1、牛黃天龍膠囊（含藥血清）誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌 HECB細(xì)胞凋亡及其機制 08-05-08 10:19:00 編輯：studa20 作者：田彥玲，王玉花 ， 程建新，劉京生 【摘要】 目的 觀察牛黃天龍膠囊（含藥血清）對人子宮內(nèi)膜癌HECB細(xì)胞能否誘導(dǎo)凋亡并對其抗癌機制進行探討。方法 實驗組分低、中、高3個劑量組并設(shè)空白組和陽性對照組進行含藥血清的制備；MTT法觀察細(xì)胞毒作用；細(xì)胞排染法觀察瘤細(xì)胞直接損害實驗；吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色法及電鏡（TEM）下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測定細(xì)胞凋亡率并進行細(xì)胞周期分析，測定凋亡抑制蛋白survivin和凋亡效應(yīng)蛋白Cas

2、pase3的表達。結(jié)果 MTT法：人子宮內(nèi)膜癌HECB細(xì)胞經(jīng)含藥血清作用后細(xì)胞生長受到明顯抑制且以低劑量組抑制率最高。細(xì)胞排染法：同一時間段內(nèi)以低劑量組效果最好，不同時間段內(nèi)（24、48h）細(xì)胞抑制率顯著提高(P0.01)。AO/EB和TEM：實驗組均可見到典型細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。FCM：實驗組各組細(xì)胞凋亡率與空白組相比差異有顯著性(P0.01)且以低劑量組最高，細(xì)胞周期分析顯示實驗組G0/ G1期細(xì)胞明顯增多而S期細(xì)胞明顯減少與空白組相比差異有顯著性(P0.01)，Survivin蛋白表達在空白組最高，在實驗組表達降低與空白組相比差異有顯著性(P0.01)，Caspase3表達則相反，在實

3、驗組表達最高與空白組相比差異有顯著性(P0.01)。結(jié)論 復(fù)方中藥 “牛黃天龍膠囊”（含藥血清）能夠使人子宮內(nèi)膜癌HECB細(xì)胞生長阻滯在G0/G1期并可誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌HECB細(xì)胞凋亡；并可降低凋亡抑制蛋白survivin表達同時可提高凋亡效應(yīng)蛋白Caspase3表達，這可能是其誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌HECB細(xì)胞凋亡的機制之一；對人子宮內(nèi)膜癌HECB細(xì)胞的抗腫瘤作用并非濃度越大效果越好而有一最適劑量。 【關(guān)鍵詞】 血清藥理學(xué)；細(xì)胞凋亡；AO/EB雙熒光染色法；TEM；FCM. Key words：Pharmacology; Cell apoptosis; AO/EB double fluoresce

4、nt dye staining; Transmission electron microscope；Flow cytometry 大量研究表明，復(fù)方中藥制劑可通過阻滯腫瘤細(xì)胞生長周期，影響癌基因和抑癌基因表達等途徑發(fā)揮抗癌活性1。我們所用方劑“牛黃天龍膠囊”，是在傳統(tǒng)抗腫瘤中藥方劑“犀黃丸”2基礎(chǔ)上添加了新的抗腫瘤中藥成分，針對婦科腫瘤而研制的新的抗癌組方。本研究運用血清藥理學(xué)方法從細(xì)胞、分子和基因水平對牛黃天龍膠囊（含藥血清）誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌HECB凋亡的作用機制進行了初步探討，旨在為篩選有效的抗婦科腫瘤的中藥方劑提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 實驗動物 Waster大鼠40只，雌性

5、，清潔級動物，體重(28030)g，合格證號：DK04020086，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。 1.2 實驗藥物 復(fù)方中藥牛黃天龍膠囊主要由牛黃、麝香、乳香、沒藥等十幾味中藥組方（生藥購自河北省石家莊樂仁堂中藥飲片廠）由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥劑室按工藝制成，相當(dāng)于含生藥量每膠囊2.5g。 1.3 細(xì)胞株 人子宮內(nèi)膜癌中分化細(xì)胞系HECB細(xì)胞由北京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院北京醫(yī)院婦科科研室提供。 1.4 主要儀器和試劑 PRMI1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶，丫啶橙（AO），溴化乙啶（EB）由美國Sigma公司提供；胎牛血清由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供；順鉑（凍干型）購

6、自山東省德州制藥廠，產(chǎn)品批號031001；CO2培養(yǎng)箱，美國Forma Scientific公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡（XS2D2型），熒光顯微鏡（Nikon UFX型）均購自日本Olympus公司；透射電子顯微鏡為日本日立H7500；流式細(xì)胞儀420為美國BD公司產(chǎn)品。 1.5 方法 1.5.1 含藥血清的制備3,4 將40只Wistar大鼠隨機分成5組：陰性對照組（空白組），實驗組（分高、中、低劑量組）和陽性對照組（順鉑組）。實驗組高、中、低三組每日用藥劑量分別按1/10LD50、1/20LD50、1/40LD50給藥，以每只2ml /次灌胃，陽性對照組采用腹腔注射每只1ml /次（劑量按每

7、只5mg/kg /天計算）。采用李儀奎“通法原則”方案，即每日劑量分2次灌胃（灌胃前禁食12h不禁水）連續(xù)3d，于第3d第1次給藥2h后再給藥一次，間隔1h以烏來糖腹腔注射麻醉，背位固定，無菌條件下腹主動脈取血，分離血清，56，30min滅活，0.2m過濾除菌，分裝，-20冰箱保存?zhèn)溆谩?1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人子宮內(nèi)膜癌HECB細(xì)胞置于含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中，在37，5% CO2，95%濕度條件下的培養(yǎng)箱中貼壁生長，以按0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 11比例配置的消化酶消化，3d傳一代。實驗分組：將制得的5組含藥血清即空白組、高、中、低實驗組和陽性對照順鉑組

