密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 牛 乳房炎相關(guān)基因克隆、多態(tài)性研究及其 與體細(xì)胞 評(píng)分 的相關(guān)性分析 of of I 摘 要 乳房炎是奶業(yè)生產(chǎn)中的一種常見(jiàn)病，不但發(fā)病率很高（ 25 60%） ，而且每年給世界各國(guó) 奶牛飼養(yǎng)者 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失 。乳房炎的影響因素很多，但遺傳因素對(duì)其起著重要作用 。 受體家族是最近新發(fā)現(xiàn)的一類受體家族，在動(dòng)物的先天性免疫過(guò)程中發(fā)揮作用，已有研究證明 研究利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法，克隆 因 全長(zhǎng) 列，獲得 了 因和蛋白的相關(guān)信息，并采用 因的遺傳變異， 選 用 般線性模型對(duì) 因第 2 外顯子發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點(diǎn)和 3 個(gè)奶 牛品種 中國(guó)荷斯坦 奶牛 、 三河牛 和 中國(guó)西門塔爾牛 體細(xì)胞 評(píng)分 （ 行 相關(guān) 分析，得到了如下的結(jié)果： 探針，從 查找牛同源性 這些 成的重疊群（ 計(jì)引物，并結(jié)合 術(shù)獲得 因 全長(zhǎng) 陸號(hào)是 列全長(zhǎng) 3837含 2910放閱讀框，兩翼有 84非翻譯區(qū)、 814非翻譯區(qū)和 30bp A）。對(duì) 因推導(dǎo) 蛋白質(zhì) 基因編碼 969個(gè) 白質(zhì)提交 到 站的 行蛋白質(zhì)保守域的預(yù)測(cè)，結(jié)果與實(shí)際 的功能相符。 因 （ 錄號(hào)： 多態(tài)性和 3 個(gè)奶牛 品種 體細(xì)胞評(píng)分 （ 關(guān)性 （ 1） 因 385 位點(diǎn) 析 結(jié)果表明： 385 位點(diǎn) T/G 突變?cè)斐?酶切多態(tài)位點(diǎn)， 引起蛋白質(zhì)氨基酸天冬氨酸 /谷氨酸 變化。 該 酶切 多態(tài)位點(diǎn)表現(xiàn) 為 3 種基因型 41 07 48 41 07 48此位點(diǎn) 中國(guó) 荷斯坦奶牛 和三河牛 A 等位 基因占優(yōu)勢(shì)，而中國(guó)西門塔爾牛 B 等位基因占優(yōu)勢(shì)。 （ 2） 因 398 位點(diǎn) 析 結(jié)果表明： 398 位點(diǎn) 存在 G/A 突變，通過(guò)創(chuàng)造一個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)此多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行 群體 分析 。 該 酶切 多態(tài)位點(diǎn)表現(xiàn) 為 2 種基因型 0 21 19 3090 21 19 在試驗(yàn)的 3 個(gè)奶牛群體中未發(fā)現(xiàn) 因型。 此多態(tài)位點(diǎn)在 中國(guó)荷斯坦奶牛、三河牛和中國(guó)西門塔爾牛 3 個(gè)奶牛品種中 A 等位基因占優(yōu)勢(shì)。 （ 3） 因 1884 位點(diǎn) 析 結(jié)果表明： 1884 位點(diǎn) 存在 G/A 突變， 引起氨基酸甘氨酸 /絲氨酸之間的變化， 通過(guò)創(chuàng)造一個(gè) 酶切 位點(diǎn)對(duì)此多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行 群體 分析 。 該 酶切 多態(tài)位點(diǎn)表現(xiàn) 為 2 種基因型 1882 210882在試驗(yàn)的 3 個(gè)奶牛群體中同樣未發(fā)現(xiàn) 因型。 此多態(tài)位點(diǎn)在中國(guó)荷斯坦奶牛、三河牛和中國(guó)西門塔爾牛 3 個(gè)奶牛品種中 A 等位基因占優(yōu)勢(shì)。 （ 4） 群體遺傳學(xué)分析表明： 中國(guó)荷斯坦奶牛、三河牛和中國(guó)西門塔爾牛 3 個(gè)奶牛群體在 3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)達(dá)到 衡狀態(tài)， 3 個(gè)奶牛群體在 385 多態(tài)位點(diǎn)達(dá)到中度多態(tài)，在 398和 1884 多態(tài)位點(diǎn)達(dá)到低度多態(tài)。 （ 5）利用 一般線性模型，對(duì) 因第 2 外顯子發(fā)現(xiàn)的 3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和 3 個(gè) 奶牛 種中國(guó)荷斯坦 奶牛 、 三河牛 和 中國(guó)西門塔爾牛 體細(xì)胞 評(píng)分 （ 進(jìn)行 相關(guān) 分析。 因398 和 1884 位點(diǎn)不同基因型 對(duì)于 3 個(gè)奶牛品種乳房炎 異不顯著 （ P， 385 位點(diǎn)不同基因型 對(duì)于 3 個(gè) 奶牛品種 乳房炎 異顯著 （ 385is 100體積 20L 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 二 章 材料與方法 20 表 連接反應(yīng)體系 成 量（ L） L） 體 0接緩沖液 化產(chǎn)物 4接酶 體積 過(guò)夜（ 8取 余置于 凍存。 