博士學(xué)位論文 幾種高溫浸礦菌的分離鑒定及其 應(yīng)用基礎(chǔ)與浸礦潛力研究 作 者 姓 名： 丁建南 學(xué) 科 專 業(yè)： 微生物學(xué) 院（系、所）： 資源加工與生物工程學(xué)院 指 導(dǎo) 教 師： 王淀佐 院士 邱冠周 教授 劉學(xué)端 教授 中 南 大 學(xué) 2007 年 10 月 分類號(hào) 密級(jí) 博士學(xué)位論文 幾種高溫浸礦菌的分離鑒定及其 應(yīng)用基礎(chǔ)與浸礦潛力研究 of on 作 者 姓 名： 丁建南 學(xué) 科 專 業(yè)： 微生物學(xué) 院（系、所）： 資源加工與生物工程學(xué)院 指 導(dǎo) 教 師： 王淀佐 院士 邱冠周 教授 劉學(xué)端 教授 論文答辯日期 答辯委員會(huì)主席 中 南 大 學(xué) 2007 年 10 月 博士學(xué)位論文 摘 要 本論文根據(jù)不同高溫環(huán)境樣品的 理化性質(zhì)和目標(biāo)菌株的生理生化特性， 對(duì)不同溫度級(jí)的高溫浸礦菌進(jìn)行了系統(tǒng)的富集、 分離和鑒定，并對(duì)所分離的高溫浸礦菌株進(jìn)行了應(yīng)用基礎(chǔ)和浸礦潛力研究， 以期為我國(guó)高溫浸礦菌種資源庫(kù)的建立提供菌種資源， 為高溫浸礦菌的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供優(yōu)良出發(fā)菌株。 作者從我國(guó)不同地域采集到各種環(huán)境樣品 14份， 共從中分離鑒定出各類高溫菌 6屬 6種 30余株，包括喜溫嗜酸硫桿菌（ 21株（最適生長(zhǎng)溫度 35、嗜熱硫氧化硫化桿菌（ 1株（最適生長(zhǎng)溫度 53）、仙臺(tái)脂環(huán)酸芽孢桿菌（ 1株（最適生長(zhǎng)溫度55）、萬(wàn)座酸菌（ 2株（最適生長(zhǎng)溫度 65）、金屬硫葉菌（ 2株（最適生長(zhǎng)溫度 67）和勤奮金屬球菌（ 3株（最適生長(zhǎng)溫度 。在所有分離鑒定的高溫菌中，除仙臺(tái)脂環(huán)酸芽孢桿菌外，其它菌株均具有浸礦功能。由于篇幅所限， 本論文只涉及到其中的前四屬四種，即喜溫嗜酸硫桿菌、嗜熱硫氧化硫化桿菌、 仙臺(tái)脂環(huán)酸芽孢桿菌和萬(wàn)座酸菌。 本論文對(duì)上述四種高溫菌的研究主要包括如下內(nèi)容。 1) 喜溫嗜酸硫桿菌的分離鑒定 使用多種培養(yǎng)基， 采用瓊脂平板固體分離法從樣品中分離到喜溫嗜酸菌 21株。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特性研究及 16S 定這 21個(gè)菌株為喜溫嗜酸硫桿菌。根據(jù)樣品來(lái)源，將這些菌株分為 5個(gè)系列， 即 “列 （來(lái)自云南騰沖、 新華、 瑞甸酸性熱泉） ，“列（來(lái)自云南安寧酸性溫泉）， “列 (來(lái)自臺(tái)灣陽(yáng)明山酸性熱泉 )， “和 “列（分別來(lái)自江西德興、廣東大寶山酸性礦山廢水）。 2) 喜溫嗜酸硫桿菌菌株隨機(jī)擴(kuò)增1株喜溫嗜酸硫桿菌來(lái)自多個(gè)地理位置相互隔離， 物理化學(xué)性質(zhì)各異的環(huán)境樣品，雖然同屬一種，但 有些菌株在生理生化特性上表現(xiàn)出較大的差異。 為揭示這些菌株之間的親緣關(guān)系以及菌株差異性和環(huán)境條件之間的關(guān)聯(lián)，從而為高效浸礦 菌株的選育提供理論依據(jù)，作者博士學(xué)位論文 摘 要 術(shù)對(duì)這些菌株進(jìn)行了多態(tài)性分析。結(jié)果表明這 21個(gè)菌株可以分成三組，菌株分異主要與棲息環(huán)境的化學(xué)特性有關(guān)。硫、鐵、銅、鋁、鎢、鋅、鎂、錳是影響菌群分異的主要因素，其中硫是關(guān)鍵元素。 3) 喜溫嗜酸硫桿菌菌株的重金屬抗性研究 國(guó)內(nèi)外有關(guān)喜溫嗜酸硫桿菌對(duì)有毒離 子的抗性研究多集中于砷。有關(guān)喜溫嗜酸硫桿菌對(duì)其它有毒離子， 特別是重金屬離子抗性的研究報(bào)道較少。