密級 論文編號： 中國農業(yè)科學院 學位論文 四倍體棉種起源與演化的 究 on .) on .) I 摘 要 多倍體的形成在生物進化過程中占有重要的地位，但是我們對其多倍化后基因組究竟發(fā)生了哪些變化還知之甚少。棉屬（ 較適合于基因組起源與演化的研究，它共約有 51個種，分為 9個基因組類型。先前的研究已表明， 四倍體棉種 (異源多倍體，它包含 A 基因組和 D 基因組。 隨著研究手段的創(chuàng)新，在四倍體棉種起源、演化和分類等重大基本理論上已基本形成共識。但是，四倍體棉種的具體供體種 及其起源過程的種質歧化、棉屬染色體組之間或組內各棉種的同源程度等仍有分歧。 本研究使用 法對此進行初步探討，主要包括：四倍體棉種供體種研究、四倍體棉種多元進化和單元進化的研究以及 究結果如下： 1 以四倍體棉種 A 基因組可能的供體種阿非利加棉、亞洲棉的 其 D 基因組可能的供體種雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉、戴維遜氏棉、擬似棉的 別與四倍體棉種的體細胞（ 花粉母細胞（ 行 以 發(fā)現 A 基因組的一些重復序列入侵到 D 基因組上，并且 A 基因組與四倍體 基因組與四倍體 在以 現戴維遜氏棉與陸地棉 D 基因組的關系最近，雷蒙德氏棉與海島棉 D 基因組的關系最近，從而推測四倍體棉種是多系起源而不是單系起源的。并發(fā)現擬氏棉是 D 基因組棉種中一個特殊的種。 2 在（ 1 價體多，偶爾也有 明阿非利加棉染色體（ 陸地棉的 A 組染色體盡管基本上相同，但還是存在著差別。在（ 2 2 從信號顯示的情況看，雷蒙德氏棉比瑟伯氏棉與海島棉 3 以 45S 探針，分別以陸地棉、海島棉、黃褐棉為靶 行 驗，發(fā)現陸地棉和海島棉的 45S 部同步進化為 黃褐棉的 45S 基因組類型的 說明在四倍體中， 45S 且在四倍體中， 45S 部位于染色體短臂的端部，從而推測二倍體棉種的 45S 多倍 體中像轉座子一樣能夠在染色體上移動。 I 關鍵詞：棉花，原位雜交，同步進化 a in of is us to in is a 1 It - to of D to be to on of of of of et in is to of in of or of as 1 In of as of as as of is to of of is to of be in as is is is 2 in 1A 1-a A AA in 2D 1 2D 5 , D in is of 3 In 45S as as In to of 5S in on of of 5S to on or to in 錄 第一章 文獻綜述 . 3 1 1 四倍體棉種的起源與分布 . 3 1 1 1 四倍體棉種的起源 . 3 1 1 2 四倍體棉種的分布 . 2 1 2 四倍體棉種起源與演化的地理學 . 4 1 3 研究棉花起源與演化的學科或方法 . 5 1 3 1 種間雜交研究 . 5 1 3 2 核型研究 . 5 1 3 3 種子蛋白質研究 . 5 1 3 4 分子標記研究 . 6 1 3 5 原位雜交研究 . 6 1 3 6 其它研究方法 . 9 1 4 四倍體棉 種的供體種 . 9 1 4 1 四倍體棉種 . 9 1 4 2 四倍體棉種 . 10 1 5 本實驗研究目的意義 . 12 第二章 材料與方法 . 13 2 1 實驗材料 . 13 2 2 實驗方法 . 15 2 2 1 探針 . 15 2 2 2 染色體制片 . 17 2 2 3 探針的制備 . 17 2 2 4 變性和雜交 . 17 2 2 5 洗脫和信號檢測 . 18 2 2 6 熒光觀察 . 18 2 2 7 數據統(tǒng)計 . 18 第三章 結果與分析 . 19 3 1 以 . 