1 前 言 疼痛是由組織損傷所引發(fā)的一種潛在的或實際存在的不愉快的感覺，其產生不僅包括傷害性刺激的傳導，也包括大腦對刺激信息的認知，因此是一種復雜的情感 1。疼痛是臨床上最為常見的癥狀之一，伴隨著多種疾病的發(fā)生，是目前困擾人類最嚴重的 臨床問題之一。從生物學角度上認為疼痛是一種警戒信號，是機體的一種自我保護機制，可以通過神經系統(tǒng)調節(jié)引起一系列針對損傷所產生的防御反應，但是當疼痛持續(xù)時間過長且又無得到相應有效的治療時，疼痛不僅會對患者生理健康產生極大的危害，還會嚴重影響到患者的生活質量。 由中樞或外周神經系統(tǒng) 原發(fā)性疾病和 /或繼發(fā)性功能損傷而引起的疼痛綜合征可稱為神經病理性疼痛 1。神經病理性疼痛發(fā)病機制復雜，治療困難，目前認為有效的藥物治療仍是神經病理性疼痛主要的治療手段 2?，F(xiàn)階段常用的藥物如三環(huán)類抗抑郁藥，抗驚厥藥，阿片類鎮(zhèn)痛藥及非甾體類抗炎藥等，因在療效和劑量上以及產生的不良反應方面都存在一定問題，因而限制了它們的應用 2, 3。由于迄今為止尚無治療神經病理性疼痛的特效藥物，所以針對神經病理性疼痛發(fā)病機制的研究及將其作為藥物作用靶點而進行有效鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)，是目前疼痛領域研究的熱點與難點。 細胞主要有兩種死亡形式：壞死與凋亡。細胞凋亡的概念是 1972 年由 同于細胞壞死，細胞凋亡是機體自身啟動， 有細胞本身主動控制，由基因調控而使細胞自動消亡的過程，因此又稱程序性細胞死亡 4。既往的實驗5本課題組之前的研究表明 9, 10，外周神經損傷可引起脊髓背角神經元細胞凋亡，導致脊髓背角結構和功能的改變，使機械痛刺激與熱痛刺激表現(xiàn)下降，產生痛覺過敏。有研究表明 11周圍神經損傷可引起細胞改變，引起線粒體膜電位失 衡，導致線粒體結構及功能障礙，使得存在于線粒體內的細胞色素 C 通過線粒體上的轉化通道，釋放到細胞質中，繼而與細胞凋亡相關蛋白因子結合形成復合物，進一步裂解及活化與細胞凋亡相關的半胱氨酸 引發(fā)一系列凋亡級聯(lián)反應。通過藥物干預抑制細胞凋亡，可以減輕痛覺過敏，從而達到治療神經病理性疼痛的目的。 右美托 咪啶 （ 美托 咪啶 的活性右旋結構體，是一種新型的高 選擇性 2 腎上腺素受體（ 2 2動劑，具有良好的鎮(zhèn)靜，鎮(zhèn)痛作用及神經保護，臟器保護功能 18。右美托 咪啶 可以通過抑制突觸上 2 受體，抑制去甲腎上腺素的釋放及神經元的興奮 19；抑制電壓門控2 鈣離子通道，阻斷鈣離子超載所導致的細胞凋亡 20, 21。 本實驗通過建立大鼠坐骨神經慢性壓迫型模型，模擬神經病理性疼痛 ，通過腹腔注射右美托 咪啶 ，觀察其對神經病理性痛大鼠的痛行為學及脊髓背角神經元細胞凋亡的的影響，探討右美托 咪啶 對神經病理性疼痛的作用機制及治療效果，從而為神經病理性疼痛的治療提供一定的理論依據及治療手段。 3 背景回顧 疼痛是大多數疾病具有的共同癥狀，是人類共有但是個體差異卻很大的一種不愉快的感覺，它既有生理感覺方面的客觀性，又有心理情緒表達方面的主觀性。疼痛按其發(fā)生的性質，起因及持續(xù)時間長短可分為：急性疼痛和慢性疼痛，其中后者又包括炎性疼痛，癌性疼痛及神 經病理性疼痛。目前關于急性疼痛與慢性疼痛的界限還缺乏統(tǒng)一的標準。比較公認的說法是疼痛超過急性病程 /損傷愈合正常時間或間隔數月或數年又復發(fā)的疼痛可稱為慢性疼痛。急性疼痛又可稱為生理性疼痛，大多為傷害感受性疼痛，約有 2%是與神經系統(tǒng)損害有關的急性神經病理性疼痛。一般急性疼痛不會轉變?yōu)槁?，而神經病理性疼痛轉化為慢性神經病理性疼痛的比例則很高。 1 神經病理性疼痛概述 國際疼痛研究學會將神經病理性疼痛定義為“由神經系統(tǒng)原發(fā)損害或功能障礙所導致的疼痛” 22, 23。神經病理性疼痛的病因包括中樞或外周神經系統(tǒng)受損（脊髓損傷，三叉神經痛），代謝紊亂或營養(yǎng)性疾病（糖尿病性神經痛），感染（帶狀皰疹后遺神經痛，艾滋病性神經痛），神經毒性（長春新堿 ，順鉑，放療），缺血性（腦梗塞，腦卒中），及其他病因（惡性腫瘤 ，硬化?。┑?24, 25。