1、三七總皂苷部分逆轉(zhuǎn)黏附誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞耐藥性【摘要】 目的： 研究三七總皂苷（PNS）對(duì)骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226黏附及黏附誘導(dǎo)耐藥的影響. 方法： 采用MTT法檢測(cè)PNS和/或阿霉素（Adr）對(duì)RPMI8226細(xì)胞的毒性作用；熒光染料二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）標(biāo)記并流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RPMI8226細(xì)胞與纖連蛋白（FN）黏附率. 結(jié)果： RPMI8226細(xì)胞與FN黏附2，12 h，其黏附率分別為(55.631.56)%，(65.422.46)%；經(jīng)亞細(xì)胞毒濃度PNS（50 mg/L）預(yù)處理后，其黏附率分別降為(33.241.29)%,(34.161.59)%，處理前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0

2、.05）；FN黏附12 h后，瘤細(xì)胞對(duì)Adr的IC50值為（2.700.24） mol/L，高于BSA對(duì)照組（2.030.13） mol/L（P0.05). 結(jié)論： PNS可降低RPMI8226細(xì)胞與FN的黏附率，并能部分逆轉(zhuǎn)黏附介導(dǎo)的骨髓瘤耐藥. 【關(guān)鍵詞】 三七總皂苷 多發(fā)性骨髓瘤 RPMI8226 黏附 抗藥性 0引言 多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一種難以治愈的漿細(xì)胞惡性腫瘤，難治性的生物學(xué)基礎(chǔ)是瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互黏附介導(dǎo)的多藥耐藥形成（cell adhesion mediated drug resistance，CAM?DR）. MM細(xì)胞與E

3、CM間相互黏附主要通過細(xì)胞表面的整合素（integrin）與其配體纖連蛋白（fibronectin, FN）結(jié)合. 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用封閉性抗體阻斷整合素與FN間的相互作用，瘤細(xì)胞與FN間的黏附性明顯下降，其CAM?DR也得以完全或部分逆轉(zhuǎn)1. 所以尋找高效低毒藥物以下調(diào)MM細(xì)胞的黏附性，從而增加瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性具有重要意義. 中藥三七總皂苷（panax notoginoside，PNS）能抑制血小板的黏附與聚集，進(jìn)而發(fā)揮其活血化瘀功效2. 鑒于血小板的黏附、聚集與MM細(xì)胞的黏附有著類似的生物學(xué)過程，因此，PNS能否下調(diào)骨髓瘤細(xì)胞黏附性從而逆轉(zhuǎn)黏附介導(dǎo)的腫瘤耐藥值得進(jìn)一步研究. 為此，我們

4、以人MM細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞為材料，初步探討PNS對(duì)MM細(xì)胞黏附性及CAM?DR的影響. 1材料和方法 1.1材料血塞通注射液源自昆明制藥集團(tuán)股份有限公司（每支含生藥250 mg，主要成份為人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1），-20分裝凍存；注射用鹽酸阿霉素（adriamycin，Adr）源自山西普德藥業(yè)有限公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司. 四氮唑藍(lán)（MTT），羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯5(6)?carboxyfluorescein diacetate N?succinimidyl ester，CFSE為Sigma產(chǎn)品；纖連蛋白（FN）為Becton D

5、ickinson產(chǎn)品，注射用水溶解分裝，-20凍存. 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞來源于蘇州大學(xué)免疫學(xué)教研室. 細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于50 mL/L CO2，飽和濕度、37培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期. 1.2.2MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI8226細(xì)胞按2.0104/孔種入96孔板，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)PNS濃度為50，75，100，200，300，400，600，800 mg/L，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，處理組中細(xì)胞分別加入不同濃度的PNS，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，于加藥后24 h檢測(cè)，檢測(cè)前每孔

6、加入MTT溶液（5 g/L） 10 L，37孵育4 h后，加入100 L 100 g/L SDS（含0.01 mol/L HCl），充分溶解結(jié)晶物3，570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率（1-試驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)100. 1.2.3黏附實(shí)驗(yàn)用無菌過濾的TSM(20 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，pH8.0)配制50 mg/L的FN及10 g/L BSA4，每孔50 L分別包被96孔板，4過夜. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI8226細(xì)胞（1.0109/L），37，50 mL/

7、L CO2條件下以2.5 mg/L CFSE標(biāo)記30 min，加無血清RPMI1640液孵育12 h. CFSE標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)非抑制濃度PNS（50 mg/L）預(yù)孵育2 h后，按細(xì)胞/2.0104孔，種入96孔板. 實(shí)驗(yàn)分4組： FN包被組； BSA包被組； PNS+FN組； PNS+BSA組. 各組細(xì)胞分別37，50 mL/L CO2中培養(yǎng)2 h與12 h. 收集上清（含未黏附細(xì)胞），經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE陽性細(xì)胞數(shù). 細(xì)胞黏附率(%) =（1-上清液細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）100%5. 1.2.4PNS對(duì)RPMI8226細(xì)胞CAM?DR的影響FN與BSA包被處理同前. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI8226細(xì)