19 3 1 1 以雷蒙德氏棉 針的 . 19 3 1 2 以戴維遜氏棉 . 23 V 3 1 3 以瑟伯氏棉 . 24 3 1 4 以擬似棉 . 24 3 1 5 棉屬種間雜種 . 25 3 2 以 . 26 3 2 1 以阿非利加棉 . 26 3 2 2 以石系亞一號 . 27 3 2 3 棉屬種間雜種 . 28 3 3 以 45S 探針的 . 28 3 3 1 陸地棉 45S . 28 3 3 2 阿非利加棉 45S . 29 3 3 3 草棉 45S . 29 3 3 4 雷蒙德氏棉 45S . 29 3 3 5 黃褐棉 45S . 30 3 4 棉花 驗中的一些特殊現象 . 31 第四章 討論 . 33 4 1 四倍體棉種 . 33 4 2 四倍體棉種 . 33 4 3 二倍體棉種 A、 、 . 34 4 4 以 A、 信號比較 . 35 4 5 擬似棉在四倍體起源與演化中的地位 . 36 4 6 棉花基因組中的彌散重復序列和基因組入侵 . 37 4 7 四倍體棉種 A、 的易位 . 39 4 8 四倍體棉種的 . 40 4 9 棉花 驗中封阻問題的探討 . 45 4 10 棉花原位雜交中部 分技術問題的探討 . 46 4 10 1 棉花染色體原位雜交研究中的制片技術的改進 . 46 4 10 2 雜交后的正確洗脫強度 . 47 4 10 3 基因組原位雜交探針及其標記方法的選擇以及 . 48 第五章 結論 . 49 參考文獻 . 50 致 謝 . 59 作者簡歷 . 60 V 第一章 文獻綜述 棉屬（ 被子植物錦葵目（ 錦葵科（ 棉族（ 最新提出的棉屬分類系統(tǒng)為 4 個亞屬，共 51 種（亞種） (992年 )。包括 46 個二倍體種（ 2n=2x=26）， 5 個四倍體棉種 (2n=4x=52)。二倍體棉種的草棉（ 亞洲棉（ 四倍體棉種的陸地棉（ 海島棉（ 栽培種，其余 47個種均為野生棉。 早期的棉屬植物分類研究，基本依據是棉屬植物的形態(tài)特征和地理分布。由于不同的分類學家所偏重的形態(tài)特征不盡相同，因而，早期分類始終未能擺脫混亂的局面。 940、 1942)在棉屬分類學中做出了劃時代的貢獻，他根據雜種后代減數分裂時染色體的配對情況，在總結前人已積累的棉屬細胞遺傳學知識的基礎 上，結合他本人進行的大量種間雜交研究成果，參照棉種的地理分布，提出了劃分染色體組的細胞學分類原則：即凡種間染色體同源性較高的棉種歸為同一染色體組，反之則列為不同的染色體組。據此將二倍體棉種分為 A、 B、 C、 D 和 E 等 5 個染色體組，分別代表亞洲棉、非洲棉、澳洲棉、美洲棉和阿拉伯棉種的染色體組。四倍體棉種被認為是 A 染色體組和 D 染色體組種間雜交產生的雙二倍體種，將其定為 色體組。至此，現代棉屬的分類框架才最終得以形成。 目前，隨著研究方法的創(chuàng)新，在棉花物種起源、演化和分類等重大基本理論上已形成共識。但是，四倍體 棉種的具體供體種及其起源過程的種質歧化、棉屬染色體組之間或組內各棉種的同源程度等仍有分歧。各國學者提出一些推論，多不一致，因而對其研究仍方興未艾。 1 1 四倍體棉種的起源與分布 1 1 1 四倍體棉種的起源 四倍體棉種的起源途徑曾是棉屬系統(tǒng)發(fā)育中的中心問題之一。多數科學家接受了四倍體棉種是由染色體組 A 和染色體組 D 結合而成，因之美洲四倍體種為異源多倍體的起源理論。 1933， 1934， 1937）和 1935）對美洲棉種間雜交進行研究，在減數分裂中發(fā)現了 13個二價染色體和 13 個單價染色體，這個結果和異源四倍體理論相符合。 1940， 1941）用美洲二倍體棉（瑟伯氏棉）和亞洲二倍體棉（草棉）進行種間雜交，經染色體加倍后合成異源四倍體，再用四倍體栽培棉（陸地棉）與人工合成的異源四倍體進行雜交，根據雜種及后代的育性表現證明四倍體棉種的染色體組是由 A 染色體組和 D 染色體組提供的。