據調查，每 10 萬人帶狀皰疹后神經痛的發(fā)病率大于 25%，三叉神經痛為 27%，糖尿病性神經痛發(fā)病率為 而且發(fā)病率隨著年齡及基礎病變的加重而增加。流行病學調查提示總人口的 6% 8%曾患具有神 經病理性疼痛特征的慢性疼痛，其中一半患者需要藥物治療或其他治療 26。由于神經病理性疼痛產生機制復雜，持續(xù)時間長，疼痛程度重，治療效果差，久而久之會嚴重影響患者生活，工作，飲食及睡眠，產生焦慮或抑郁，導致機體個系統(tǒng)功能失調，免疫力下降并誘發(fā)各種并發(fā)癥，從而嚴重影響患者身心健康。因此，神經病理性疼痛是目前臨床治療的難點之一，是對 醫(yī)生，科學家及整個社會的嚴峻考驗，也是醫(yī)學生物界面臨的重要課題。 神經病理性疼痛是臨床常見的癥狀之一，其病程可從數周到數年不等，其主要的臨床特征有：自發(fā)性疼痛（ 即在沒有可見刺激條件下產生的疼痛；痛覺過敏（ ，是指對機械刺激，冷，熱刺激等傷害性刺激產生的疼痛表現(xiàn)出過強的，夸大的反應；痛覺超敏（ 是指對正常的，非傷害性刺激產生的觸誘發(fā)痛，痛覺倒錯及灼燒痛等 25, 27 4 2 神經病理性痛模型 由于神經病理性疼痛發(fā)病機制復雜，在患者身上研究與疼痛有關的神經機制有悖倫理。因此，利用相應的動物模型開展疼痛機制研究是目前的普遍趨勢，好的動物模型能接近或在極大程度上模擬臨床患者的病理狀態(tài)與病理演變過程，為加深人類研 究認識，把握疾病規(guī)律，尋找藥物作用靶點及最終有效治療疾病提供了最佳途徑。疼痛模型的建立是研究疼痛的重要手段，恰當的模型會在一定程度上推動疼痛學研究的發(fā)展。隨著人們對神經病理性疼痛認識的加深，各種神經病理性疼痛模型也相繼出現(xiàn)，為人類從細胞分子水平對神經病理性疼痛發(fā)病機制進行研究提供了有用的工具。 骨神經慢性壓迫性損傷模型（ CI 1988 年， 8利用鉻制腸線在大鼠坐骨神經分叉處 5度結扎大鼠坐骨神經干，結扎間距約 1 2結扎 4 道，造成輕松結扎的神經水腫，進而鉻腸線嵌壓腫脹的神經而形成慢性束縛性損傷，導致部分神經纖維變性壞死，即造成粗的有髓神經纖維選擇性損傷，而保留大部分傳遞疼痛的 C 纖維。該模型的動物不僅有自發(fā)痛行為，而且還出現(xiàn)熱痛敏，冷痛敏及機械痛敏，且操作簡單，制作成功率高，手術創(chuàng)傷小，術后并發(fā)癥少，動物存活率高，易于掌握，因此是最常用的研究神經病理性疼痛的模型之一。 骨神經部分損傷模型（ 1990 年， 0及其同事在動物麻醉狀態(tài)下，用 8線將坐骨神經干緊緊結扎 1/2 或 1/3，然后檢測動物痛行為表現(xiàn)。由于在這一水平支配外周區(qū)域的神經纖維在坐骨神經中分布是隨機的，所以這種處理方法不會造成特定區(qū)域的感覺喪失，且神經損傷的纖維數量也不固定，因此難以確定哪個脊髓節(jié)短損傷嚴重，故其重復性和定量分析較差，從不同動物得到的結果差異也較大。 神經選擇結扎模型（ 1992 年， 1創(chuàng)建了可以模擬人類皮膚燒灼樣痛的動物模型，方法是結扎大鼠的 6 脊神經或單獨結扎 神經，結扎后機械痛敏迅速出現(xiàn)，冷痛敏和熱痛敏也會在創(chuàng)傷后 1 天出現(xiàn)，這種行為至少可以持續(xù) 4 個月。該模型將損傷神經和未損傷神經的脊髓節(jié)段完全分開，有利于比對研究初級傳入纖維是否或如何參與疼痛的發(fā)生。此模型大鼠有時會出現(xiàn)自殘現(xiàn)象，且操作復雜，損傷大，出血多，易感染。 5 骨神經分支選擇結扎模型（ 2000 年， 2結扎坐骨神經終 末分支中的脛神經和腓總神經，保留腓腸神經分支，從而建立了坐骨神經 分支選擇結扎模型，即半保留神經切斷模型。該模型可觀察損傷的初級傳入神經元與鄰近的未受損傷的初級傳入神經元的變化，機械性痛敏表現(xiàn)顯著是該模型的一個特點，熱刺激可引起小鼠屈足時間延長但熱痛閾改變不明顯。 根節(jié)慢性壓迫模型（ of 此模型是將一根細鋼柱植入大鼠 間孔，壓迫背根神經節(jié)，從而出現(xiàn)異常和自發(fā)性疼痛 33。此模型保留了外周初級傳入與傳出的功能，背根神經節(jié)直接受到持續(xù)且穩(wěn)定的慢性壓迫，因此是目前用于研究因腰椎間盤突出，椎間孔狹窄和脊椎骨折所造成的神經根性疼痛的較為理想的動物模型。 