jié) 者 生成、積累，促進(jìn)或者抑制這些途徑，從蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 而影響植物產(chǎn)生抗性。 肽酰精氨酸脫亞氨酶類 ( 可以 催化肽酰精氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼釟埢?( 目前 已經(jīng) 知道，部分結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)經(jīng)瓜氨酸化修飾后與相關(guān)疾病病理機(jī)制有關(guān) （何香 ， 2010） 。 脂肪酶 因缺失導(dǎo)致 R 基因介導(dǎo)的抗病信號阻斷 ( 2000) 。 因產(chǎn)物與甘油三酰脂酶有一定同源性 , 能與信號分子的合成和降解有關(guān)（ 1998）。 能與某些信號分子合成和降解有關(guān)，它們在 上游將抗病信號放大。 理能增加 因的表達(dá)，說明 以正向反饋調(diào)節(jié)這兩個(gè)基因的表達(dá)。 與了一個(gè)上調(diào)調(diào)節(jié)環(huán)路，這個(gè)環(huán)路增加了 此激活了 賴的防衛(wèi)反應(yīng) (et 1999)。 三酰甘油脂肪酶基因同源，是一種脂肪酶蛋白，對于抗病基因介導(dǎo)植物抗性是必不可少的(et 2001; et 1999)。 因缺失導(dǎo)致植株更加感病，不能誘導(dǎo) 因的表達(dá)以及 積累。 另一種脂肪酶，可以水解某種脂質(zhì)底物而起作用，可以介導(dǎo) R 蛋白產(chǎn)生抗性 (et 1998)。經(jīng)過序列比對，本生煙的 擬南芥的 有保守的絲氨酸、天冬氨酸和組氨酸殘基 (et 1999)。 病程 相關(guān)基因 非 表達(dá)子 1（ of , 調(diào) 控 植物病害 抗性 的一個(gè)關(guān)鍵基因， 是 植物基礎(chǔ)抗性 以及 植物抗病基因決定的抗性的重要調(diào)控因子 ， 在調(diào) 節(jié) 和平衡 水楊酸和 茉莉酸 信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用 （ 張紅志 , 蔡新忠 ， 2005） 。 非表達(dá) 因可以編碼 游的信號組件，抑制 積累，是 徑一個(gè)重要的調(diào)控蛋白， 叫做變體不能表達(dá)防衛(wèi)基因 ao et 1994; et 1995; et 1997)。 結(jié)合于 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子互作，表明能會改變防衛(wèi)基因轉(zhuǎn)錄因子的活性 (et 1999)。 組成型三重反應(yīng)突變體（ , 乙烯突變體 的一種， 在 沒有乙烯處理的條件下， 能缺失型突變體的白化苗和成株都表現(xiàn)出組成 型的乙烯反應(yīng)，表明 乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上起著負(fù)調(diào)控的作用。通過雙突變體分析，表明 乙烯受體的上位性基因，即 于乙烯受體的下游（ et 1993）。 基端與 酶類似，而且激酶活性為其功能所必須，或許表明 為 聯(lián)反應(yīng)起作用（謝 芳，2007）。 乙烯反應(yīng)的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，在乙烯受體的下游發(fā)生作用 (et 1998; et 2003; et 2008)。 因已經(jīng)被克隆，據(jù)推測它編碼了一個(gè)絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶 (1993)。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 植物生長素原初反應(yīng)基因包括 3 個(gè)主要類別 ， 分別是 1998; 2002)。 