博士學(xué)位論文 化通氣策略與 急性肺損傷的影響及其機(jī)制研究 姓 名：郭忠良 學(xué) 號(hào)： 0710110023 所在院系：醫(yī)學(xué)院 學(xué)科門(mén)類(lèi)：醫(yī)學(xué) 學(xué)科專(zhuān)業(yè)：內(nèi)科學(xué) 指導(dǎo)教師：梁永杰 副指導(dǎo)教師：任 濤 二一年五月 A in of 0710110023 2010 FC 郭忠良 同濟(jì)大學(xué) 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 本人完全了 解同濟(jì)大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意如下各項(xiàng)內(nèi)容：按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存學(xué)位論文的印刷本和電子版，并采用影印、縮印、掃描、數(shù)字化或其它手段保存論文；學(xué)校有權(quán)提供目錄檢索以及提供本學(xué)位論文全文或者部分的閱覽服務(wù)；學(xué)校有權(quán)按有關(guān)規(guī)定向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或者機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版；在不以贏利為目的的前提下，學(xué)?？梢赃m當(dāng)復(fù)制論文的部分或全部?jī)?nèi)容用于學(xué)術(shù)活動(dòng)。 學(xué)位論文作者簽名： 年 月 日 同濟(jì)大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本學(xué)位論文的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、已公開(kāi)發(fā)表或者沒(méi)有公開(kāi)發(fā)表的作品的內(nèi)容。對(duì)本論文所涉及的研究工作做出貢獻(xiàn)的其他個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名： 年 月 日摘要 I 摘 要 急性肺損傷（ （ 臨床常見(jiàn)危重 癥 。雖然隨著機(jī)械通氣策略的改進(jìn)和支持治療的進(jìn)展， 死亡率有所下降，但 仍高達(dá) 35 40 。 一連續(xù)的病理過(guò)程，其中 早期表 現(xiàn) 。目前普遍認(rèn)為 一種失控的炎癥反應(yīng)，但 切的 發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，而多數(shù)拮抗或中和炎癥介質(zhì)的藥物，包括細(xì)胞因子選擇性抑制劑 ， 療效并不理想。 由于細(xì)胞因子數(shù)量及其種類(lèi)繁多，相互作用復(fù)雜， 形成了一個(gè)級(jí)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，僅能針 對(duì)幾種細(xì)胞因子或介質(zhì)的治療難以阻止 。那么，是否還有其他途徑來(lái)改善或調(diào)控 過(guò)度表達(dá)的炎癥呢？ 全氟化碳 （ 一類(lèi)含 8 個(gè)碳、簡(jiǎn)單氟化的烴化物，具有極高的氣溶性，是氣體交換理想的介質(zhì)。同時(shí)， 具有局部抗炎及肺表明活性物質(zhì)替換作用。但以 介質(zhì)的部分液體通氣（ 床應(yīng)用效果并不理想，可能的原因 與通氣策略選擇不當(dāng) 有關(guān) 。但優(yōu)化通氣策略是否可以改善 后尚有待于進(jìn)一步證實(shí)。 新近證明的 一類(lèi) 高度 保守的、內(nèi)源性非蛋白編碼 、長(zhǎng)度約為 20 25小分子 單鏈 主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，估計(jì) 調(diào)控 著 30 的 動(dòng)物 基因。 