3 脊髓背角神經元與神經病理性疼痛 在對神經病理性疼痛的機制研究中發(fā)現(xiàn)，存在于脊髓的多種受體，通道以及胞內信號轉導分子都參與了神經病理性疼痛信息的傳遞過程。其中，脊髓背 角神經元在疼痛的感知和傳遞過程中發(fā)揮著非常重要的作用。脊髓背角 是傷害性信息傳入通路的第一級中轉站，是疼痛信息傳遞與整合的初級中樞 21。 髓的解剖重構 正常情況下，低閾值的 摸感覺神經元）存在與脊髓膠質區(qū)的第和第層，高閾值的 C 纖維（痛覺神經元）位于脊髓背角的第層 34。當神經受損后， 入到脊髓背角淺層，占據 C 纖維的突觸部位與二級神經元發(fā)生新的突觸聯(lián)系。這樣正常接收高閾值感覺傳入的層神經元，開始接收來自于 成正常的觸覺刺激被誤認為是疼痛刺激，出現(xiàn)異常痛敏 35, 36。 樞敏化 有實驗發(fā)現(xiàn)，當外周神經受損引起神經病理性疼痛時 脊髓背角神經元呈現(xiàn)出興奮性持續(xù)增強的表達，即中樞敏化，其特點是具有長時程增強效應（ 37。這種神經元的興奮性從短期增強轉化到 持久的增強，可能與神經病理性疼痛的維持有關。實驗顯示 38, 39，脊髓 體顯然參與了神經元興奮性的改變。正常情況下， 體不參與突觸傳6 遞，因為在靜息膜電位下，該受體被 阻斷，此時即使谷氨酸與 體結合也不會引起離子通道的開發(fā)。由于神經受損，傷害性強制刺激引起突出后膜持續(xù)去極化，去除了 的阻斷作用，使 體通道開放，引起 量內流。 度超載可以激活蛋白激酶，如 ， 性的增加，可以加強 體和非 體介導的電活動，提高脊髓背角的興奮性遞質與受體作用 40。此外 度升高還會激活 鈣調蛋白敏感位點，進一步激活 生大量 作為逆行性遞質，作用于突觸前膜，促進谷氨酸釋放。大量的谷氨酸聚集在突觸間對中間神經元產生細胞毒性，進一步引起細胞凋亡 9, 41。 樞去抑制 正常情況下，抑制性中間神經元可以抑制 C 纖維中樞端釋放神經遞質，同時還可抑制脊髓背角神經元的興奮性，起著抑制傷害性信息傳遞的作用。當周圍神經受損后，脊髓背角淺層的抑制性中間神經元出現(xiàn)跨突觸的興奮毒性改變，發(fā)生變性。而由于神經受損，引發(fā) 流，激活蛋白激酶 以磷酸化細胞膜上的 體，使突觸前膜釋放的 少，使得傷害性傳入刺激在脊髓背角淺層誘發(fā)的抑制性突觸后電位明顯下降或消失， 導致中樞抑制性中間神經元對傷害性刺激信息傳遞的抑制作用減弱，從而產生痛覺過敏 42, 43。 4 細胞凋亡相關蛋白因子 細胞凋亡過程中涉及到一系列的蛋白酶，由這些蛋白酶所構成的級聯(lián)反應實際上是凋亡過程的核心。 白家族 凋亡信號在細胞凋亡的啟動，傳遞和執(zhí)行過程中，絕大部分需要半胱氨酸 參與 44。功能可以分為兩類：第一類是起始酶，主要包括 二類是執(zhí)行酶，主要包括 始酶位于細胞凋亡途徑的上游，可以被自激活，一般含有一個較長的原結構域，凋亡開始時，起始酶在接收到死亡信號后能夠自行激活。而執(zhí)行酶位于凋亡途徑的下游，一般含有較短的原結構域，它們的激活則需要起始酶的加工。 執(zhí)行凋亡的主要酶類， 原（ 包括 3 個部分：原結構域（ 大亞單位（ 小亞單位（ 酶原本身的活性7 很低，但可以通過被其他酶（包括自身）切割所激活。一旦結構域及大，小亞單位之間的連結被自主切除，大小亞單位就會相互作用形成一個異二聚體，兩個異二聚體再寡聚化形成一個異四聚體，這就是活化形式的 化的 據 將 物大致分為 4 類：第一類底物是經酶切后能被活化，如 身以及 2 等；第二類為酶切后底物失活，如 化亞單位，視網膜細胞瘤蛋白等；第三類為酶切后底物結構發(fā)生改變，如 A 型和 B 型細胞核 ；第四類為酶切后凋亡作用尚不清楚的底物，如聚 細胞凋亡中發(fā)揮的作用主要有以下三個方面： 1)滅活細胞凋亡發(fā)生的抑制劑，如 降解，滅活特定的核酸內切酶抑制劑，使核酸內切酶被釋放出來，作用于凋亡細胞核 起 特征性降解；又如 這一過程中， 可產生促進細胞凋亡的物質； 2)直接破壞裂解細胞結構，如 裂解核纖層蛋白而引起核纖層的崩解，并導致染色質的濃縮；同時 識別并裂解幾種參與細胞骨架調節(jié)的蛋白，包括凝膠蛋白，局部粘附激酶等； 3)裂解某些功能性的酶蛋白 45。 