密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 玉米種質(zhì)更新過程中遺傳完整性變化的影響因素研究 .) .) 摘要 保證基因庫中種質(zhì)資源的安全保存和科學(xué)更新，確保種質(zhì)在貯藏及更新過程中維持其遺傳完整性是種質(zhì)安全保存研究的最核心課題。因此開展基因庫 異質(zhì)種質(zhì) 材料遺傳完整性變化影響因素的研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以本地白玉米、黃小玉米、小白酥、安東黃、條花糯和加紅早 6個(gè)玉米農(nóng)家種作為研究對象，利用形態(tài)標(biāo)記和 探討種子老化、繁殖群體量和取樣方式等因素對種質(zhì)遺 傳完整性變化的影響，為異質(zhì)種質(zhì)繁殖更新標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)的理論和實(shí)踐依據(jù)。主要結(jié)論如下： 1、 通過對 本地白玉米、黃小玉米、小白酥、安東黃、條花糯和加紅早等 6 個(gè)玉米農(nóng)家種田間農(nóng)藝性狀觀察分析，結(jié)果 表明不同老化程度的親本種子對玉米當(dāng)代株高、穗位高、穗長、穗粗、穗行數(shù)、主莖葉片數(shù)、主莖粗等形態(tài)農(nóng)藝性狀變異沒有產(chǎn)生 明顯 影響。 2、 利用 子標(biāo)記技術(shù)，對來自 國家種質(zhì)庫 高發(fā)芽率和 山西農(nóng)科院風(fēng)干室 低發(fā)芽率的 玉米小白酥種子 更新后代群體以及未更新 國家種質(zhì)庫 原種進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明， 繁殖后代的群體和未更新原種群體，其多態(tài)性位點(diǎn) 數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分率都為 45 和 但國家?guī)旌?山西農(nóng)科院 更新后代群體 比未更新群體分別丟失了 8 個(gè)和 10 個(gè)等位基因，同時(shí)多出了 2 個(gè)等位基因。再結(jié)合等位基因頻率 差異顯著性測驗(yàn)以及遺傳距離圖的結(jié)果，表明 種子老化影響子代遺傳變異遠(yuǎn)小于更新過程中繁殖群體量、種子老化以及田間選擇壓力等因素影響的作用。 3、 利用 葉鞘色 形態(tài)標(biāo)記和 子標(biāo)記方法，對 200株、 100株和 50株三個(gè) 不同繁殖群體量的條花糯玉米更新后代群體 及未更新原種 進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明， 隨著繁殖群體量的下降，更新后代群體籽粒顏色種類逐漸變少，葉鞘色的紅色與 白色比率下降。 等位基因數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分率也 同樣 隨著繁殖群體量的減少和取樣穗數(shù)的單一呈現(xiàn)降低的趨勢。與未更新原種群體相比， 200 株、 100 株和 50 株 更新后代群體 分別丟失了 2 個(gè)、 5 個(gè)和 4 個(gè)等位基因， 200 株 更新后代 還多出 1 個(gè)等位基因。進(jìn)一步進(jìn)行等位基因頻率差異的顯著性測驗(yàn)、遺傳距離樹狀圖和計(jì)算機(jī)模擬分析 表明， 繁殖群體量為 200 株，其保持原種種質(zhì)遺傳完整性優(yōu)于繁殖群體量為 100 株和 50 株 。 4、 對于 相同繁殖群體量的更新群體，從不同穗上獲取等數(shù)量種子作為基因庫種質(zhì)保存材料，其群體的多樣性要高于從同一個(gè)穗中 的取樣。 5、 初步認(rèn)為葉鞘色可作為研究種質(zhì)群體子代與親代之間的群體遺傳組成形態(tài)變異的參考指標(biāo)。 