因 屬于 因家族 ， 是 茉莉酸 生長素信號途徑中的一個(gè)重要成員 , 它能夠以 底物進(jìn)行 同時(shí)它還參與了 導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng) (et 1998)。 1994 年 篩選獲得了對 植物毒素冠菌素（ 敏感的擬南芥突變體 （ , et 1994）， 白是茉莉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子，該蛋白的缺失突變能夠?qū)е轮参飭适兄匾能岳蛩胤磻?yīng)（ 閆健斌， 2010）。 所有 變體都對茉莉酸甲 酯不敏感， 表現(xiàn)為雄性不育 ， 易感病蟲害，而且失去了對茉莉素的正常反應(yīng)，如茉莉素誘導(dǎo)的基因表達(dá)，茉莉素誘導(dǎo)的花青素積累和側(cè)根形成等 （陳 艷，任春梅， 2011） 。 點(diǎn)的下游對 徑進(jìn)行負(fù)調(diào)控。 碼了一個(gè)茉莉酸敏感缺陷基因， 變體是雄性不育的，對甲基化茉莉酸的生長抑制作用沒有反應(yīng)，不能表達(dá)茉莉酸調(diào)節(jié)基因，對壞死營養(yǎng)的病原微生物表現(xiàn)出很強(qiáng)的感病性。 參與 信號原件之一，是多個(gè) R 基因激發(fā)抗病信號的一個(gè)必須基因。 功能定位于產(chǎn)生活性氧中間體（ 游，植物發(fā)生超敏反應(yīng) (前（ 2001； 1996； ， 2000） 。0個(gè)氨基酸的鋅指結(jié)構(gòu) (et 1999)。 值得注意的是， 植物中和 接互作。 植物防衛(wèi)反應(yīng)中可以通過降解靶蛋白調(diào)節(jié) R 基因信號。 白也包含一個(gè) 域，這個(gè)區(qū)域是 結(jié)合位點(diǎn) (2002)。 能與 結(jié)合，在不同的多蛋白復(fù)合體的組裝和構(gòu)象調(diào)節(jié)中起到伴侶的作用 (2002)。植物的 號傳導(dǎo)體的亞基相聯(lián)系。 基因介導(dǎo)的植物天然免疫反應(yīng)中重要的信號分子。 因在 擾 技術(shù) 擾 et 2001)侵染或者阻止轉(zhuǎn)座子元件的隨機(jī)整合中發(fā)現(xiàn)的。 體的形成 。 小 成熟是由 異的核糖核酸酶 內(nèi)源核酸內(nèi)切酶催化的一個(gè)分段式過程，這種核酸內(nèi)切酶被稱為 包含了核糖核酸酶 及 合的區(qū)域。 體形成所蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 必需的，但不是長 成所必需的。 翻譯成長的轉(zhuǎn)錄子，首先由細(xì)胞核內(nèi)的 工 (2002; et 2003)， 然后由核向外運(yùn)輸受體輸?shù)郊?xì)胞質(zhì) ( 2004)。當(dāng) 運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)以后，將由 一步加工 (2001)，產(chǎn)生 21 個(gè)核苷酸長度反向互補(bǔ)的2001)。 在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了四種類似 白（ 其中三種參與了不同來源的 加工 (et 2004)。 工 體，需要兩種蛋白來完成： et 2003; et 2004; 2004)。植物病毒 產(chǎn)生需要 同參與了 形成。 默效應(yīng)子復(fù)合物的組裝 。含有反向互補(bǔ)構(gòu)造 核蛋白粒子（ 后被整合到 導(dǎo)沉默復(fù)合體（ (2000)。 有一個(gè)單鏈 有 效應(yīng)子復(fù)合體通常被稱作 含有 效應(yīng)子復(fù)合物通常被稱作 et 2002)。