聯(lián)反應中處于核心地位，不同的蛋白酶可以切割并激活 原，活化后的 作用于相應的底物，參與細胞凋亡級聯(lián)反應， 活化標志著細胞凋亡進入不可逆階段 46。 白家族 白家族是細胞中一組至關重要的凋亡蛋白。迄今為止，在哺乳動物，線蟲和病毒中已發(fā)現(xiàn)并確定了近 20 個 白家族成員，按功能可將其劃分為兩大類：一類是具有促凋亡（ 能的蛋白，主要包括 ；另一類則具有抗凋亡（ 能，主要包括。 族中最先被發(fā)現(xiàn)的蛋白，它主要存在于線粒體膜，光面內質網及核膜，其羧基端為疏水性，含有一個由 19個氨基酸伸展成的跨膜結構。 能的發(fā)揮很大程度上依賴于其在亞細胞膜上的定位， 羧基末端作為信號錨序列插入線粒體外膜，而 離的氨基末端的大部分暴露于胞漿，借此可與胞漿內各種蛋白或其他鄰近的也被錨定在線粒體膜上的與 似的分子（如 互作用。 高表達能夠 阻斷多種因素誘導的細胞凋亡，抑制凋亡特征的出現(xiàn)，包括早期信號 解，細胞的固縮，胞核的濃縮等。它不影響細胞周期的進程，不讓細胞進入 M 期，而是進入 ，即它只促進細胞的存活。 制8 細胞凋亡的可能作用機制有以下幾種： 1)抑制線粒體釋放促進凋亡的因子，如細胞色素 C，凋亡誘導因子（ 2)細胞內抗氧化作用，活性氧損傷 是 細胞凋亡的一個誘因，而 高表達可減少氧自由基的產生和脂質過氧化物的形成；3)抑制鈣離子跨膜流動； 4）抑制促凋亡調節(jié)蛋白如 細胞毒作用 45, 47。 5 脊髓背角神經元凋亡在神經病理性疼痛中的作用 細胞凋亡不僅在生理狀態(tài)下，對細胞的選擇，分化及衰老細胞的 清除 起重要作用，而且參與多種疾病的發(fā)生過程。 1990 年，有研究發(fā)現(xiàn)周圍神經損傷后神經元的早期病理變化包括染色質深染及細胞塌陷皺縮，因易被深染 而被稱為“黑色神經元或暗神經元”，而其進一步變性退化，最終走向死亡的結局 5。“黑色神經元”的出現(xiàn)表明細胞構架蛋白已被破壞，代表可逆性神 經元損傷，提示與細胞凋亡有關。 2004 年， 48發(fā)現(xiàn)阻斷谷氨酸 體可以減少凋亡基因的表達及所謂的“凋亡狀態(tài)”。 2005 年和 2006 年， 3,49和傅開元 50等也分別在神經病理性疼痛及炎性疼痛模型中發(fā)現(xiàn)了脊髓神經元細胞凋亡。有實驗發(fā)現(xiàn) 51，在周圍神經損傷引起的神經病理性疼痛中，給予制劑 制劑 現(xiàn)當抑制了 白因子活性后，能顯著降低脊髓細胞死亡，降低機械痛敏與熱痛敏。 本課題組之前的研究表明 9，在慢性坐骨神經壓迫性損傷模型中，通過 測，在 后觀察到了大鼠脊髓背角神經元細胞凋亡，這與近年來研究證實的：凋亡是外周神經損傷后脊髓神經元死亡的重要方式，這一結果相一致。 然而關于脊髓背角神經元細胞凋亡與痛覺過敏之間是否存在相一致的因果關系，目前仍未有定論。 根據現(xiàn)有的研究分析，脊髓神經元細胞凋亡參與痛覺敏化的形成機制可能與以下因素有關： （ 1） 抑制性中間神經元的凋亡：有研究發(fā)現(xiàn) 5, 6，外周神經損傷可引起脊髓中間神經元發(fā)生變性，坐骨神經結扎后脊髓背角淺層（層）的抑制性 中間神經元發(fā)生結構的改變，在光鏡下觀察到核深染，即為“黑色神經元”。而通過采用 標對 鼠腰段脊髓切片觀察發(fā)現(xiàn)，脊髓背角神經細胞發(fā)生細胞凋亡，而凋亡的這些神經元細胞是能夠釋放抑制性遞質（如 抑制性中間神經元 7。由于抑制性中間神經元的凋亡，使得脊髓背角傳導痛覺的傷害性感覺神經元異 常興奮，從而產生痛覺過敏。鞘內注射 體激動劑，可拮抗外周神經損傷所引發(fā)的痛覺過敏，進一步證明抑制性中間神經元的凋亡是引起神經病理性痛的重要因素 52。 9 （ 2） 軸突芽生的形成：芽生是未受損傷的神經元軸突生長增長，并走向損傷區(qū)域以代替退行性變軸突的一種反應，是神經損傷后進行修復的一種方式。有研究發(fā)現(xiàn) 53，在外周神經損傷的大鼠神經病理性疼痛模型中，脊髓背角淺層神經元發(fā)生凋亡后留下空隙，脊髓深層的未受到損傷的神經纖維可通過芽生的方式，使 軸突伸入到脊髓背角淺層，與淺層的傷害性神經元構成新的突觸聯(lián)系，使傷害性刺激信息傳導通路發(fā)生異常放電，引起神經興奮性升高，產生痛覺過敏或痛覺異常。