8、胞經(jīng)非抑制濃度PNS（50 mg/L）預(yù)孵育2 h后，按細(xì)胞2.0104/孔，種入96孔板，黏附12 h，每孔分別加入不同濃度Adr（0.25，0.5，0.75 mol/L），作用1 h，離心棄上清，加完全RPMI1640液培養(yǎng)24 h. 按MTT法測(cè)定生長(zhǎng)抑制率()6. 實(shí)驗(yàn)分4組: FN+Adr組； BSA+Adr組； PNS+Adr+FN組； PNS+Adr+BSA組. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS11.0軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xs表示，組間均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn). 2結(jié)果 2.1PNS對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖的影響PNS對(duì)RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度依

9、賴性，其24 h IC50值為(216.522.31) mg/L（圖1）. 圖1不同濃度PNS對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖的影響 2.2PNS對(duì)RPMI8226細(xì)胞黏附的抑制作用RPMI8226細(xì)胞黏附2 h，F(xiàn)N組黏附率(55.631.56)%高于PNS+FN組(33.241.29)%（P0.05），PNS+FN組黏附率高于BSA組（9.560.85）%及PNS+BSA（9.010.76）%（P0.05），其余實(shí)驗(yàn)組12 h黏附率無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化. 2.3PNS逆轉(zhuǎn)RPMI8226細(xì)胞CAM?DR經(jīng)Adr作用24 h后，BSA對(duì)照組呈濃度依賴性凋亡，其IC50為（2.030.13） mol/L；M

10、M細(xì)胞與FN黏附后可以挽救Adr誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其IC50 （2.700.24） mol/L，高于BSA對(duì)照組(P0.05），說明PNS能部分逆黏附介導(dǎo)的MM細(xì)胞耐藥性. 3討論 CAM?DR是多發(fā)性骨髓瘤難以治愈的主要生物學(xué)機(jī)制之一7. 篩選高效抑制瘤細(xì)胞黏附并且能逆轉(zhuǎn)其CAM?DR的藥物，已成為骨髓瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn). PNS可以抑制ADP,花生四稀酸、血小板活化因子、凝血酶、膠原等誘導(dǎo)的血小板聚集；也可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的粒細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而降低白細(xì)胞與細(xì)靜脈內(nèi)皮之間的黏附性. PNS的抗細(xì)胞黏附、抗血小板聚集作用極可能為其化“瘀”功效的生物學(xué)機(jī)制之一. 鑒于MM細(xì)胞與胞外基質(zhì)成分（

11、如纖連蛋白等）之間的相互黏附也可部分理解為中醫(yī)學(xué)的“瘀”癥，故利用PNS的化“瘀”功效下調(diào)MM細(xì)胞的黏附性,以部分逆轉(zhuǎn)黏附介導(dǎo)的MM耐藥性就具有潛在的研究?jī)r(jià)值. 本實(shí)驗(yàn)證實(shí),非抑制濃度PNS可顯著抑制RPMI8226細(xì)胞對(duì)基質(zhì)成分FN的黏附性，進(jìn)而降低FN黏附組MM細(xì)胞對(duì)阿霉素的IC50值. 表明PNS能部分逆轉(zhuǎn)MM細(xì)胞的CAM?DR，其效應(yīng)機(jī)制可能與下調(diào)MM細(xì)胞與FN間的黏附性有關(guān).【參考文獻(xiàn)】 1 Qing YW, Yao L, Tasato G, et al. Insulin?like growth factor I induces migration and invasion of h

12、uman multiple myeloma cellsJ.Blood,2004,103(1):301-308.2 李兆健. 中藥三七作用研究J. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1995,9(1):65.3 Qiang YW, Kitagawa M, Higashi M, et al. Activation of mitogen?activated protein kinase through alpha 5/beta 1 integrin is required for cell cycle progression of B progenitor cell line, Reh, on human mar

13、row stromal cellsJ. Exp Hematol, 2000,28(10):1147-1157.4 Zhang Z, Rehmann H, Price LS, et al. AF6 negatively regulates Rap1?induced cell adhesionJ. J Biol Chem, 2005,280:33200-33205.5 潘耀柱，陳協(xié)群，高廣勛，等. 酪氨酸激酶抑制劑逆轉(zhuǎn)黏附誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞的耐藥性J. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2006,14(2):267-270.6 Damiano JS, Cress AE, Hazlehurst LA, et al. Cell adhesion mediated drug resistance(CAM?DR): Role of integrins and resistance to apoptosis in human myeloma cell linesJ. Blood, 1999，93:1658-166