近幾年，內(nèi)毒素介導(dǎo)炎癥反應(yīng) 達(dá)譜變化國(guó)外已有少量報(bào)道，但 炎癥失控的 的變化情況國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。以 靶基因的研究目前主要集中在腫瘤領(lǐng)域，那么通過(guò) 擬或拮抗進(jìn)行 向干擾是否對(duì) 有效，尚有待于進(jìn)一步探討。 研究目的 1. 探討 2. 探討 選 出 具有免疫細(xì)胞調(diào)控功能的 探討其對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)和可能靶基因的調(diào)控作用。 3. 通過(guò)建立 慢病毒表達(dá)載體，探討 從而 為 同濟(jì)大學(xué)博士學(xué)位論文 研究方法 第 一 部分 24只健康幼豬麻醉后給予機(jī)械通氣，設(shè)置參數(shù)為 0 氧濃度 毒素 隨機(jī)分為 4組（ n=6/組）： 1）單純機(jī)械通氣組（ 2）部分液體通氣組（ 氣管內(nèi)給予全氟化碳 10 ml3）氣管內(nèi)吹氣組，在機(jī)械通氣時(shí)氣管內(nèi)持續(xù)吹氣（ 2 l 4）聯(lián)合組（ 記錄 心肺功能和氣體交換參數(shù)，測(cè)定血清 第 二 部分 96只 4鼠，隨機(jī)分成 2組， 分別 為 n=80） 和 n=16）。腹腔 內(nèi) 注射 10mg/同體積 隨機(jī)取 同時(shí)間點(diǎn)（ 2h、 6h、 12h、 184h）和小鼠 24h)各 6只，眼球 采 血 后處死小鼠。測(cè)定 肺干濕比 ， 觀察肺組織巨噬細(xì)胞的 浸潤(rùn) 情況 ，檢測(cè)血清中 量，芯片技術(shù)測(cè)定肺組織 余鼠行生存率觀察。 第 三 部分 培養(yǎng) 重懸 后 加入 100ng/養(yǎng)。流式細(xì)胞 技術(shù) 檢測(cè) 芯片技術(shù)測(cè)定 ，將 2積比 1:50混合，繼續(xù)培養(yǎng) 12察細(xì)胞形態(tài) 并進(jìn)行 第 四 部分 從基因組中 用 和 雙酶切，連接入慢病毒表達(dá)載體。 54只 4鼠，隨機(jī)分為 照組 和 靜脈注射 200l含 1 108/ 1 108/ 24 注射 10mg/或同體積 同第二部分方法觀察小鼠肺組織炎癥反應(yīng)、血清細(xì)胞因子含量變化 及存活時(shí)間。 結(jié)果 第 一 部分 除 外所有治療組 氣效率指數(shù)（ 呼氣潮氣量（ 改善。 關(guān)治療組同時(shí)改善心率、呼吸頻率、脈搏輪廓心輸出量（ 體循環(huán)血管阻力（ 動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性（ 平均氣道阻力（ 平均氣道阻壓（ 聯(lián)合組較單獨(dú)治療組有更高的 織學(xué)檢查提示各治療組肺損傷程度有所減輕，其中聯(lián)合治療組改善更加顯著。 聯(lián)合治療組各細(xì)胞因子下降幅度高于單純 療組，但摘要 比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著。 第 二 部分 射 24h 后，小鼠的毛發(fā)紊亂、活動(dòng)能力明顯下降， 72h 內(nèi)有 25 的小鼠相繼死亡。 小鼠肺組織外觀充血嚴(yán)重，濕 /干比明顯增加 ，組織學(xué)檢查 顯示 肺組織明顯 炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn) 和肺水腫 。 血清 量增加， 其中 顯著 。 免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺組織巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加。 不同時(shí)段 肺組織中 達(dá)譜 與 理組小鼠 顯著不同 ， 共有 76 個(gè) 現(xiàn) 上調(diào)和 35 個(gè) 現(xiàn) 下調(diào)， 其中 具 時(shí)間依賴(lài)性，在 12h 開(kāi)始 各時(shí)間點(diǎn) 均超過(guò) 4 倍 上調(diào) 。 