通過使用 體拮抗劑 夠抑制神經損傷誘導的芽生，這可能是由于脊髓背角發(fā)生的不同程度的神經元凋亡 54。 6 右美托 咪啶 的藥理作用與臨床應用 2 腎上腺素受 體（ 2 2泛存在于中樞與周圍神經系統(tǒng)，刺激突觸前 2通過負反饋機制，調節(jié)腎上腺素的釋放；刺激突觸后 2引起神經細胞膜超極化。 2過與 G 蛋白偶聯(lián)，產生不同的細胞內信號轉導機制，包括：抑制腺苷酸環(huán)化酶活化，降低細胞內 平；抑制蛋白激酶 A 及其所調控的蛋白質磷酸化；激活鉀離子通道，使細胞膜超極化，減少神經元放電；抑制電壓門控鈣離子通道等 20。 右美托 咪啶 是一種新型的高選擇性 2 腎上腺素受體激動劑， 其 與 2 和 1受體 親和力之比 為 1620:1， 是另一種 2 腎上腺素受體激動劑可樂定的 8 倍 55, 56。右美托 咪啶起效 時間約 15 分鐘，持續(xù)輸注 1 小時可達峰 濃度，具有雙相半衰期，分布半衰期約 6 分鐘，清除半衰期約 2 小時。右美托 咪啶 有較高的蛋白結合率（ 94%）和較大的分布容積。 右 美托 咪啶 具有鎮(zhèn)靜，鎮(zhèn)痛，抗焦慮，抑制交感神經活性，穩(wěn)定血流動力學，有一定的臟器保護作用，能減少麻醉藥用量，呼吸抑制作用輕的特點 57。美國藥品與食品管理局于 1999 年批準將其應用于成人重癥監(jiān)護病房短 時間（ 24 小時）的鎮(zhèn)靜與鎮(zhèn)痛。 2009 年我國食品藥品監(jiān)督管理局批注用于全身麻醉時的誘導和機械通氣時的鎮(zhèn)靜。有報道指出，在缺血，術后急性疼痛，人類頑固性癌性疼痛以及福爾馬林誘導性疼痛，角叉菜膠誘導的炎性疼痛等各種疼痛中，右美托 咪啶 都能產生有效的鎮(zhèn)痛作用 58 10 材料 1 實驗動物 健 康成年 鼠 72 只 (動物生產許可證號 : ） 2009用許可證號： 體重 180蘭州大學醫(yī)學實驗動 物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于清潔級動物實驗中心，環(huán)境安靜，有良好的通風 ，室溫維持在 22濕度約 55%， 12 照明 /12 小時黑暗，自由攝食水，每日更換墊料。 2 主要儀器 維絲 美國 司 輻射儀 成都泰盟科技 有限公司 電子顯微鏡（ 日本 生物照相顯微鏡（ 日本 學圖像分析處理系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司 3 主要試劑與藥品 鹽酸右美托 咪啶 注射液（批號： 10122234） 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司 抗鼠多克隆抗體 美國 司 抗鼠多克隆抗體 美國 司 疫組化檢測試劑盒 北京中杉金橋生物技術有限公司 濃縮型 劑盒 北京中杉金橋生物技術有限公司 多聚甲醛 天津市光復精細化工研究所 2蒸水等 4 主要試劑的配制 沖液 （ 1） 液的配制： 11 A 液 2雙蒸水分 溶解定容至1000 B 液 12雙蒸水充分溶解定容至 1000 C 液 ： A 液 19 液 81 （ 2） 沖液的配制： 稱取 9g 于 1000燒杯中。 取 C 液 500入大燒杯中，攪拌，使 全溶解。 大燒杯中加入雙蒸水定容至 900 測 加適量 A 液或 B 液調整溶液至 將溶液倒入容量瓶，定容至 1000分混勻。 %多聚甲醛 （ ， 稱取 40g 多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入 500 800 沖液 ,加熱至 60，持續(xù)攪拌使多聚甲醛充分溶解，滴加少許 1 溶液清亮，最后補足 沖液定容至 1000分混勻，于 4冰箱內保存?zhèn)溆谩?12 方法 1 實驗動物分組 健康成年雄性 鼠 72 只，體重 180 220 g，采用隨機數字表法，分為3 組：假手術組（ S 組）、 慢性神經病理性痛組 （ C 組）和右美托咪啶組（ D 組） ，每組 24 只。 每組大鼠又被隨機分為三個亞組： 3d 組、 7d 組和 14d 組，每個亞組 8 只。 于術前 1 d、術后 3、 7、 14 d（ 3） 上午 測定 機械痛閾和熱痛閾， 并于 3 時測定 行為學指標 后 每組 隨機處死 8 只大鼠， 其中 6 只用于免疫組織化學方法檢測脊髓背角 表達，另 2 只用 透射電鏡觀察脊髓背角淺層神經元超微結構 。 