另外，對染色體形態(tài)中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 2 方面的研究也證實了美洲異源四倍體起源的理論。經典的細胞遺傳學研究表明美洲四倍體種是異源多倍體，它包含來自非洲或亞洲的 A 染色體組和與美洲二倍體種染色體組相似的 D 染色體組。此后，科學家 們采用不同的方法來驗證此理論， 1953， 1958）和 1963， 1964，1966）采用觀察雜交合成的多倍體在減數分裂時的染色體配對情況的方法， 1998）等根據同工酶標記分析的方法， （ 1999）根據遺傳學作圖的分析方法， （ 2002）根據 列比較分析等方法對四倍體棉種的起源進行了探討研究，結果都證實了四倍體棉種是異源多倍體起源的理論。 (1994)對陸地棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉（ H +2因結構進行分析 , 編碼其亞基的兩個基因 四倍體棉種中 ,因在 A 亞組具有 2 個拷貝 , 在 D 亞組具有 1 個拷貝， A 亞組和 D 亞組中各具有 2個拷貝，認為在形成四倍體栽培種以前，二倍體棉種可能存在多倍體化的可能。 (1999)認為四倍體棉花的演化由 A、 D 基因組從一個共同祖先發(fā)生偏離，在一個共同核中再結合，共同演化產生了新的核型，并超越了其二倍體祖先的基礎。 (1999)認為從分子細胞遺傳學表明棉花陸地棉至少是八倍體起源 。 000)認為棉花的“二倍體”祖先本身就是基因組結構已顯著二倍化了的古四倍體，因此由四倍體雜交再經多倍化形成的棉花應是八倍體，而不是四倍體，從這一點看，棉花的多倍性水平被低估了。 1 1 2 四倍體棉種的分布 目前，世界上分布最廣的四倍體棉種是陸地棉 ,其次是海島棉。陸地棉種起源與墨西哥高原地區(qū)，在墨西哥南部及尤卡坦地區(qū)，陸地棉種被當地土著民族的先輩們利用栽培。此棉種向前擴展到巴拿馬地峽地帶，和東北擴展到亞利桑那沙漠，向東及東北擴展到佛羅里達、安的列斯群島及巴哈馬群島。在美洲被發(fā)現以后，這個 棉種獲得頭等重要意義，在全世界廣泛擴展，在亞洲、非洲、歐洲及南美等各個產棉國家廣泛種植，并不斷排擠當地棉種。陸地棉在進化的后階段，即歐洲人發(fā)現美洲以后，形成了適于亞熱帶氣候的早熟果枝型棉花。該種的熱帶類型集中在南墨西哥、尤卡坦及巴拿馬地峽地區(qū)；而亞熱帶類型（美棉）幾乎在全世界亞熱帶植棉國家中分布，極早熟類型已進入溫帶栽培。海島棉種起源于南美洲北部秘魯等地區(qū)，在歐洲人發(fā)現美洲之前，海島棉已在安的列斯群島栽培，并廣泛地分布在南美，從智利邊界直到厄瓜多爾。這個種向東擴展到大西洋沿岸，又經過巴拉圭、巴西及哥倫比亞到 達西印度群島種植。歐洲人把海島棉、陸地棉帶到世界各地，但海島棉僅在幾個國家獲得很大的經濟意義，如埃及、前蘇聯、美國、尼日利亞，以及自己的發(fā)源地秘魯及西印度群島。海島棉種多樣化的熱帶類型分布在秘魯及南美其他國家。亞熱帶類型的分化，顯然是在歐洲人發(fā)現美洲以后， 18 世紀末到 19 世紀初，在美國形成海島棉，在埃及形成埃及棉；以后又分布到西印度群島（海島棉）及秘魯（埃及棉品種）以及其他國家。最早熟的海島棉類型及品種是近幾十年在前蘇聯棉區(qū)形成的，但也遭到陸地棉的競爭。其它四倍體棉種中，達爾文氏棉（ 要分布在加拉帕戈斯群島，從地理分布來看，它極可能是海島棉的變種。黃褐棉（ 要分布在巴西東北部。毛棉（ 要分布在夏威夷 (992)。今年來，研究者（ 1989； 1990； 1992； ， 1994, 1995a； ， 1996； ， 1999；）從四倍體棉種的系統(tǒng)發(fā)育方面的分析結合其地理分布將四倍體棉種分成三組，即陸地棉和毛棉歸為一 組，海島棉和達爾文氏棉歸為一組，黃褐棉獨立歸為一組。