8、分別加入PRMI培養(yǎng)基中，使各培養(yǎng)基的血清終濃度為10%5。 1.5.3 細(xì)胞抑制率的檢測（MTT法）6 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以110.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，再以2.0104/ml濃度接種于96孔板，每孔200l，實驗分5組，即空白組、高、中、低實驗組和陽性對照（順鉑）組，每組設(shè)4個復(fù)孔并設(shè)空白調(diào)零孔（除不加細(xì)胞外，余處理與其他各組相同）。將已接種HECB細(xì)胞的培養(yǎng)板置于37、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞進入對數(shù)生長期，棄去原培養(yǎng)基以PBS液洗兩遍，然后依次更換含10%藥物血清的PRMI1640培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和48h。

9、取出培養(yǎng)板，向每孔加入MTT20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150l，在微量震蕩器震蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解之后在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處讀取各孔光密度值（OD值）。瘤細(xì)胞抑制率=空白組平均光密度值實驗組平均光密度值/空白組平均光密度值。 1.5.4 吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）染色法觀察HECB細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化8 取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液以2105/ml接種于6孔板，每孔2ml，每組設(shè)4個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，更換含10%藥物血清的PRMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)

10、培養(yǎng)48h。分別消化制成1.0106/ml的細(xì)胞懸液，取100l受檢細(xì)胞懸液加入4.0l上述染液輕輕吹打均勻后取細(xì)胞懸液一滴滴在潔凈的載波片上，加蓋玻片后立即置于熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并攝片。 1.5.5 透射電鏡（TEM）觀察HECB細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化 收集含藥血清（空白組、實驗組）培養(yǎng)48h的HECB細(xì)胞，離心（1 000轉(zhuǎn)/分 15min），PBS洗滌3遍，沉淀細(xì)胞以2.5%戊二醛溶液前固定，1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，Epon812浸透、包埋、聚合、超薄切片、硝酸油檸檬酸鉛著色，涼干，在透射電鏡下觀察凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征并攝片。 1.5.6 細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的

11、測定 取1105/ml單細(xì)胞懸液0.1ml加入10%的雞紅細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)整儀器CV值在5%以內(nèi)。加入碘化丙錠（PI）（PI：50mg/L，triton100 1.0%）1 ml，在4冰箱染色30min，以500目銅網(wǎng)過濾使樣品成為合格的單細(xì)胞懸液上機檢測。 1.5.7 HECB細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Survivin和Caspase3的定量檢測 取單細(xì)胞懸液1106/ml，分別加入鼠抗人survivin單克隆抗體和鼠抗人Caspase3單克隆抗體0.1ml，室溫孵育30min，加入PBS 10ml洗滌一次，棄上清，加入羊抗鼠FITCIgG二抗工作液100l，避光室溫孵育30min，加入PBS10

12、ml離心同上，棄上清以除去未結(jié)合的熒光二抗，上機檢測前加入PBS 0.1ml，經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后上機檢測。檢測結(jié)果用熒光指數(shù)（fluorescence index，F(xiàn)I）或Xmode值表示。 1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)處理在SPSS 12.0軟件包內(nèi)進行。方法采用單因素方差分析和t檢驗。檢驗水準(zhǔn)=0.05，P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 MTT法 檢測牛黃天龍膠囊含藥血清對人子宮內(nèi)膜癌HECB細(xì)胞作用24h、 48h后， 細(xì)胞增殖受到明顯抑制， 與空白組相比差異均有顯著性(P0.01)，但并非濃度越高抑制率越高而以低濃度組抑制率最好。 同一劑量組24、 48h細(xì)胞抑制率相

13、比差異有顯著性(P0.01)， 見表1。 2.2 AO/EB雙熒光染色法 鏡下可見到空白對照組細(xì)胞以正常細(xì)胞為主，表現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，大小正常。細(xì)胞被AO染色呈均勻一致的綠色，并可表1 含藥血清對HECB細(xì)胞的生長抑制作用 MTT法在同一時間段,細(xì)胞生長抑制率與中、高組相比P0.01見到少量早期凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞染色增強，熒光亢進，細(xì)胞被染色呈黃綠色黃色熒光。實驗組中、高劑量組正常細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞增多并可見到晚期凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞被EB染色呈橙紅色，細(xì)胞體積縮小，部分細(xì)胞核破裂，呈現(xiàn)為大小不等、形態(tài)不規(guī)則的熒光染色碎片或梅花狀核形。低劑量組和陽性對照順鉑組正常細(xì)胞明顯減少，晚期凋亡細(xì)胞更多并可見到凋亡小體及細(xì)胞腫脹，體積增大，邊緣模糊，被染成桔紅色的壞死細(xì)胞見圖1。 2.3 實驗組人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，在電鏡下均可見到凋亡的早期信號，表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞的部分核膜向外呈銳角凸起，凋亡征象表現(xiàn)為核染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊，呈半月或新月狀聚集在核膜周邊，細(xì)胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變疏松并與胞膜融合形成一個個空泡及凋亡小體?？瞻讓φ战M則很少見到凋亡細(xì)胞征象（圖略）。 2.4 實