多數(shù)上調(diào)和下調(diào)的 短暫性改變，不同時(shí)間上調(diào)和下調(diào) 達(dá)譜有顯著差異。 用 驗(yàn)證 熟體在 理小鼠肺組織中的表達(dá)，結(jié)果與前面 片檢測(cè)的結(jié)果一致。 第 三 部分 胞在 激后細(xì)胞形態(tài)明顯增大，細(xì)胞核增多，增殖能力明顯增強(qiáng)；細(xì)胞 分子 協(xié)同刺激分子 表達(dá)明顯增加。 片測(cè)定發(fā)現(xiàn)，共有 18 個(gè) 現(xiàn) 上調(diào)， 19 個(gè) 下調(diào)。雖然表達(dá)結(jié)果與我們前期體內(nèi)試驗(yàn)肺組織 達(dá)譜有顯著差異，但 表達(dá) 與肺組織某些時(shí)段的結(jié)果相吻合。 異探針?lè)?yàn)證 熟體的變化，結(jié)果與芯片相 符。染 細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯增強(qiáng)，形態(tài)增大，同時(shí) 子表達(dá)增加，而 達(dá)明顯降低； 相反， 分細(xì)胞發(fā)生脫落，同時(shí) 分子和子表達(dá)下降， 達(dá)顯著增加。 第 四 部分 構(gòu)建 義核酸序列的慢病毒表達(dá)載體 ，并通過(guò) 測(cè)序驗(yàn)證 。體內(nèi)試驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)，與空載體對(duì)照組 比較 ， 處理 組 激 小鼠的狀態(tài)明顯改善，生存率顯著提高 ； 肺外觀充血明 顯減輕，肺濕 /干比降低 ； 肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn) 減少；同時(shí)小鼠 血清中 量 明顯降低（ p=1.5 .5 .5 .5 .5 圖 義核酸體內(nèi)對(duì) 型小鼠血清 作用 of SO on LI c 00ul SO or 108/24 10mg/ 4 of 論 急性肺損傷是失控的炎癥反應(yīng)，其炎癥過(guò)程受到多種 調(diào)控。 36通過(guò) 術(shù)對(duì)霧化吸入 鼠誘發(fā)固有免疫反應(yīng)時(shí) 104個(gè) 表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)吸入 h 后 46 個(gè) 現(xiàn)快速而短暫的升高，并且與 質(zhì)細(xì)胞 衍生趨化因子（ 巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（ 表達(dá)下降密切相關(guān)，提示 有調(diào)節(jié)炎癥性細(xì)胞因子的作用。 37發(fā)現(xiàn) 導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞 顯上調(diào)而 顯下調(diào)。采用腹腔內(nèi)注射 可以取得相似的效果，給予 以導(dǎo)致 變化，而經(jīng)蛋白酶體抑制劑 處理則可以阻斷上述變化，提示這 2 種 少可以短暫調(diào)控 錄活性。 38報(bào)道 顯上調(diào)。我們的前期研究提示，在 導(dǎo) 型和巨噬細(xì)胞株 明顯上調(diào)。I L L T N F - 0 . 00 . 51 . 01 . 52 . 02 . 5L P S + p m i R - c o n S + p m i R - 1 5 5 A S O*66 同時(shí) 擬（ 拮抗（ 以顯著改變巨噬細(xì)胞的活性。 目前關(guān)于 向干擾治療的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，并且取得了一定的成效。在美國(guó)，部分 經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。 但在 域的研究尚為空白。 由于 情危重，病死率高，現(xiàn)有治療手段尚有各種局限性 ，探索新的治療途徑很有必要。