任何一個(gè) 者 包含 白家族的一個(gè)成員， 結(jié)合。 組裝依賴 2004; 2001)，這反映了 合物和 預(yù)組裝的 象、組成發(fā)生變化時(shí)需要 合物中的單鏈 一個(gè) 白緊密結(jié)合：在親和純化 ， 不能影響小 白的結(jié)合 (2004)。 白的分子量大約為 100含兩個(gè)保守的區(qū)域： 2002)。 白的 域和 H 家族的一些成員非常相似 (2004)，由于 H 切割 合物中的 ，所以 白應(yīng)該切割 合體靶標(biāo)中的目標(biāo) 剪切和翻譯抑制 。 的單鏈 以引導(dǎo)與其序列特異互補(bǔ)或者接近互補(bǔ)的目標(biāo) 降解 (2002; 2004)。目標(biāo) 互補(bǔ)區(qū)域的中部進(jìn)行剪切 (2001)。由導(dǎo)的剪切反應(yīng)并不需要 2001)，在 多次剪切中要求被剪切的 物釋放，如果有 參與， 效 率會更高(2002)。這可能說明 旋酶參與了反應(yīng)，可以輔助 合物中釋放，或者重新組合核酸內(nèi)切酶進(jìn)行另一輪的目的別。 核物催化靶標(biāo) 酸二酯鍵水解，軟化 5磷酸基和 3羥基 (2004)。這種水解反應(yīng)是對臨近 2羥基的親核攻擊和對一個(gè) 2,3環(huán)狀磷酸酯中間產(chǎn)物軟化產(chǎn)生的。靶標(biāo) 水解反應(yīng)需要鎂離子的參與，與蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 體加工成 發(fā)生的水解反應(yīng)類似。 酸酶是一個(gè)亞基，是沒有核酸內(nèi)切酶活性的；因?yàn)樽鳛橐粋€(gè)微球菌核酸酶蛋白家族的一員，它應(yīng)該產(chǎn)生 3磷酸基而不是 5磷酸基。 白自身可能是 以作為核酸酶。 調(diào)節(jié)子 。 默可以控制靶標(biāo)基因下游基因的表達(dá)，但是自身也被調(diào)節(jié)。例如，在植物和線蟲中，沉默信號在細(xì)胞間傳遞引起系統(tǒng)沉默，需要賴的 合酶（ 參與。 在很多生物中，由 導(dǎo)的 默是抵抗 毒和轉(zhuǎn)座子元件的一種內(nèi)在免疫反應(yīng) (2001; 2003)。在植物病毒和昆蟲蜂窩病毒中發(fā)現(xiàn)了抵抗寄主免疫反應(yīng)的防衛(wèi)策略 (2002)。這些病毒可以表達(dá)抑制子，例如 合蛋白，它可以干擾寄主細(xì)胞的沉默機(jī)制。番茄矮叢縮病毒的 白已經(jīng)和 21 個(gè)核苷酸的 合物共結(jié)晶出來，是一種病毒抑制子 (et 2003)。 白的同型二聚體和 糖 于 合物末端堿基對上方的兩個(gè) 螺旋處。這種結(jié)合使 白可以區(qū)別 核物和 論 長的還是短的。病原物的其它 默抑制子把 作靶標(biāo)，或者限制系統(tǒng)沉默信號從被侵染的細(xì)胞向外傳播。 原料產(chǎn)生 是它和腺苷酸脫氨基酶（ 化的 成過程相競爭，這個(gè)過程將腺苷酸轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤。這種合成反應(yīng)不僅使 靶標(biāo) 再具有互補(bǔ)性，而且使 能很好的作為 原料 (2002)。在線蟲基因篩選過程中，發(fā)現(xiàn)了另一個(gè) 個(gè)調(diào)節(jié)子含有核酸外切酶區(qū)域。 神經(jīng) 元中特異表達(dá)，喪失該蛋白功能的突變體神經(jīng)元中 擾增強(qiáng)。生物化學(xué)分析表明， 好的底物。 植物抗病毒防衛(wèi)反應(yīng)中的作用 在植物中， 默以兩種方式減少病毒的積累。第一種方式是限制病毒最初侵染細(xì)胞中的積累。這種方式是通過將病毒 工成病毒成的，通常用來降解外源病毒分子。第二種方式通過產(chǎn)生系統(tǒng)沉默信號并按照病毒傳播的路徑傳播，使距離較遠(yuǎn)的組織產(chǎn)生迅速的抗病毒反應(yīng)。