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 3 表 . of 名 中 譯 名 染色體組 地理分布 棉 東和非洲 洲棉 東和 印度 續(xù)表 1 . 名 中 譯 名 染色體組 地理分布 桑納爾棉 B 非洲 常棉 洲 葉棉 洲南部 頂棉 得角群島 叉棉 B 非洲 特提棉 洲中部 岱華棉 洲東南部 賓遜氏棉 洲西部 洲棉 C 澳洲中北部 爾遜氏棉 C 澳洲中部 寧漢氏棉 C 澳洲最北部 伯氏棉 利桑那州 根棉 西哥，加里福尼亞 克尼西氏棉 西 哥，加里福尼亞 維遜氏棉 西哥，加里福尼亞 勞茨基棉 拉帕戈斯 地棉 科利馬地區(qū) 蒙德氏棉 魯 似棉 互哈卡州 片棉 米卻肯州 裂棉 西哥西部 散棉 哥雷羅 納氏棉 索諾拉州 沃恩蒂曼氏棉 西哥 篤克氏棉 拉伯地區(qū) 馬里棉 非 雷西棉 也門 白棉 拉伯南部 納鈥爾棉 E 北非 雷切狄氏棉 E 北非 倫生棉 E 索馬里 萼棉 洲東部 克氏棉 洲中部 生葉面棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 殼棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 葉棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 麗棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 絨棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 地棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 小棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 敦德里棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 全特氏棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 貴棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 4 葉棉 K 澳大利亞金伯利地區(qū) 地棉 ( 中美洲，世界廣泛栽培 島棉 ( 南美，世界廣泛栽培 棉 ( 夏威夷 褐棉 ( 巴西 爾文氏棉 ( 加拉帕戈斯群島 1 2 四倍體棉種起源與演化的地理學 現代棉 花分類學家 992)認為，四倍體棉染色體結構為 以許多遺傳學家和細胞學家的工作，尤其是以 1940， 1941）的開拓工作為基礎而定型的，即四倍體結合了 A 染色體組（舊世界栽培二倍體種）和 D 染色體組（新世界野生二倍體種）的遺傳物質。據此研究結論，四倍體棉種的 A、 D 兩組染色體，一組來自非洲，一組來自南美洲。這兩組相隔遙遠的棉種如何相遇并進行結合的問題，有不同的假說。 一種假說是 A 染色體組棉種的種子，從起源地非洲漂流過大西洋到達南美洲。如果是這樣，可能是非洲野生棉（ 的種子由南非南部隨大西洋赤道潮流漂浮過去；或者是綠頂棉（ 佛得角群島隨北大西洋潮流漂浮過去（據研究，綠頂棉與草棉可能有關聯）。大西洋赤道的這股潮流沿著北大西洋和南美洲以及中美洲的加勒比海岸流動，而在南美洲的西北部或中美洲 A 組與 D 組相會，這在更新世以前， A 染色體組的種子經此路線傳播是完全可能的，然后它們進一步進行雜交而形成 色體組的美洲四倍體棉種。 