關(guān)鍵詞：玉米，遺傳完整性，繁殖群體大小，更新， 質(zhì)保存 of to of in is It is of to of in of SR in to of on of so as to a as 1、 of by on of of 2、 of of 1 of in of It of of of of of 5 of in 1 of on of of of in 3、 of 00, 100 0 of 0 of of of of of of of 00, 100 0 , 5 00 00 00 0 4、 It of a of of a of 5、 in of 錄 第一章 引言 1 質(zhì)遺傳完整性變化的研究意義 1 質(zhì)種質(zhì)材料遺傳完整變化的影響因素 1 子老化 與休眠 1 殖群體的大小 2 擇壓力（繁種地點(diǎn)和種植密度） 3 種地點(diǎn) 3 植密度 3 粉方式和收獲方式 4 子繁殖的世代數(shù) 4 質(zhì)資源遺傳完整性變化的分析評價(jià)方法 4 傳完整性變化的類型 4 藝性狀 5 色體畸變 5 活性、蛋白圖譜變化 5 傳物質(zhì) 6 傳完整性變化的檢測方法 6 記 6 7 7 7 傳完整性變化的統(tǒng)計(jì)分析方法 8 析方法 8 計(jì)方法 8 前的主要問題 9 究目的與技術(shù)路線 10 驗(yàn)?zāi)康?10 術(shù)路線 10 芽率下降對遺傳完整性影響試驗(yàn)的技術(shù)路線 11 同繁殖群體及取樣方式對遺傳完整性影響試驗(yàn)的技術(shù)路線 12 第 二 章 種子老化對玉米種質(zhì)農(nóng)藝性狀變異的影響 13 料與方法 13 料 13 法 14 驗(yàn) 地點(diǎn)和設(shè)計(jì) 14 V 間農(nóng)藝性狀調(diào)查 15 獲方式 15 計(jì)方法 15 果與分析 17 間出苗率及莖色等性狀調(diào)查 17 樣性指數(shù)及其 t 測驗(yàn) 17 準(zhǔn)差、變異系數(shù)檢驗(yàn) 17 論與小結(jié) 18 第 三 章 種子老化影響玉米種質(zhì)遺傳完整性變化的研究 28 料與方法 28 驗(yàn)材料 28 栽實(shí)驗(yàn)和幼苗葉鞘色的觀察記載 28 米 28 28 30 量的檢測 31 度和純度的檢測 31 析 32 物 32 32 應(yīng)程序 36 增產(chǎn)物的電泳 36 染顯色 38 據(jù)處理與分析 38 論與分析 39 同處理樣品群體的種子發(fā)芽率及葉鞘色比率 39 株取樣與混樣的效果比較 40 試群體的等位基因數(shù)與多態(tài)位點(diǎn)數(shù)比較 44 試群體的等位基因頻率的 t 測驗(yàn) 46 代之間的“遺傳漂變” 47 傳距離樹狀圖 49 論與小結(jié) 49 第四章 繁殖群體量和取樣方式影響玉米種質(zhì)遺傳完整性變化的研究 51 料與方法 51 驗(yàn)材料 51 粒顏色的觀察和記載 51 栽實(shí)驗(yàn)和幼苗葉鞘色的觀察記載 51 米 51 析 52 物 52 應(yīng)體系 55 應(yīng)程序 55 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳 55 數(shù)據(jù)處理與分 析 55 結(jié)論與分析 55 不同繁殖群體量、取樣方式與籽粒色、葉鞘色比率的變化關(guān)系 55 供試群體的等位基因數(shù)與多態(tài)位點(diǎn)數(shù)比較 56 5個(gè)群體 60 試群體等位基因頻率的 t 測驗(yàn) 61 代之間的遺傳漂變 62 傳距離樹狀圖 64 論與小結(jié) 64 第五章 “瓶頸效應(yīng)”的計(jì)算機(jī)模擬 66 料與方 法 66 結(jié)果與分析 66 論與小結(jié) 69 第六章 討論與結(jié)論 70 子老化對玉米種質(zhì)遺傳完整性的影響 70 態(tài)性狀變異 70 子水平上遺傳完整性的變化 71 殖群體量對玉米種質(zhì)遺傳完整性的影響 72 樣方式和繁殖世代數(shù)對玉米種質(zhì)遺傳完整性的影響 73 論 73 參考文獻(xiàn) 75 致 謝 81 作者簡歷 82 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章引言 1 第一章 引言 質(zhì)遺傳完整性變化的研究意義 遺傳完整性 (廣義上指種質(zhì)原始遺傳組成狀態(tài)，即在繁殖保存過程中要使其群體的遺傳結(jié)構(gòu)得到完全的保持，包括基因型頻率分布及等位基因頻率分布和其原始群體一致。根據(jù)種質(zhì)的遺傳組成，作物種質(zhì)資源可分為兩大類：遺傳上同質(zhì)種質(zhì)材料（ 和 遺傳上異質(zhì)種質(zhì) 材料 （ 。