第一種情況稱為恢復(fù)，植物不表現(xiàn)病毒病癥狀。第二種情況稱為植物 作用，植物表現(xiàn)出明顯的病害癥狀，病毒在植物中積累。 鑒定基因功能中的應(yīng)用 為了驗(yàn)證某些基因在特定反應(yīng)中的功能，科研人員通常選擇基因敲除的方蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 式。通過技術(shù)手段使候選基因不表達(dá)，通過觀察植物表型，或者觀察植物和病原物之間的反應(yīng)，來確定這些基因的功能。 基因敲除的一種有效手段。 首先克隆目的基因片段，并在目的片段兩端加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，分別將目的基因正向和反向連入植物表達(dá)載體。將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將含有正向和反向目的基因的片段整合到植物的基 因組中，人為的在植物體內(nèi)形成與候選基因 補(bǔ)的 些 異的切割候選基因的 以達(dá)到沉默目的基因的目的。 物抗煙草花葉病毒的研究進(jìn)展 迄今為止，從不同的寄主植物中，已分離 并 鑒定了 近百 個(gè) 抗病 基因，分別對線蟲、真菌、細(xì)菌等不同的病原物表現(xiàn)抗性 。 其中，包括十余個(gè)抗病毒 R 基因，分別識別 不同植物病毒的 因 （表 。 表 已報(bào)道植物抗病毒基因 抗病 基因 植物 R 基因 結(jié)構(gòu) 病毒 因 參考文獻(xiàn) N 煙草 屬（ et 1994 N 林煙草（ s） 2012 鈴薯（ S. 999 鈴 薯 （ S. 2000 南芥 2000 南芥 態(tài)型（ A 24） et 2002 茄屬（ et 2001 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 鈴薯 （ S. ? 002 茄屬（ p.） 003. 物抗煙草花葉病毒的基因 N 基因。 煙草的 N 基因和煙草花葉病毒的互作是研究最早、最充分的一個(gè)植物病原物互作模型。 1914 年， 現(xiàn)心葉煙 （ 在受到煙草花葉病毒侵染的時(shí)候會產(chǎn)生壞死斑。隨后， 經(jīng)典的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中證明 N. 受到煙草花葉病毒的侵染后，它的一個(gè)顯性基因控制了壞死反應(yīng)的發(fā)生。雖然當(dāng)時(shí) N 基因還沒有被鑒定，但仍然在研究煙草花葉病毒中起到了很大的作用。起初，含有 N 基因的植物被用來估測病毒的相對數(shù)量，因?yàn)檫@些植物中壞死斑的數(shù)量和病毒的數(shù)量成正比。 煙草 N 基因可以對 生抗性 (et 1994)。當(dāng)含有 N 基因的煙草受到煙草花葉病毒侵染后， 48 小時(shí)內(nèi)會在侵染部位產(chǎn)生超敏反應(yīng)，將病毒限制在壞死病斑周圍的一個(gè)小范圍區(qū)域內(nèi) (1934)。用煙草花葉病毒侵染不含 N 基因的煙 草時(shí)，煙草花葉病毒會在這些煙草中無限制的傳播，引起明暗交替的花葉癥狀。 1931) 第一個(gè)觀察到 N 基因介導(dǎo)的 賴于溫度。當(dāng)溫度在 28以下，受到 染的含有 N 基因的煙草會產(chǎn)生 而，當(dāng)溫度在 28以上，含有 N 基因煙草將會喪失產(chǎn)生 能力， 系統(tǒng)傳播。 N 基因功能的喪失是可以逆轉(zhuǎn)的，當(dāng)植物被放回 28以下的環(huán)境中時(shí)， 能將會恢復(fù)。如果煙草在比較高的溫度下被系統(tǒng)侵染后轉(zhuǎn)移到比較低的溫度環(huán)境中，煙草將會因?yàn)橹旅南到y(tǒng) 死亡。 N 基因是通過插入玉米轉(zhuǎn)座子的方法分離得到的 (1994)，主要依據(jù)是 N 基因介導(dǎo)的對 抗性是對溫度敏感并且可逆轉(zhuǎn)。