大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞的制備（ ） 挑取 腸桿菌原種，在 脂板上劃線， 37 培養(yǎng)過(guò)夜（ 12 挑取單菌落，接種到 100 B 液體培養(yǎng)基中， 37 190 轉(zhuǎn) /蕩培養(yǎng) 12 h 當(dāng) 達(dá) 搖培養(yǎng)基肉眼可見(jiàn)云霧狀）時(shí)，停止培養(yǎng) 將菌液以 1 分裝至預(yù)冷的 7菌離心管中，冰浴 10 000 離心 10 棄上清，每管用 1冷的 體中有冰粒時(shí)效果最好）重懸菌體沉淀，冰浴 304 000 離心 3 棄上清，每管用 200懸菌體沉淀，冰浴 10得感受態(tài)細(xì)胞 現(xiàn)制現(xiàn)用，或加入 30%甘油至終濃度為 15 混勻，分裝成 200l/份 投入液氮快速冷凍后， 凍存 轉(zhuǎn)化 將 4l 0l 勻后用三角玻棒均勻地涂布于 B 平板上 平板放入 37 培養(yǎng)箱中，待液體被吸干后即可用于涂布轉(zhuǎn)化的細(xì)菌 從 取出凍存的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 二 章 材料與方法 21 將 慢均勻打入 100注意動(dòng)作要輕柔，冰浴 20 42 水浴熱激 90s（其間勿搖晃離心 管），迅速取出置于冰上，冰浴 5 加入 800l 體培養(yǎng)基（不加 于 37 ,小于 150蕩培養(yǎng) 50 復(fù)蘇細(xì)胞 將離心管靜置數(shù) 3 000 轉(zhuǎn)離心 4-5 掉部分上清 輕柔地將細(xì)菌懸浮，涂布于選擇性平板上 待液體完全滲入瓊脂后，倒扣平板，于 37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 9時(shí) 取出置于 4 放置數(shù) h，讓藍(lán)白斑顯色明顯 重組質(zhì)粒 鑒定 連接轉(zhuǎn)化后，為確定外源 段是否插入質(zhì)粒形成重組質(zhì)粒，需進(jìn)行鑒定實(shí)驗(yàn)。鑒定方法主 要包括：菌體 定、 、酶切鑒定等。本試驗(yàn)主要采取菌體 定， 應(yīng)體系見(jiàn)表 體操作步驟是： （ 1）挑取白色單菌落（一般 4），在含有 B 板上劃線培養(yǎng) 12時(shí)挑一藍(lán)斑做對(duì)照 。 （ 2）建立菌體 應(yīng)體系：總體積 12l。 （ 3） 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，依據(jù)擴(kuò)增片段有無(wú)和大小鑒定外源 段是否插入質(zhì)粒 。 表 重組質(zhì)粒 鑒定菌體 應(yīng)體系 of 分 量（ l） l) 滅菌去離子水 0沖液 1.2 2.0 合引物（ 5M） 合酶（ 5U/l） 白斑培養(yǎng)好的菌液 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 二 章 材料與方法 22 序列測(cè)定 測(cè)定方法如 列同源性檢索鑒定 通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（ ）網(wǎng)站的 件，將測(cè)序后獲得的 列與 據(jù)庫(kù)中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該 列的信息。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 二 章 材料與方法 23 第三部分 基因的組織表達(dá)譜研究 組織樣提取方法見(jiàn) 一鏈合成見(jiàn) 北京沙河 荷斯坦 成年牛卵巢、肝臟、肌肉、小腸、脂肪、子宮、腎臟、心臟、肺、胰臟、睪丸、乳腺組織提取的總 取1積為 50L， 其中引物 ， 轉(zhuǎn)錄酶 300U， 。于 37C 溫育 1h 后， 95活反轉(zhuǎn)錄酶。 備用。反轉(zhuǎn)錄的具體方法參見(jiàn)楊金娥（ 2004）。 用牛 后用 12個(gè)牛組織的 如表 進(jìn)行擴(kuò)增，以便檢測(cè)這 2 個(gè)基因在牛 12 個(gè)組織的表達(dá)量。 表 因表達(dá)譜分析的引物 he 因 物名稱 物序列 段大小 3 203 3 5 3 230 R 5 3 表 因 表達(dá)譜分析的引物 he 因 物名稱 物序列 段大小 3 222 3 5 3 230 R 5 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 24 第三章 結(jié)果與分析 第 一 部分 候選基因 長(zhǎng)序列的克隆 提取效果 總 有四個(gè)亞基： 28s， 18s， 5s。由于 5s 條帶分不開(kāi)，因此完整的總泳檢測(cè)圖應(yīng)有 3 條帶，且 28s 條帶的寬度和亮度應(yīng)為 18s 的 。 本試驗(yàn)采用 劑盒，從牛的乳腺組織中提取總 體方法參見(jiàn) 甲醛變性凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖 的樣品量是 228S 和 18S 條帶明亮 、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且 28S 條帶亮度在 18S 條帶的兩倍以上。經(jīng)上海產(chǎn) 提取的總 260吸收值與 280，表明無(wú)蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染。因此，認(rèn)為 質(zhì)量是好，可以進(jìn)行后繼的 驗(yàn)。 