遺傳上同質(zhì)種質(zhì) 即意味著種質(zhì) 材料 個(gè)體 之間 基本上具有相同的遺傳結(jié)構(gòu)，它包括自花授粉的現(xiàn)代品種、 異花授粉作物的 自交系。遺傳上異質(zhì)種質(zhì)意味著 同一種質(zhì)材料其個(gè)體之間在基因型上均是不同的，包括原始地方品種、異花授粉作物栽培品種、野生種質(zhì)材料等。異花授粉作物如玉米、甜菜、向日葵等則是屬于這一類。他們具有高度雜合性和異質(zhì)性，沒有基因型完全相同的個(gè)體，構(gòu)成一個(gè)遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜又保持遺傳平衡的異質(zhì)群體 (潘家駒， 1992；遺傳學(xué)， 1987),其遺傳結(jié)構(gòu)符合 目前，大多數(shù)作物種質(zhì)資源主要保存在低溫種質(zhì)庫中，如世界上已收集到 610 萬份植物種質(zhì)資源，約 90%是以種子形式保存在上千座低溫種質(zhì)庫中（ 1996）。 至 2002 年底， 我國 國家種質(zhì)庫貯存的種質(zhì)數(shù)量已達(dá)到 33萬余份，長期保存的種質(zhì)數(shù)量處于世界第一 （盧新雄等， 2003） ，為我國作物育種和生產(chǎn)提供了雄厚的物質(zhì)基礎(chǔ)。 但隨著時(shí)間的延長，科學(xué)工作者又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新的問題，如在德國的 因庫由于 1976 年才配置必要的制 冷設(shè)施， 1996年才有必要的干燥設(shè)施，有些種子貯存不到 15 年 ,其發(fā)芽率就降至 10%以下（ et 1997， 1998）；在對我國國家長期種質(zhì)庫貯存種子的生活力監(jiān)測中，也發(fā)現(xiàn) 存種子發(fā)芽率出現(xiàn)明顯下降（發(fā)芽率從 85%以上降至 70%以下）（盧新雄等， 2001）。此外，當(dāng)種質(zhì)庫中的種子發(fā)芽率降低到一定程度，或由于生活力監(jiān)測及對外供種的消耗使得貯藏樣品的數(shù)量減少時(shí)，需要定期或不定期的對種質(zhì)資源進(jìn)行繁殖更新。有報(bào)道指出，多達(dá) 50%的原種質(zhì)樣品已喪失生活力或更新后發(fā)生了遺傳漂變 (et 1984)，尤其是 遺傳上異質(zhì)種質(zhì) 材料，更容易受種子老化、繁殖群體量和授粉方式等因素的影響而失去原有的遺傳完整性 (989)。因此，保證基因庫中種質(zhì)資源的安全保存和科學(xué)更新，確保種質(zhì)在貯藏及更新過程中維持其遺傳完整性是種質(zhì)安全保存研究的最核心課題 (盧新雄等， 2000； et 1997)，為此，開展基因庫 異質(zhì)種質(zhì) 材料遺傳完整性的研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。 質(zhì)種質(zhì)材料遺傳完整變化的影響因素 子老化 與休眠 種子老化的過程即是種子發(fā)芽率下降的過程 ， 盡管前人研究認(rèn)為染色體畸變頻率與種子生活力存在負(fù)相關(guān)性，到目前還沒有找到種子生活力臨界值水平。對于遺傳上異質(zhì)種質(zhì)，低的更新發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)會(huì)造成以下結(jié)果：因混合群體中存在著不同基因型，若更新發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)低，不僅不同存活組分的遺傳變化大，而且發(fā)生某些基因型喪失的危險(xiǎn)性也大；低發(fā)芽率的種子活力低，因而得不到好的田間出苗率；在更新過程中，對于群體中存活基因型較差的種子，遭受遺傳選擇中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章引言 2 的危險(xiǎn)性也大 (984)。所以對遺傳上異質(zhì)種質(zhì)選擇較高的發(fā)芽率更新標(biāo)準(zhǔn)是必要的(et 1984)。 國內(nèi)外作物基因庫繁殖更新的發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)一般在 65% 85%。 