研究喜溫嗜酸硫桿菌對(duì)重 金屬離子的抗性，對(duì)于提高其浸礦效率具有十分重要的意義。作者根據(jù)喜溫嗜酸硫桿菌菌株的來(lái)源，選擇了 10個(gè)菌株和 5種重金屬硫酸鹽，對(duì)所選菌株進(jìn)行了重金屬抗性研究。結(jié)果顯示， 初始耐受濃度最高，對(duì) 力進(jìn)行進(jìn)一步的馴化增強(qiáng)后， 其最終 受濃度達(dá)到罕見(jiàn)的 210 g相當(dāng)于 31.5 g，是目前所報(bào)道的抗 力最強(qiáng)的菌株； 初始耐受濃度最高；而 初始耐受能力最強(qiáng)。 4) 嗜熱硫氧化硫化桿菌的分離鑒定 根據(jù)嗜熱硫氧化硫化桿菌能產(chǎn)生內(nèi)生孢子， 以抵抗不利環(huán)境的特點(diǎn)，本文作者采用前期以該菌的最適 生長(zhǎng)條件促進(jìn)其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，后期以該菌的臨界生長(zhǎng)條件促進(jìn)其孢子生 成的方式對(duì)該菌進(jìn)行富集， 最后采用促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的方式對(duì)該菌進(jìn)行稀釋分離，成功地從取自云南，溫度約 60的酸性熱泉水樣中分離到一株最適生長(zhǎng)溫度 53，最適生長(zhǎng) 養(yǎng)基 )或 桿狀細(xì)菌 形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)等方面的詳細(xì)研究，確認(rèn) 是國(guó)內(nèi)首次 分離，并經(jīng)多種方法鑒定、確認(rèn)的嗜熱硫氧化硫化桿菌。 5) 嗜熱硫氧化硫化桿菌了解嗜熱硫氧化硫化桿菌作用 下鐵礬沉淀形成的規(guī)律以及鐵礬沉淀對(duì)該菌生長(zhǎng)的影響，從而為該菌浸礦參數(shù)的優(yōu)化提供理論依據(jù)，作者在該菌最適生長(zhǎng)條件下， 在加或不加玻璃珠的培養(yǎng)基中，得到鐵礬沉淀。加玻璃珠和不加玻璃珠兩組間在 化速率、沉淀產(chǎn)量和菌群密度上有顯著差異，加玻璃珠一組 化速率快 6h，沉淀出現(xiàn)時(shí)間早 6h，沉淀產(chǎn)量高 78%。 外吸收光譜、能譜博士學(xué)位論文 摘 要 態(tài)上與后者相似。在未接種的加玻 璃珠和不加玻璃珠對(duì)照組中，實(shí)驗(yàn)期間均無(wú)沉淀生成。產(chǎn)自不加玻璃珠組的沉淀對(duì) 化能力沒(méi)有明顯影響，而產(chǎn)自加玻璃珠組的沉淀在濃度達(dá)到4g化能力造成明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示， 別是用于攪拌式槽浸時(shí)，為防止鐵礬沉淀的過(guò)早出現(xiàn)和過(guò)度累積， 在其它參數(shù)較難調(diào)控的情況下，應(yīng)將浸礦體系的 6) 嗜熱硫氧化硫化桿菌目前為止，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)嗜熱硫 氧化硫化桿菌浸出黃銅礦的報(bào)道。為評(píng)估其浸礦潛力，作者研究了 株純菌以及和喜溫嗜酸硫桿菌混合對(duì)黃銅礦和黃鐵礦的浸出。結(jié)果顯示， 株單獨(dú)浸出黃銅礦的效率較低， 25d 銅的浸出率為 當(dāng) 株與適度嗜熱硫氧化菌 株混合，浸礦效率大大改善，同期銅的浸出率提高到 株對(duì)黃鐵礦的浸出效果較好，經(jīng)過(guò) 25d 的浸出，純菌浸出液中總鐵濃度達(dá)到 5292 無(wú)菌浸出液的 。研究結(jié)果提示，用 株浸出黃銅礦一類的原生硫化礦時(shí)，最好與適度嗜熱硫氧化菌混合。 7) 異養(yǎng)菌了解共棲異養(yǎng)菌對(duì)嗜熱硫氧化 硫化桿菌浸礦的影響，從分離利用該菌與 行了黃銅礦和黃鐵礦的浸礦試驗(yàn)?；诒硇?