因的 果和 列分析 將 產(chǎn)物純化后，送交北京諾塞基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序驗(yàn)證所獲得的 到該基因的全長(zhǎng) 列。序列長(zhǎng)為 3837將序列提交 據(jù)庫(kù)，基因登陸號(hào)是 用 件中的 序分析 因的開(kāi)放閱讀框（ 分析其與其他物種的同源性和開(kāi)放閱讀框本身固有的特征，確定 因包含2910開(kāi)放閱讀框，兩翼有 84非翻譯區(qū)、 814非翻 譯區(qū)和 30bp A）。 在 據(jù)庫(kù)中 做 對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與人 因有很高的序列相似性，達(dá)到 92%（ 與小鼠序列一致性也高達(dá) 83%（ 圖 甲醛變性凝膠電泳結(jié)果 of 8s 5s 18s 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 25 因內(nèi)含子和外顯子的拼接位點(diǎn) 用 牛 因與牛的基因組序列（ 行 對(duì)，其所有序列落在牛第 6 號(hào)染色體 ，提示牛 因可能定位在牛的第 6 號(hào)染色體比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖 合基因組的比 對(duì)和內(nèi)含子、外顯子的特征，分析得知 因有 23個(gè)外顯子和 22 個(gè)內(nèi)含子。拼接位點(diǎn)如表 圖 因的電子定位 of 的 因內(nèi)含子和外顯子的拼接序列 of of 顯子 含子 末位置 in 末位置 in 小 1 1 103291032529 3948 2 2 4099303992253 4441 3 3 11494783947379 4086 4 4 154906509054801 31943 5 5 256586045845447 11836 6 6 404466174645062 1986 7 7 567444634430060 1347 8 8 728429524284002 2419 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 26 9 9 83140420406252 2261 10 10 925383632821739 4075 11 11 1055322916212549 31652 12 12 120530472303761 1977 13 13 1297283982820378 1467 14 14 1476267352658346 3324 15 15 1623232582313815 5757 16 16 1739173801717001 604 17 17 1941165671638470 307 18 18 2111160761596500 1812 19 19 2212141521401625 1482 20 20 233812533124577 318 21 21 2406121381195772 774 22 22 2579111821100671 2577 23 27510842859 因氨基酸序列推導(dǎo) 因編碼 969 個(gè) 件中的 電點(diǎn)為 件中的 序推導(dǎo) 因的氨基酸序列 （見(jiàn)圖 ， 用 件進(jìn)行物種蛋白間的同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn) 其與人 (大鼠 ( 小鼠 （ 犬屬（ 白的同源性達(dá)到 見(jiàn)圖 。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 27 圖 因編碼區(qū)序列和推導(dǎo)氨基酸序列 A of 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 28 .A.的 因編碼推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與 人 (大鼠 (小鼠（ 犬屬（ 的 白質(zhì)氨基酸序列的比對(duì)分析 of aa of of 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 29 導(dǎo)蛋白系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建 從 據(jù)庫(kù)下載人 (大鼠 (小鼠（ 犬屬（ 因編碼的氨基酸序列并結(jié)合牛 因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列，用 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（ 見(jiàn) 圖 物種為人、牛、大鼠、小鼠和犬鼠。結(jié)果表明，牛和狗聚在一起，然后和人聚在一起；大鼠和小鼠聚在一起，說(shuō)明 就 白而言， 牛和狗的親緣關(guān)系比較近。 圖 白的系統(tǒng)聚類樹(shù) of 導(dǎo)蛋白質(zhì)的保守域預(yù)測(cè) 用 件中的 序推導(dǎo)了 白質(zhì)序列，然后提交到 站的址是 ），進(jìn)行蛋白質(zhì)保守域的預(yù)測(cè)。 牛 因保守域預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn) 因已知功能域見(jiàn)圖 圖 白的 保守域預(yù)測(cè)結(jié)果 .6 of 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 30 圖 白功能域 .7 of 功能域的作用如下： 同源域，含有 合區(qū)域，二聚體區(qū)域及核定位信號(hào)。