薦標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)芽率 85%，認(rèn)為活力下降 15%就應(yīng)該進(jìn)行繁殖更新，最低臨界值為 65%；美國的標(biāo)準(zhǔn)較低，為原始發(fā)芽率的50%；英國則將發(fā)芽率降低到 70%作為繁殖更新標(biāo)準(zhǔn)。一般認(rèn)為此標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽率過低會(huì)引起遺傳漂移。 同一份保存樣品不同發(fā)芽率，遺傳組分會(huì)有變化。 研究了貯藏 10、 40 和 72 年及一直生產(chǎn)應(yīng)用的兩份大麥 地方 品種，發(fā)現(xiàn)隨貯藏時(shí)間的延長，發(fā)芽率下降，等位基因酶的平均基因多樣性、每一位點(diǎn)的等位基因和平均多態(tài)位點(diǎn)而顯著下降，品 種間的遺傳差異則明顯增加。 休眠一般是受遺傳控制的，但種子收獲前和收獲后的環(huán)境條件的影響也很大。最重要的是一份材料里也有相當(dāng)?shù)牟町悾虼诵枰⒁膺@個(gè)問題，并采取措施打破休眠，以避免繁殖過程中出現(xiàn)偏差。而老化和發(fā)芽率降低是改變遺傳結(jié)構(gòu)的選擇因素。當(dāng)然壽命長短的差異可能是由不同的原因形成的。比如基因型成熟的時(shí)間不同，但卻在同一天收獲，種子成熟不同可以影響其貯藏力。除了這樣間接的遺傳影響外，還有一些已知的有關(guān)種子壽命直接的遺傳差異。但幾乎很少關(guān)于這些因素造成遺傳漂移的性質(zhì)和程度的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。 殖群體的大 小 從一個(gè)大群體的一些植株取回小樣本，已經(jīng)造成了一個(gè)“瓶頸”（沒有包括那些頻率低于 而不斷增加繁殖世代又繼續(xù)擴(kuò)大了這個(gè)“瓶頸”。等位基因頻率的最初變化是由隨機(jī)過程造成的。對于很小的群體來說，等位基因的隨機(jī)丟失所造成的遺傳丟失比選擇所造成的遺傳丟失更大（ 970）。 繁殖群體的有效大小（ 決于同等繁衍下一代的個(gè)體數(shù)。因此在隨機(jī)交配群體無限大的情況下，其基因型頻率取決于等位基因的頻率。但在小群體中，后代數(shù)量的相對增加，將會(huì)發(fā)生自交， 造成等位基因頻率的隨機(jī) 波動(dòng)，導(dǎo)致等位基因丟失。 在有限的隨機(jī)交配群體中等位基因丟失比率為每次繁種的 1/2過 t 次繁殖（假設(shè)有效群體數(shù)不變）后保留的雜合性和遺傳異質(zhì)性就僅剩（ 1 1 2t （ 1981）。 984)從保留等位基因的角度重新考慮了這個(gè)問題。發(fā)現(xiàn)對于有限群體，等位基因在繁殖過程中逐步丟失的，但頻率較低的稀有等位基因比普通等位基因丟失的快。因此，稀有等位基因保存起來更困難一些。 若在 t 次世代繁殖中分別用 么該群體在變異性丟失上的表現(xiàn)，就像每次繁殖用的有效繁育群體都為 N*一樣。根據(jù)下列公式： 1/N*=1/t 1/ 1/ +1/ 不難看出，我們必須保證在多次的世代繁殖過程中要有一個(gè)臨界的群體大小。如果在一次世代繁殖中群體數(shù)太小，那末在其它次的繁殖時(shí)增加植株數(shù)的努力也是徒勞的（ 1996）。 人認(rèn)為取樣 200 株適于人工同胞授粉保持異質(zhì)群體（ 981） , 1995）等認(rèn)為 172 株可保持群體中頻率不低于 稀有類型 等位 基因。若考慮貯藏過程中基因 突變的累積作用，只有更新群體大于等于 75 株時(shí)，突變累積作用才可以忽略（ 998）。 章元明，蓋鈞鎰（ 1995）提出大豆地方品種種質(zhì)保持中適宜樣本容量為 150 200。 馮祥運(yùn)等中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章引言 3 （ 1997）認(rèn)為芝麻在非隔離區(qū)種植 40 50 株，非隔離區(qū)種植 25 株即可；段興恒等（ 1998）和范傳珠等 (1999)研究表明，多花菜豆在全封閉網(wǎng)棚內(nèi)種 50 株以上；李雅華和崔平（ 2000）認(rèn)為甜菜需繁殖 50 株以上才能維持其遺傳完整性。