2 實驗動物模型制作 （ 1）參照 8的方法制作 坐骨神經慢性壓迫損傷模型（ 具體操作如下：大鼠稱重后 腹腔注射 10%水合氯醛 350 mg/醉大鼠 ，俯臥位固定， 備皮消毒后縱向切開右下肢股骨中段皮膚，鈍性 分離肌肉暴露坐骨神經 主干 ，于 接近分叉處之前的 坐骨神經干 上 用 4 弛 結扎 4 道，結扎強度以引起 后肢 肌肉輕度短暫的顫動為宜，不影響神經外膜的血運為限。 （ 2）假手術組 （ S 組） 僅暴露坐骨神經，不結扎。 （ 3） 術畢傷口局部敷以青霉素粉預防感染，逐層縫合切口 ， 術后 常規(guī)籠養(yǎng) 。 （ 4） 所有手術操作均由同一人完成 以保證實驗一致性。 3 給藥劑量與方法 D 組于 坐骨神經 結扎術畢 開始至 處死前， 腹腔注射 右美托 咪啶 50 g/1次 /d， S 組和 C 組 注射等容量生理鹽水 。 4 行為學觀察 般情況 在術前 1 天及手術后 2 周內，每 1觀察一次，包括大鼠的的步態(tài)及術13 側肢體的姿勢，局部皮膚的改變，是否出現(xiàn)懸空，跛行及肌張力的改變，有無舔舐肢體的現(xiàn)象。 痛閾 (測定 參照文獻 62介紹的方法， 采用 輻射儀， 將大鼠置于 3 的玻璃板上，熱輻射光源照射右后肢足底中部，記錄從照射到出現(xiàn)縮足反應的時間，即為熱縮爪潛伏期。連續(xù)測定 3 次， 每次 間隔 5 次照射時間不超過 20 s，取其平均值。 整個測試過程中保持安靜。 械 痛閾 (定 參照文獻 63介紹的方法， 將大鼠置于透明玻璃箱中，底部為 1 鐵絲網，采用 維絲垂直緩慢用力刺激大鼠右后肢足底部，出現(xiàn)躲避、抬足或舔腳動作為陽性反應，纖維絲彎曲 90無反應則為陰性。 維絲的壓力值 為 g，每次至少間隔 30 s。初始刺激強度 g。若出現(xiàn)陰性反應，則選擇高一級強度 g；若出現(xiàn)陽性反應，則選擇低一級強度 g，依此類推，直至出現(xiàn)可誘發(fā)陽性或陰性反應相鄰的 2 個刺激強度后，繼續(xù)依序測定 4 次，采用內推法計算機械痛閾。 5 動物固定及取材 注固定 實驗大鼠在術后 3、 7、 14 d 測定痛閾后， 腹腔注射 10%水合氯醛 400 450 mg/醉 ，開胸暴露心臟，由左心室經 升主動脈插管，連接灌注系統(tǒng)，剪開右心房作為灌注液流出口。先快速灌注生理鹽水約 300清除機體內的血液，觀察流出液顏色，當流出液澄清，大鼠肝臟均勻變白后，即可先快后慢灌注 4%多聚甲醛 約 300 30 分鐘。 材 灌注完畢后，隨即暴露兩側坐骨神經，逆行追蹤暴露與之相連的腰 4腰 5（ 髓節(jié)段，取出 髓組織后，每組 6 份標本置于 4%多聚甲醛 中固定用于免疫組化化學實驗， 2 份在解剖顯微鏡下取 右側脊髓背角，置于 3%戊二醛中固定用于電鏡 觀察 。 14 6 石蠟切片的制作及免疫組 織化學染色 蠟切片的制作步驟 （ 1）固定 將 髓節(jié)段置于 4%多聚甲醛 中固定 24 小時。 （ 2）脫水 組織依次經過梯度乙醇溶液： 75% 80% 90% 95% 100%乙醇 100%乙醇。 （ 3）透明 二甲苯，兩次， 30 （ 4）包埋 組織經二甲苯透明后，用冷風稍干后立即投入 54 56液體石蠟。將預先溶好的干凈石蠟倒入鋼制包埋筐中，后取出浸蠟后的標本，按標記的方向置入蠟溶液中，自然冷卻即可。 （ 5）切片 用切片機將標本切為厚度約 3 5 m 的蠟片。 （ 6）貼片烘烤 將蠟片置 于 45 50左右的溫水中使其完全伸平，然后撈至在防脫載玻片上，濕潤狀態(tài)下及時進入烤箱烤片?？鞠錅囟燃s 40，烤片 1小時。 疫組織化學染色法檢測脊髓背角 達 依照 生物素二步免疫組化檢測試劑盒說明書進行操作，標本染色步驟如下： （ 1）脫蠟 將烤好的烤片置于二甲苯，二甲苯兩次脫蠟，每次 15 （ 2）水化 100%酒精 100%酒精 95%酒精 90%酒精 85%酒精 75%酒精蒸餾水，每級 3 （ 3）置于檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（ ） 微波 15，自然冷卻，用沖液及蒸餾水沖洗， 33 次。 （ 4） 3%過氧化氫去離子水孵育 10阻斷內源性過氧化物酶。之后用沖液沖洗， 33 次。 （ 5）甩干后滴加一抗（ 抗鼠多克隆抗體 ， 工作液濃度前者為 1： 100，后者為 1： 300）， 4孵育 24h。 （ 6）復溫 1h， 沖液沖洗， 33 次。 （ 7）滴加山羊抗兔 體 聚體， 37孵育 20 30 （ 8） 沖液沖洗， 33 次。 （ 9） 色 5 10鏡下控制染色程度，以特異性染色最強而背景基本不著色為準。蒸餾水沖洗終止顯色反應。 （ 10）蘇木素復染 1 2餾水沖洗。 （ 11）梯度酒精脫水： 80%酒精 90%酒精 95%酒精 100%酒精 100%酒15 精，每級 3 （ 12）二甲苯，透明，每次 3 （ 13）中性樹膠封片。 陰性對照：用 替一抗，其他步驟不變，結果均為陰性。 結果判定：在 學顯微鏡下 （ 400） 進行觀察， 棕黃色染色為陽性， 性表達位于胞漿和包膜， 性表達主要位于細 胞核。采用 像分析處理系統(tǒng)測定 光密度值， 每個標本隨機取 3 張切片，每張切片隨機選取脊髓背角淺層（ 層） 6 個不同視野，取其平均值，以反映 表達水平。 7 電鏡標本的制備 (1). 將 3%戊二醛固定液中的脊髓背角組織塊 ，在含 二醛的 二甲砷酸鈉緩沖液（ 細切，放入 4%戊二醛固定液固定 2h。 (2). 1%鋨酸室溫固定 (3). 50%乙醇脫水 30 (4). 70%乙醇脫水 30 (5). 95%乙醇脫水 30 (6). 無水乙醇脫水 30 (7). 氧化丙烯透明 3次，每次 10 (8). 氧化丙烯與 透脊髓組織塊。 (9). 新鮮配制的 5h。 (10). 包埋的組織塊逐漸加溫 (與術前相比， S 組術后 異無統(tǒng)計學意義（ P 與 S 組比較， C 組 和 D 組3 時 短（ 與術前相比， S 組術后 異無統(tǒng)計學意義（ P 與 S 組比較， C 組 和 D 組3 時 低（ P與 C 組 比較， D 組 3 時 高（ P與 比較， C 組 和 D 組 3 時 低（ P與 比較， C 組 和D 組在 高（ P。 見表 2，圖 2。 17 表 2 各組大鼠不同時間點機械痛閾的變化（ g, n=8， x s） 組別 1 3 S 組 組 組 S 組 較， 與 C 組比較， 與 比較， 與 比較， 2 脊髓背角 達的變化 與 S 組比較， C 組 、 D 組 3 時脊髓背角 達上調（ P與 C 組 比較， D 組脊髓背角 達下調（ P與 比較， C 組和 D 組 3 時脊髓背角 達上調（ P。見表 3，圖 3，圖 5。 表 3 各組大鼠不同時間點 達的變化（ n=6， x s） 組別 2 組 組 組 S 組比較， 與 C 組比較， 與 比較， 脊髓背角 達的變化 與 S 組比較， C 組 、 D 組 3 時脊髓背角 達上調（ P與 較， D 組脊髓背角 達上調（ P與 比較， C 組 和 D 組3 時脊髓背角 達上調（ P見表 4，圖 4，圖 6。 18 表 4 各組大鼠不同時間點 達的變化（ n=6， x s） 組別 2 組 組 組 S 組比較， 與 C 組比較， 與 比較， 透射電鏡下大鼠 髓背角神經元超微結構的變化 S 組各時點大鼠 脊髓背角 神經元形態(tài)基本接近正常，細胞核呈圓形，表面光滑，偶有單個凹陷，核仁大而圓且位于核中心，核內常染色質明顯，核膜及細胞膜光滑完整，核周胞質中粗面內質網、核糖體、線粒體等細胞器形態(tài)正常，分布均勻； C 組 神經元發(fā)生異常改變，其中 主要以神經元腫脹為主，胞漿內內質網、線粒體等細胞器腫脹甚至裂解，核結構基本正?；蛞娸p度異型，核膜輕微皺縮，染色 質分布均勻或部分濃縮； 3 時神經元改變明顯加重，神經元細胞有不同程度的皺縮及變形，胞核固縮，核膜凹凸不平，核仁偏向一邊，染色質濃縮，形成不同形狀和小小不等的團塊聚集于核周邊或貼于核膜，符合細胞凋亡表現(xiàn)；與 C 組 比較， D 組神經元形態(tài)及結構改變從術后 3 d 時起開始減輕，異型性改變程度較輕，在 核仁改變及染色質的深染與邊集明顯減輕，細胞凋亡有所減輕 。見圖 7圖 9。 