蛋白質(zhì)包含 有 2 個(gè)結(jié)構(gòu)域， N 端結(jié)構(gòu)域和 白的機(jī)構(gòu)域相似， 要作用可能有三個(gè)：一是 合位點(diǎn)；二是錨蛋白（紅細(xì)胞和腦的膜蛋白，作用為使紅細(xì)胞定形素固定于陰離子通道外的質(zhì)膜）結(jié)合位點(diǎn)；三是二聚化的界面。 蛋白重復(fù)，主要作用是調(diào)節(jié)多家族蛋白之間的相互作用。錨蛋白重復(fù)數(shù)可以從2 到 20 個(gè)不等，這里的重復(fù)數(shù)是 4 個(gè)。 死亡域：在存在有細(xì)胞凋亡的細(xì)胞蛋白中存在，它主要的結(jié)構(gòu)是 分死亡域有同型或異型的二聚物結(jié)構(gòu)。 第 二 部分 因 究結(jié)果 因組 提取效果 采用常規(guī)的酚 取中國(guó)荷斯坦 奶牛 、 三河牛 和 中國(guó)西門塔爾牛 3 個(gè)品種牛血液中的基因組 圖 取 1l 基因組 脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。 圖 血液基因組 瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜 NA 2 3 4 5 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 31 從檢測(cè)結(jié)果可以看出，提取的基因組 一條較致密、整齊、清晰的條帶，而且無(wú)拖尾、亮度也比較好，說(shuō)明 完整性較好，含量較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。 因的多態(tài)性 及其與乳房炎性狀的關(guān)聯(lián)分析 新發(fā)現(xiàn)的 受體家族中的一員， 僅可對(duì) G+菌的胞壁成分 行模式識(shí)別，還可識(shí)別完整的 G+菌，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，產(chǎn)生先天性免疫。本研究將 用表 描整個(gè) 錄號(hào)： 因的 385 位點(diǎn)、 398 位點(diǎn)、 1884位點(diǎn)發(fā)現(xiàn) 3 個(gè)可以群體遺傳學(xué)分析的 T/G 、 A/G 、 A/G 堿基替換，并與奶牛乳房炎性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。 因 385 位點(diǎn)多態(tài)性及其與乳房炎性狀的關(guān)聯(lián)分析 因 385 位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果及分析 隨 機(jī)取中國(guó)荷斯坦奶牛、三河牛和中國(guó)西門塔爾?；蚪M 品，根據(jù)表 物行擴(kuò)增，產(chǎn)物回收后直接測(cè)序。用 件中的 序進(jìn)行比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖 因的 385 位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè) T/G，引起了蛋白質(zhì)氨基酸天冬氨酸 /谷氨酸的變化，導(dǎo)致等位基因 A 變成了等位基因 B。 385 位點(diǎn) 圖 因 385 位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果比對(duì) of 85 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 32 因 385 位點(diǎn) 增結(jié)果 根據(jù) 因（ 錄號(hào)： 列設(shè)計(jì)該位點(diǎn)的特異性引物，如表 1擴(kuò)增片斷為 因的 691 1138第 2 外顯子上的片斷，共 448位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物如圖 示，擴(kuò)增片斷明亮、特異性好，可以進(jìn)行后繼試驗(yàn)。 因 385 位點(diǎn)酶切電泳結(jié)果 經(jīng)分析 因 385 位點(diǎn)的突變可以用 進(jìn)行酶切檢測(cè)多態(tài)性。在擴(kuò)增的 448的酶切位點(diǎn)，酶切片斷大小分別為 44841207 本研究采用了聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)酶切結(jié)果使酶切的圖片更清楚 。酶切結(jié)果顯示在 385位點(diǎn)有三種基因型， 4107 484107 48該結(jié)果證實(shí)了在 385點(diǎn)處存在的 T/G 突變。圖 酶切產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。 圖 因 385 位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果 85 1 2 3 4 5 6 7 448 1 2 3 4 5 圖 10% 聚丙烯酰胺凝膠分析 酶切 CR 0% 691268國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第 三 章 結(jié)果與分析 33 因 385 位點(diǎn)的基因型頻率、基因頻率分析 由表 以看出， A 等位基因在所在的中國(guó)荷斯坦奶牛、三河牛 2 個(gè)奶牛群體中頻率高于 B 等位基因，而在中國(guó)西門塔爾牛群體中基因頻率略低于 B 等位基因； 因型在中國(guó)荷斯坦奶牛、三河牛 2 個(gè)群體 中最低，而在中國(guó)西門塔爾牛群體中 因型頻率最高。 表