另一種假說是，在白堊紀后期或第三紀初期，南美洲的東岸和非洲的西岸是連接在一起的，A 組和 D 組棉種是可 以靠近的，兩者發(fā)生雜交，然后自然加倍，形成了異源四倍體類型，后來發(fā)生了大陸漂移運動，非洲與南美洲之間被大西洋隔開，四倍體類型在中美洲及南美洲走上了自己分化發(fā)展的途徑。 1939）曾提出太平洋陸橋的假說，既在古代新世界與舊世界之間，在太平洋地區(qū)曾存在著陸地橋梁，兩地之間有陸地相連接，新舊世界二倍體的各種類型的棉種的分布地區(qū)是相連的，或相互之間是相重疊的，這些種在這里產生雜交而形成雙二倍體種。后來太平洋陸橋下沉，被太平洋海水淹沒，雙二倍體棉種就在新世界分化與發(fā)展。這種假說的根據是，因為在太平洋島嶼 上還存在著波利尼西亞種。但這種假說后來被許多學者所否定。另外一種意見認為，可能由于人類活動攜帶亞洲棉 A 染色體組的種子，經過太平洋到達新世界，在栽培過程中與D 染色體組的一個或幾個種相互雜交而形成四倍體（ ， 1947）。 1953）和1964）根據非洲南部現存的草棉野生類型是亞洲棉花唯一真正的野生類型，提出了非洲草棉通過太平洋傳播的途徑。 為新世界棉不存在野生的類型，栽培的草棉是人帶到南美洲北部來的，并在那里種植，可能與雷蒙德氏棉雜交產生海島棉。 隨后草棉又被帶到墨西哥，與擬似棉或三裂棉雜交產生陸地棉。 1975）也認為由人類把草棉帶至新世界的熱帶地區(qū)，在那里成為栽培種，并且不止和一個 D 染色體組種雜交形成了天然雜種。 1992）對整個生態(tài)情景進行分析后，認為與人類活動無關，他發(fā)現野生二倍體棉種為大陸性（為陸地包圍的）荒漠地區(qū)所特有，而野生四倍體棉種則分布在植被稀少的沿海地區(qū)，并且通過海濱地區(qū)向外擴散。他認為四倍體棉種起源于更新世的某個時期，當時由冰河的交替前進與消退造成水平面的升降，這種多變的海岸線不僅成為異源四倍體的新舊 世界親本相遇到一起的途徑（其傳播途徑主要是通中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 5 過海水傳播， 研究證明棉種種子具有高耐鹽性，尤其對于毛棉種子在人工配制的鹽水中浸泡 3 年后仍具有發(fā)芽能力），而且還造成一種開放的環(huán)境，以便新形成的異源四倍體可以在那里定居下來。一旦定居下來，這個地方就會成為使它遠離起源地傳播到別處海濱的中轉站。 2002）和 （ 2003）近年的研究結論也為異源四倍體更新世起源的理論提供了更充分的證據，他們估算四倍體棉種形成大約在 1萬年前，祖先 A 染色體組種通過大西洋傳播到新世界后才發(fā)生的。 在新世界是早期從事農業(yè)的人發(fā)現了四倍體棉并馴化了它們，但并不是由人類創(chuàng)造了它們。四倍體的分化，至少種一級別的分化是發(fā)生在馴化之前，可以在自然選擇過程中來尋找這種趨異的作用。 1 3 研究棉花起源與演化的學科或方法 1 3 1 種間雜交研究 1933， 1934， 1937）和 1935）對新世界棉種間雜交進行研究，證實了新世界棉的異源四倍體起源的理論。 1944， 1951， 1958， 1966 年）對以四倍體棉種雜交后代進行遺傳研究的基礎上確定，雷蒙德氏棉與四倍體 栽培棉種的關系比瑟伯氏棉（ 及其它任何美洲野生棉種都更為接近。 1953）通過將雷蒙德氏棉 陸地棉，瑟伯氏棉 陸地棉等雜交組合作比較，證實了 觀點。另外， 1958）通過比較分別以亞洲棉、草棉與四倍體棉種雜交加倍合成的兩種六倍體的多價體出現頻率，認為草棉與自然產生的四倍體棉種的 A 基因組的親緣關系更近。周寶良等根據海島棉與 D 染色體組 7 個種雜種 減數分裂中期 I 的染色體配對結果，認為擬似棉（ G.海島棉的關系最遠 ，雷蒙德氏棉可能是海島棉染色體亞組的供體。 