馬緣生等（ 2000）認(rèn)為異花授粉作物蕎麥最佳繁種措施為網(wǎng)罩內(nèi)種 50 100株；而大白菜需種 50 100 株。徐重益等（ 2004）通過對 菜薹種質(zhì)內(nèi)不同大小群體間遺傳多樣性的 出至少 60 株的結(jié)論。 而對于玉米品種資源，高楷等（ 1991）認(rèn)為 50 株可保持玉米異質(zhì)群體， 則建議采用 20 100 株（ 983）；而羅崢峰（ 2004）則認(rèn)為需 200株。據(jù)了解，在目前我國玉米農(nóng)家種種質(zhì)繁殖更新的實(shí)際操作中，采用 50 株繁殖群體量，其中很重要的考慮因素是工作量問題。 擇壓力（繁種地點(diǎn)和種植密度） 種地點(diǎn) 在異生境條件下不能模擬原生境環(huán)境的選擇壓力。因而 收獲的種子其基因型較之以前會(huì)有所不同 (956)。玉米的生長和開花要求特殊的條件，因此它們能自然生長的地域有限。此外，當(dāng)?shù)氐乃蕳l件以及病蟲害對它也有一定的影響。即使在適應(yīng)的地區(qū)即氣候相似的地區(qū)種植，這些地區(qū)與原生境的差異也同樣會(huì)使組成基因型的種子生產(chǎn)力產(chǎn)生差異。這種基因型與環(huán)境條件之間的相互作用也會(huì)帶來漂移。因此，種質(zhì)庫繁種時(shí)選擇在原產(chǎn)地繁種。 植密度 生命形式之間最重要的相互作用就是對有限資源（光、水和土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)）的競爭。很顯然競爭與密度相關(guān)（ 1963）。而競爭可以：（ 1）促進(jìn)了混合基因型群體的表現(xiàn)，得到的相對產(chǎn)量總值（ 1960）比單種植一個(gè)基因型的高，也就是超補(bǔ)償；（ 2）作為一種不連續(xù)的選擇力量，有利于遺傳多樣性；（ 3）作為一種穩(wěn)定的力量通過競爭壓力或消失使多樣性減少。 生長擁擠就會(huì)導(dǎo)致真正的競爭，對所有個(gè)體都有不利的影響，但是對有些個(gè)體的情況比另一些的更大些。如果競爭發(fā)生在苗期，而且十分嚴(yán)重，就會(huì)有一些選擇性的消亡。 1961和 1964）在研究草栽培品種混合種植的時(shí)候，注意到在開始 9個(gè)月 90%的幼苗都死了， 加上后來的變化，不僅影響栽培品種的比例，而且有的栽培品種也發(fā)生了漂移。這種漂移的方向和大小不僅取決于植株的密度，也取決于管理和環(huán)境。主要的影響可以歸納為以下幾點(diǎn)： （ 1） 幼齡植株死亡（也就是不同的存活率）； （ 2） 所有的個(gè)體受到影響，植株變小，繁殖力降低； （ 3） 與相鄰的大植株相比，競爭力不強(qiáng)的個(gè)體（較小的）植株大小和繁殖產(chǎn)量都會(huì)不同比例的變小和降低。 因此 ,基因庫繁種時(shí)，要通過低密度種植減少競爭，使每株能產(chǎn)最多的種子，這在種植的植株較少是尤為重要。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章引言 4 粉方式和收獲方式 特定的選擇壓力可以阻止等位基因 的遷移，這樣就可以平衡在自然條件下由花粉造成的基因流動(dòng)。如果選擇壓力達(dá)到 70%，那么群體即使在 50 60%花粉流動(dòng)的情況下，仍能保持其區(qū)別。 （ ， 1982） 。但在登記材料繁種的時(shí)候就不存在這種特定的選擇壓力，則即使花粉的混雜率很低也會(huì)引起顯著的摻雜（ ， 1982； 1984）。因此在繁殖時(shí)確保各份材料之間適當(dāng)?shù)母綦x，阻止花粉交換，是保持遺傳完整性最主要的步驟。一般說來，隔離的主要方法：（ 1）空間或時(shí)間隔離；（ 2）自然的或人為的屏障；（ 3）花序套袋人工雜交。但一般采 用花序套袋人工雜交的方法進(jìn)行隔離。之后進(jìn)行控制的多系天然雜交，每一個(gè)母本植株都套袋，用群體所有植株的混合花粉進(jìn)行人工授粉。假設(shè)每一個(gè)植株供給的花粉數(shù)量相同，這樣就使植株以所有組合的方式進(jìn)行雜交。 種子繁殖更新的田間種子收獲方式主要有兩種：混合法和平衡法。混合法田間操作簡單，還可降低保存過程中基因突變累積作用產(chǎn)生的負(fù)影響（ et 1995）。而 研究表明，平衡法 ,即從每一單株中收獲相同數(shù)量的種子，這樣就可以較好的降