雖然目前公論 控 衡的炎癥反應(yīng) ， 但 這種反應(yīng)的調(diào)控情況及相關(guān)機(jī)制依然是謎，而應(yīng)用 國(guó) 際上 尚未見(jiàn)報(bào)道。 在本研究中，我們 在前期體外實(shí) 驗(yàn)基礎(chǔ)上， 通過(guò)構(gòu)建 義核酸（ 列的慢病毒表達(dá)載體，將 先通過(guò)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，觀察其對(duì) 導(dǎo)小鼠影響。結(jié)果顯示，與空載體（ 導(dǎo)對(duì)照組相比， 存率顯著提高；同時(shí) 理組小鼠肺外觀充血明顯減輕，肺濕 /干比顯著降低，組織學(xué)檢查提示 理組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯降低；用免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn) 理組小鼠肺組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù) 量明顯降低； 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，理組 鼠血清中 水平明顯降低（ p 可溶解大量的 37 和一個(gè)大氣壓時(shí)，溶解度分別為 530 和 1600 2100 ，對(duì) 溶解力比水分別高出 20 倍和 3 倍，與氧結(jié)合力是全血的 2 3 倍； 不透射線，故臨床上很容易判斷其在肺內(nèi)的充盈程度和分布，此外，在一定程度上起到氣道造影劑的作用，有助于觀察胸腔積液、氣胸、肺氣腫、肺不張等疾病。當(dāng)然，這一特性也會(huì)使判斷浸潤(rùn)性肺疾患的性質(zhì)和判斷胸腔內(nèi)置管的位置變得困難； 幾乎不被人體吸收，極少通過(guò)肺泡進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，血中含量 8L/， T 降低不再是線性而是下降更明顯，提示流速 8L/，肺泡通氣增加。 4 6L/為安全可靠。 在具體操作時(shí)，操作者應(yīng)熟悉 工作原理和管路的連接方式， 道的直徑應(yīng)在 2右 ，過(guò)細(xì) 體阻力太大，過(guò)粗則使整個(gè)呼吸阻力增大。管路導(dǎo)入應(yīng)通過(guò)特制的接頭，密封性應(yīng)好，注意無(wú)菌操作，特別是在吸痰時(shí)由于管的影響，多需將 管撤出后才能完成吸痰工作，延長(zhǎng)了氣道開(kāi)放的時(shí)間，增加了感染的機(jī)會(huì)，在助手配合下能縮短吸痰時(shí)間。 體最好能經(jīng)過(guò)加溫和濕化。 由于 管引起的氣管插管內(nèi)徑減小及氣流阻力的作用，可產(chǎn)生一定水平的內(nèi)源性 別是當(dāng)吹氣流量大時(shí)這種作用更明顯，當(dāng)其比較明顯時(shí)應(yīng)引起注意，需進(jìn)行處理，如適當(dāng)減少所加外源性 采取延長(zhǎng)呼氣時(shí)間等措施。 4. 臨床應(yīng) 用 臨床上急性肺損傷患者應(yīng)用 正壓通氣，能有效地清除 ,17。 19對(duì)符合體外膜 式氧合 （ 準(zhǔn)的 6 例重癥 者行 向氣流流速 4L/ 平均下降 22 。 20研究了 14 例急性呼吸衰竭行 患者，其中 7 例短暫 (90s)脫離通氣機(jī)行 比，前者使 降（ 者使 降（ .6）外 7 例比較了離機(jī)吸痰時(shí)用或不用 果表 明吸痰時(shí)予 防止動(dòng)脈血氧去飽和及吸痰引起的肺容積下降，說(shuō)明 以作為一種簡(jiǎn)單有效的方法防止血氧降低。 21研究了 12 例慢性呼吸衰竭行機(jī)械通氣患者撤機(jī)綜述三、氣管內(nèi)吹氣在保護(hù)性通氣策略中的研究進(jìn)展 99 時(shí) 效果。結(jié)果表明，經(jīng)口氣管插管的患者撤機(jī)后用 D/每分通氣量隨氣流流速的上升而有明顯下降，經(jīng)氣管切開(kāi)插管的患者行 效果不如前者，其原因可能為氣管切開(kāi)本身已減少了解剖死腔。