1 3 2 核型研究 聶汝芝等（ 1985）根據對 3 種野生和 4 個栽培棉種的核型分析，指出草棉是 A 組的供體種，亞洲棉是草棉易位衍生而來，陸地棉和海島棉的 D 組可能來源于不同的供體，雷蒙德氏棉與陸地棉的 D 染色體組、瑟伯氏棉與海島棉的 D 染色體組相似。聶汝芝和李懋學（ 1993）開展了 D 染色體 8 個種與 8 個陸地棉半野生種系的核型分析，根據染色體相對長度、臂比及其類型，認為三裂棉（ 鮑莫爾棉的供體。瑟伯氏棉是闊葉棉、墨西哥棉的供體，雷蒙德氏棉是雷奇蒙德氏棉、 尖斑棉、尤卡坦棉、瑪利加郎特棉、莫利爾氏棉的供體。王坤波和李懋學（ 1990）開展了 D 染色體組 11 個種與陸地棉、海島棉的核型分析，認為擬似棉可能是海島棉 D 染色體的供體種，戴維遜氏棉（ 能是陸地棉 D 染色體組的供體種。 1 3 3 種子蛋白質研究 1970）根據種子蛋白質電泳圖譜分析，認為海島棉是由草棉和 D組的雷蒙德氏棉雜交而起源的。陸地棉是由鮑莫爾氏棉與具有 染色體組的原始型或該染色體組中一個或多個更原始的類型雜交而起源的。毛棉是被人類或洋流從中美洲起源 中心帶到夏威夷的。陳松等根據蛋白質電泳圖譜分析，認為 D組棉種是陸地棉、海島棉、達爾文氏棉的供體。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 6 1 3 4 分子標記研究 1989）分析了 A、 D、 色體組葉綠體 制位點的差異，發(fā)現在大約 56個限制性位點變異中有 28 個限制性位點在 A、 色體組間未發(fā)現差異，明顯區(qū)分于 D 染色體組，而 2 個插入突變（大約 150在 D 染色體組中的葉綠體 現， A、 色體組葉綠體 此插入突變，據此 為，四倍體棉種細胞質供體種是來源于 A 染色體組中 似的棉種。 （ 1994）運用 圖的方法對四倍體棉花的基因組進行研究，發(fā)現依據重復位點的類型可以在棉花基因組中識別出 11 對部分同源的染色體，對這部分同源染色體上連鎖群（ 分布式樣進行比較發(fā)現，只有兩對部分同源染色體在基因排列順序上表現明顯的共線性（ 另有 4 對至少發(fā)生過一次倒位，有一對發(fā)生過一次明顯的易位；對棉花二倍體祖先的基因組（ A 和 D）進行比較，可以看出它們在基因排列順序上是非常相似的，但在四倍體基因組中它們彼此之間就表現明顯的差異，由此可以 證實正是多倍化促進了這種進化改變的發(fā)生。宋國立（ 1998）對包括 4 個栽培種的 32 個種和 7 個陸地棉野生種系 析，得出四倍體棉種是由與草棉類似的棉種作母本供體種，與戴維遜氏棉類似的棉種作父本合成的異源四倍體種。 （ 1999）將亞洲棉（或草棉）、雷蒙德氏棉和陸地棉三者的16 個核酸位點共計 14， 705 堿基對長度的序列進行對比分析，發(fā)現 A 基因組二倍體棉種的該序列與四倍體棉種的該序列的趨異率為 而 D 基因組二倍體棉種為 這些結果說明亞洲棉（或草棉）與四倍體棉種 A 基因組的相似程度約為雷 蒙德氏棉與四倍體棉種 D 基因組的相似程度的 。 2001）等對二倍體棉種和四倍體棉種的 析中，陸地棉和海島棉共有 368 條多態(tài)性片段，其中的 143 條是和 A 基因組二倍體棉種共有的， 84 條是和 D 基因組二倍體棉種共有的，由此推論異源四倍體棉種的 A 染色體組與二倍體棉種的 A 染色體組的親緣程度比其 D 染色體組與二倍體棉種 D 染色體組的親緣程度更近。 郭旺珍 等（ 2003） 利用 子標記技術，對棉屬 A、 D 染色體組二倍體及四倍體代表棉種進行了遺傳多樣性分析 ，所得到的結果支持擬似棉是 D 染色體組最原始棉種 。 1 3 5 原位雜交研究 原位雜交技術（ in 1969 年由 出的（呂忠進等，1993；吳殿星等， 1994；賈繼增， 1996；奇文清等， 1996； s， 1998）