通過交替剪切，N 基因編碼兩個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 N 基因的全長編碼 由于位于 N 基因內(nèi)含子 部的一個(gè) 70代外顯子交替剪接形成。這兩個(gè)產(chǎn)物是 N 基因產(chǎn)生煙草花葉病毒抗性必不可少的。 對 N 基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)： 個(gè)區(qū)域?qū)?N 基因功能的發(fā)揮都是必不可少的。 N 基因主要由煙草花葉病毒復(fù)制蛋白 C 端螺旋區(qū)域激活，即 制蛋白的 50旋區(qū)域，誘導(dǎo) 寄主發(fā)生超敏反應(yīng)，限制病毒在蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 林煙草抗煙草花葉病毒 ( 基因的信號傳導(dǎo)途徑研究 體內(nèi)進(jìn)一步傳播。 因在 N 基因介導(dǎo)的 性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演著重要的角色 (2002)。本氏煙的 大麥 （ 的 接互作 (et 2002; et 2002)。 白是一個(gè)高度保守的真核蛋白，它和參與蛋白質(zhì)降解的 蛋白連接酶相聯(lián)系 (999)?；虺聊瑢?shí)驗(yàn)表明： N 基因功 能的發(fā)揮中都是必不可少的。在煙草和大麥中， 另外一個(gè)多蛋白復(fù)合體 聯(lián)系， 與了蛋白質(zhì)的降解 (et 2002)。如果抑制 組成分子 號小體的兩個(gè)亞小體，可以導(dǎo)致 N 基因?qū)煵莼ㄈ~病毒的抗性喪失。在 沉默的植物中， N 基因介導(dǎo)的植物抗性將會喪失 (et 2004)。在 N 基因介導(dǎo)的煙草花葉病毒抗性中，兩個(gè)線粒體激活蛋白激酶（ 受傷誘導(dǎo)蛋白激酶（ 水楊酸誘導(dǎo)蛋白激酶（ 激活。 信號分子水楊酸（ 茉莉酸（ 乙烯在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中有重要的作用。在表達(dá)水楊酸羥化酶的轉(zhuǎn)基因植物中， N 基因介導(dǎo)的對煙草花葉病毒的抗性被克服，因?yàn)檫@種轉(zhuǎn)基因植物不能積累 et 1994)。當(dāng)含有 間積累 (et 2001)。 N基因。 一種野生煙草，俗名林煙草、南美煙草，原產(chǎn)于南美。 N. 植物界，被子植物門，雙子葉植物綱，茄目，茄科，煙草屬。林煙草的花呈管狀、白色，在葉子上 呈簇狀生長；花長 7 厘米，寬 2厘米，每朵花都會結(jié)出大量的小種子 （ et 1976）。 N基因來源于 林煙草 ( N基因全長 4143 個(gè)堿基對，共編碼 1380個(gè)氨基酸，屬于 蛋白 (et 2012)。 N基因 可以誘導(dǎo)植物對 多數(shù)菌株產(chǎn)生 是， 系除外，這些菌株可以在含有N基因的植物里可以系統(tǒng)傳播并且引起花葉癥狀。 殼蛋白基因的點(diǎn)突變可以誘導(dǎo)含有 N基因的植物產(chǎn)生超敏反應(yīng)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 能 引 起 超敏 反應(yīng) 殼蛋白 的突變位點(diǎn)有四個(gè)，即 11 位、 20 位、25 位和 46 位，分別將 變?yōu)?變?yōu)?變?yōu)?et 1989)。 煙草花葉病毒的轉(zhuǎn)基因植物育種 目前 對煙草花葉病毒的防治主要集中在化學(xué)農(nóng)藥防治和植物 自身 化合物防治方面，通過轉(zhuǎn)基因手段培育抗病煙草品種比較少，主要 是 將煙草花葉病毒外殼蛋白導(dǎo)入煙草 以 培育抗病品種。 1929 年 ， 次 報(bào)道了交叉保護(hù)現(xiàn)