因此，以為臨床上撤機(jī)困難，需要減少死腔和呼吸功、增加肺泡通氣的患者提供幫助。 單獨(dú)用于部分慢性呼吸衰竭患者 ，能降低 每分通氣量。2等報(bào)道 5 例 柱側(cè)凸、肌營(yíng)養(yǎng)不良引起的慢性 留 (平均 6 10者，予 5L/內(nèi)空氣行 低每分通氣量18 ， 5 ， 7 ，其中 2 例行 12 個(gè)月，與通過(guò)氣管切開(kāi)的導(dǎo)管呼吸相比，氧合較好， 所改善或保持不變。另有研究表明 降低慢性呼吸系疾病患者的呼吸氧耗 23。 者中的應(yīng)用效果隨阻塞類(lèi)型的不同而不同。肺實(shí)質(zhì)相對(duì)正常的慢性支氣管炎患者主要因氣 道本身病變、阻塞致 留， 果較好；而肺氣腫的患者因肺實(shí)質(zhì)異常使 多，氣道阻塞為功能性壓迫，故 效果尚不明確。不對(duì)稱(chēng)性疾病限制肺的充氣能力也適于用 肺切除術(shù)后或單側(cè)肺損傷。 防止吸痰時(shí)動(dòng)脈血氧飽和度下降，并有利于撤機(jī)的進(jìn)行。 呼吸衰竭的原發(fā)病因?yàn)樯窠?jīng)肌肉無(wú)力的患者也適于用 于這些患者呼吸所需工作量與實(shí)際能力間不成比例而造成 、 留和呼吸困難，肺實(shí)質(zhì)通常保持相對(duì)正常， 比例較大，故可提高 果。 5. 存在的問(wèn)題 主要作用為 減少 T 下降，如果 大，則效果較差。 4等證明伴有大量肺泡死腔的肺損傷應(yīng)用 ，其減少死腔通氣的作用減低。 使痰液變得粘稠，甚至氣管粘膜出現(xiàn)潰瘍，故 源的溫化濕化問(wèn)題尤為重要 15,23。 長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用 能導(dǎo)致分泌物的濃縮和溜留，特別是當(dāng)吹入氣體濕化不足時(shí)，即使是短暫的呼出道阻塞，導(dǎo)管也能很快吹入大量氣體，迅速導(dǎo)致威脅生命的氣壓傷。故有人建議在氣路中用一種壓力釋放裝置，當(dāng)氣道突然阻塞時(shí)能自動(dòng)停止導(dǎo)管內(nèi)氣流吹入，或通過(guò)在腔外放置導(dǎo)管或經(jīng)包埋 在氣管插管壁中的通道吹入氣體等方法以解決腔內(nèi)導(dǎo)管影響呼氣流量和氣道分泌物的清除 25。 不能用阻斷呼吸通路的方法測(cè)量呼吸參數(shù)，因其易致肺損傷且由于導(dǎo)管氣流影響，結(jié)果不準(zhǔn)確。 在應(yīng)用某些通氣方式（如壓力控制通氣）加用 100 時(shí)，氣道峰壓常常會(huì)超過(guò)預(yù)置壓力水平而增加氣壓傷的危險(xiǎn)，并對(duì)血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生不良影響 21。 導(dǎo)管內(nèi)高流速的氣流增加支氣管表面的局部壓力，足以引起粘膜損傷 25。 6. 展望 為一種新的輔助通氣技術(shù)，具有很好的應(yīng)用前景。特別是對(duì)肺順應(yīng)性下降、氧合惡化的 者， 以明顯降低預(yù)設(shè)潮氣量和相同 件下氣道支持壓力，從而有效減少氣壓傷的發(fā)生，并且有利于氧合能力的改善。當(dāng)然， 術(shù)有待于進(jìn)一步完善，其中主要是其安全性問(wèn)題，諸如當(dāng)有氣道機(jī)械阻塞時(shí)如何防止肺過(guò)度充氣和避免肺內(nèi)壓驟然升高， 體的濕化問(wèn)題及長(zhǎng)期應(yīng)用 對(duì)氣管粘膜的損傷問(wèn)題等。今后應(yīng)重點(diǎn)解決氣道濕化不良、防止氣道內(nèi)壓驟升、 路減少氣管插管內(nèi)徑等問(wèn)題。開(kāi)展隨機(jī)、前瞻、對(duì)照性臨床研究，明確 術(shù)能否顯著降低急性肺損傷患者 生率和病死率。另外長(zhǎng)期應(yīng)用 安全性尚需 進(jìn)一步探討。 參考文獻(xiàn) 1. . as an to 2002, 8(2): 1712. 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