1、第五章 微生物檢驗(yàn)方法 1 微生物檢驗(yàn)方法總則 General principles 1 范圍本部分規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)的基本要求。 本部分適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。 2 儀器和設(shè)備2.1 天平，0-200g，精確至0.1g。 2.2 高壓滅菌器。 2.3 振蕩器。 2.4 三角瓶，250mL、150mL。 2.5 玻璃珠。 2.6 玻璃棒。 2.7 滅菌刻度吸管，10mL、1mL。 2.8 恒溫水浴箱。 2.9 均質(zhì)器或研缽。 2.10 滅菌均質(zhì)袋。 3 培養(yǎng)基和試劑3.1 生理鹽水 成分：氯化鈉 8.5g 蒸餾水加至 1000mL 制法：溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶

2、內(nèi)，每瓶90mL，121高壓滅菌20min。 3.2 SCDLP液體培養(yǎng)基 成分：酪蛋白胨 17g 大豆蛋白胨 3g 氯化鈉 5g 磷酸氫二鉀 2.5g 葡萄糖 2.5g 卵磷脂 1g 吐溫80 7g 蒸餾水 1000mL 制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調(diào)pH為7.27.3分裝，每瓶90mL，121高壓滅菌20min。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25左右使用。 注：如無(wú)酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。 3.3 滅菌液體石蠟。 制法：取液體石蠟50mL，121高壓滅菌20min。 470 3.4 滅菌吐溫80。 制法：取吐溫80

3、50mL，121高壓滅菌20min。 4 樣品的采集及注意事項(xiàng)4.1 所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從不少于2個(gè)包裝單位的取樣中共取10g或10mL。包裝量小于20g的樣品，采樣時(shí)可適當(dāng)增加樣品包裝數(shù)量。 4.2 供檢樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開(kāi)，防止樣品被污染。 4.3 接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫(xiě)檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)，樣品應(yīng)置于室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。 4.4 若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，如微生物、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品做微生物檢驗(yàn)，再將剩余樣

4、品做其他分析。 4.5 在檢驗(yàn)過(guò)程中，從打開(kāi)包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在符合生物安全要求的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。 5 供檢樣品的制備5.1 液體樣品 5.1.1 水溶性的液體樣品，用滅菌吸管吸取10mL樣品加到90mL滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1：10檢液。 5.1.2 油性液體樣品，取樣品10g，先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80，在4044水浴中振蕩混合10min，加入滅菌的生理鹽水75mL（在4044水浴中預(yù)溫），在4044水浴中乳化，制成1：10的懸液。 5.2 膏、霜、乳劑半固體狀樣品 5.2.1 親水性

5、的樣品：稱(chēng)取10g，加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。用其上清液作為1:10的檢液。 5.2.2 疏水性樣品：稱(chēng)取10g，置于滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70mL滅菌生理鹽水，在4044水浴中充分混合，制成1：10檢液。 5.3 固體樣品 稱(chēng)取10g，加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1：10的檢液。 使用均質(zhì)器時(shí)，則采用滅菌均質(zhì)袋，將上述水溶性膏、霜、粉劑等，稱(chēng)10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min2min；疏水性膏、霜及眉筆、口

6、紅等，稱(chēng)10g樣品，加10mL滅菌液體石蠟，10mL吐溫80，70mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min5min。 471 2 菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法 Aerobic Bacterial Count 1 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。 本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。 2 定義2.1 菌落總數(shù) Aerobic bacterial count 化妝品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等），1g（1mL）檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性和兼性厭氧菌落總數(shù)。 測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是

7、對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。 3 儀器和設(shè)備3.1 三角瓶，250mL。 3.2 量筒，200mL。 3.3 pH計(jì)或精密pH試紙。 3.4 高壓滅菌器。 3.5 試管，18mm150mm。 3.6 滅菌平皿，直徑90mm。 3.7 滅菌刻度吸管，10mL、1mL。 3.8 酒精燈。 3.9 恒溫培養(yǎng)箱，361。 3.10 放大鏡。 3.11 恒溫水浴箱，551。 4 培養(yǎng)基和試劑4.1 生理鹽水：見(jiàn)總則中3.1。 4.2 卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 成分：蛋白胨 20g 牛肉膏 3g 氯化鈉 5g 瓊脂 15g 卵磷脂 1g 吐溫80 7g 蒸餾水 1000mL 制法：先將卵磷脂加

8、到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調(diào)pH值為7.1472 7.4，加入瓊脂，121高壓滅菌20min，儲(chǔ)存于冷暗處備用。 4.3 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC） 成分：TTC 0.5g 蒸餾水 100mL 制法：溶解后過(guò)濾除菌，或115高壓滅菌20min，裝于棕色試劑瓶，置4冰箱備用。 5 操作步驟5.1 用滅菌吸管吸取1：10稀釋的檢液2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中（注意勿使

9、吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，制成1:100檢液。吸取2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，等，每個(gè)稀釋度應(yīng)換1支吸管。 5.2 將融化并冷至4550的卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置361培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h2h。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置361培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h2h，為空白對(duì)照。 5.3 為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80

10、營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入1mL 0.5%的TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無(wú)變化。 6 菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用5倍10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。 7 菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法7.1 首先選取平均菌落數(shù)在30300之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報(bào)告之（

11、見(jiàn)表1中例1）。 7.2 若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30300之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來(lái)決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2則以其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例2及例3）。 7.3 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例4）。 7.4 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1例5）。 7.5 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，其中一個(gè)稀釋度大于300，而相鄰的另一稀釋度小于30時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例6）。 7.6 若所有的稀釋度均無(wú)菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每g或每mL小于10CFU。 7.7 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10以?xún)?nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100時(shí)，采用二位有473 效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示（見(jiàn)表1報(bào)告方式欄）。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。 表1 細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式 例次 不同稀釋度平均菌落數(shù) 10-1 10-2 10-3 兩稀釋度 菌數(shù)之比 菌落總數(shù) （CFU/mL或CFU/g） 報(bào)告方式 （CFU/mL或CFU/g） 1 1365 164 20 16400 16000