19 圖 1 三組大鼠熱痛閾變化曲線 與 S 組比較， 與 C 組 比較， 與 比較， 與 比較， 圖 2 三組大鼠機械痛閾變化曲線 與 S 組比較， 與 C 組 比較， 與 比較， 與 比較， 0 圖 3 三組大鼠脊髓背角 達的變化 與 S 組比較， 與 C 組比較， 與 比較， 4 三組大鼠脊髓背角 達的變化 與 S 組比較， 與 C 組比較， 與 比較， 1 圖 5 三組大鼠 術后 7d 脊髓背角 達的變化 （免疫組織化學染色 100） 22 圖 6 三組大鼠 術后 7d 脊髓背角 達的變化 （免疫組織化學染色 100） 23 圖 7 S 組 大鼠脊髓背角 神經元 的 超微結構（醋酸鈾 10 000） 圖 8 C 組 大鼠脊髓背角 神經元 的 超微結構（醋酸鈾 10 000） 24 圖 9 D 組 大鼠脊髓背角 神經元 的 超微結構（醋酸鈾 10 000） 25 討論 1 坐骨神經慢性壓迫性損傷模型 神經病理性疼痛是由神經損傷所引起的，從神經受損到產生疼痛，神經系統(tǒng)經歷了一系列復雜 的電，化學變化，傷害性刺激在外周初級感覺神經元經過換能，轉變?yōu)殡娦盘?，經過脊髓，腦干，丘腦的傳遞和調制，最終在大腦皮層產生痛覺。神經病理性疼痛具有自發(fā)性疼痛，痛覺過敏及痛覺超敏的臨床特征，給患者從身體到心理帶來極大的傷害，因此針對神經病理性疼痛的研究是疼痛領域的熱點與難點。在研究神經病理性疼痛的機制之前，建立合適的神經病理性疼痛動物模型是必需的前提。 一般來說，一種神經病理性疼痛模型的建立應具備以下幾點要求 64： 保留神經病理性 疼痛的生物學特性；可對神經病理性疼痛相關聯(lián)的細胞及分子進行研究；具有客觀及可量化的指標；可靠性、可重復性、有效性與實用性。本實驗采用的是坐骨神經慢性壓迫性損傷 (型，其特點是制作相對簡單穩(wěn)定，制備成功的標準較明確，而且相應的痛行為學的檢測方法簡易可行，動物也很少有傷肢自噬現(xiàn)象。因此該模型是目前國內外慢性疼痛基礎研究中最常用的模型之一。此模型最初在 1988 年由 創(chuàng)，當時使用鉻制腸線輕度結扎大鼠坐骨神經干，術后動物出現(xiàn)明顯的 自發(fā)痛，自發(fā)抬起受損側肢體，時而舔足或甩足等一系列自我保護行為。術后 3 5d 動物開始出現(xiàn)痛反應，機械痛敏在 7 14d 達到高峰，持續(xù) 2 個月后痛法應表現(xiàn)消失，此后代之以感覺遲鈍，實驗動物沒有出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。該模型是首個利用檢測機械痛閾和熱痛閾來分析痛行為的模型，目前廣泛應用于國內外對慢性神經病理性的研究。 大鼠坐骨神經解剖結構清晰，行走路線變異較少，且大鼠后足皮膚表面積的 80%都是由坐骨神經支配，本模型通過輕度機械性結扎坐骨神經干，使粗的有髓鞘纖維選擇性損傷，而保留大部分傳遞痛覺的無髓鞘 C 類纖維。該模型在術后相關 的痛行為方面主要經歷了兩個階段： 術后 1 15d，大鼠出現(xiàn)自發(fā)痛，熱痛敏，冷痛敏和機械異常痛敏 65，在 10 14d 達到峰值；術后 15 30d，所有痛行為表現(xiàn)仍持續(xù)存在，但敏感程度較高峰期明顯下降。 型 是神經病理性疼痛與炎性疼痛相結合的模型，通過用鉻制腸線機械壓迫坐 骨神經造成軸突損傷，從而產生異常放電，同時由于鉻制腸線其金屬質地造成壓迫神經的局部炎癥反應，從而導致炎癥細胞釋放炎性介質。因此，雖然該模型因為與人26 體外周神經損傷所導致的慢性神經病理性疼痛的癥狀和行為表現(xiàn)極為相似，但仍然存在一定的缺點。如鉻制腸線對神經結扎的松緊程度取決于實驗的操作者，由此所導致的神經纖維的損傷類型和數目都難以控制 66；此外，是否由于鉻制腸線所含的化學物質的毒性而導致了神經纖維損傷，也存在一定的爭議 67。 為了克服上述缺陷，達到理 想的造模標準，本實驗對經典的 型進行了以下改進： 所有實驗操作均由一個人操作完成，從而保證實驗的一致性 ；用 4線代替鉻制腸線進行坐骨神經干結扎，從而避免鉻制腸線所含化學物質的毒性作用。 本實驗結果顯示：大鼠 后出現(xiàn)不同程度的 術側足趾并攏并輕度外翻 、坡行、舔舐、懸空等痛行為學表現(xiàn)，與 S 組比較，大鼠術后 3時機械痛閾和熱痛閾均明顯降低，表明大鼠神經病理性痛模型制備成功。 目前，利用 型，從行為學，細胞病理生理學，電生理學以及分子生物學 等方面對神經病理性疼痛展開了一系列廣泛的研究，此 模型的應用，為神經病理性疼痛的