、基因型 和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果， 行的浸礦實(shí)驗(yàn)表明， 8) 萬(wàn)座酸菌的分離鑒定 運(yùn)用原位富集法對(duì)云南騰沖的酸性熱泉水樣進(jìn)行富集后， 在實(shí)驗(yàn)室成功分離純化了 2株嗜熱喜酸菌 多種方法詳細(xì)鑒定，確認(rèn)兩個(gè)菌株屬于嗜熱古菌 座酸菌是新近發(fā)現(xiàn)的酸菌屬新種，目前全世界僅有 3個(gè)菌株，即模式菌株 摘 要 研究成果對(duì)于推動(dòng)我國(guó)浸礦菌種，特別是高溫浸礦菌種的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究具有重要意義。 9) 萬(wàn)座酸菌座酸菌 株對(duì)黃銅礦和黃鐵礦的浸出實(shí)驗(yàn)表明， 該菌株是目前已報(bào)道的浸礦菌中浸礦能力最強(qiáng)的菌株之一。 黃銅礦的搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 24d 銅的浸出率達(dá)到 對(duì)黃銅礦的繼代浸出實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，通過(guò) 向馴化， 株對(duì) 耐受濃度可以在首次浸礦的基礎(chǔ)上提高 80%以上。 株對(duì)黃鐵礦的浸出能力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 株，經(jīng)過(guò) 28d， 出液中 。這是目前國(guó)內(nèi)外首次進(jìn)行的萬(wàn)座酸菌浸礦實(shí)驗(yàn)，是該菌的重要應(yīng)用基礎(chǔ)研究，對(duì)于評(píng)價(jià)其應(yīng)用 前景具有重要的指導(dǎo)意義。 關(guān)鍵詞 高溫浸礦菌，分離鑒定，應(yīng)用基礎(chǔ)，浸礦潛力 博士學(xué)位論文 o of a of by be to in 1) of of at -, by to at 5 . 6S of 6S 9% t. On of 1 be t. 2) NA NA CR NA 0CR A 64 in 602 an 14 士學(xué)位論文 by NA as or a s of by a s a t. .6 of t. in is a t. if 3) en t. 3 a of to 12.0 N2 to 0 20 gan 1.5 gby a in 10 g1.5 g of to an of a in 4) 士學(xué)位論文 an of to m in 0 0 3 . pH 3 .0 .0 an of e2+e3+in (w/v) to or as 16s 9% +C NA b. 7.5 7.3 on is as a b. It is to be 5) on o a on of b. of b. of on a b. in a e2+as 53, 30g70r or in of of a 6 h e2+6 h 78% EM a of to of to of 士學(xué)位論文 no e2+a on of e2+a g6) of of by b. of a b. 3 % （ w/v） 5 be by . in as in a 25 d of is an 7) of on by of an b. on as a . be to be a . to be by of b. no on of 8) 士學(xué)位論文 an in Up to . an in of 9) of . . is of a 4 d u2+0% of to .4 8 d. It is to be in be to of of 博士學(xué)位論文 目 錄 錄 摘 要 .一章 前 言 .溫浸礦菌的定義與種類 . 高溫浸礦菌的定義 . 高溫浸礦菌的種類 .溫浸礦菌在微生物冶金中的作用與地位 . 高溫浸礦菌的高效性 . 高溫浸礦菌的工業(yè)應(yīng)用 .溫浸礦菌分布的局限性 .論文的研究目的與意義 .論文的主要研究?jī)?nèi)容 .論文的課題來(lái)源 .二章 喜溫嗜酸硫桿菌 （ 分離鑒定 .料與方法 . 樣品采集 . 菌株富集 . 菌株分離 . 16S 因分析 . 菌株形態(tài)特征研究 . 菌株生理生化特性研究 .果與討論 . 菌株的形態(tài)特征 . 菌株生理生化特性 . 菌株 16S 列的同源性比較 .士學(xué)位論文 目 錄 定結(jié)論