1、    據(jù)資料顯示，目前在全世界每年進(jìn)行的器官移植手術(shù)中，骨移植的數(shù)量僅次于輸血，居第二位。骨缺損如果范圍較小，骨端可以經(jīng)自身修復(fù)而愈合，但如果骨缺損范圍較大，則不可能自身修復(fù)。臨床已經(jīng)應(yīng)用的有鈦金屬、氧化鋁陶瓷、生物玻璃、磷酸三鈣（TCP）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)骨水泥以及各種羥基磷灰石為基礎(chǔ)的生物材料等，但上述材料由于自身某些缺陷而使其應(yīng)用受到限制，目前難以找到理想的大段骨替代材料。        碳酸鈣為主體的生物材料因其自身的Ca2+，CO32-是存在于正常人體體液中，具有良好的生

2、物相容性，與人體骨成長過程有類似性。近幾年來成為骨組織支架材料研究的新熱點(diǎn)。Science報(bào)道牡蠣殼的形成與珊瑚形成以及人體內(nèi)骨鹽沉積有高度相似性，研究采用亞洲沿海牡蠣，證實(shí)牡蠣殼的形成也是由粒細(xì)胞不斷分泌的無機(jī)鹽堆積而形成的礦物質(zhì)鹽，這就為將資源豐富的牡蠣殼開發(fā)成為具有良好性能的骨組織工程修復(fù)材料提供了理論上的可能。作者通過倒置顯微鏡觀察和MTT檢測，將牡蠣殼材料進(jìn)行體外細(xì)胞相容性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其生物相容性。1  材料與方法1.1  試驗(yàn)材料 (1)牡蠣殼材料的制備：取樂清灣無污染海域的近江牡蠣殼，物理清洗干凈后自然風(fēng)干，弱酸中浸泡2h并流水沖洗24h后自

3、然風(fēng)干。將牡蠣殼碾碎至0.5cm×0.5cm大小。試驗(yàn)前121高壓滅菌20min備用。(2)細(xì)胞：鼠原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，SD大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。(3)培養(yǎng)液：DMEM（Gibco）；胎牛血清（Gibco）。(4)主要試劑：MTT（Sigma）全稱為溴化3（4，5二甲基噻唑基2）2，5二苯基四唑，使用濃度5mg/ml，試驗(yàn)前新鮮配制，過濾去菌；DMSO（Sigma）。1.2  設(shè)備 倒置顯微鏡（Olympus 日本），分光光度儀（Microplate Reader 日本）。1.3  試驗(yàn)方法 (1)材料浸提液制備：將牡蠣殼顆粒在超凈臺(tái)中

4、置于無菌試管內(nèi)，浸液與材料表面積之比為055ml/cm2的比例加入DMEM培養(yǎng)液（含10胎牛血清，1青鏈霉素，10 nmol/L 地塞米松，50 mg/L 維生素C，10 mmol/L B甘油磷酸鈉），置于37環(huán)境下3d，即得材料浸提液。(2)原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：取SD大鼠股骨、脛骨于DMEM培養(yǎng)液中浸泡，低速離心后取上清液。置于DMEM條件培養(yǎng)液（10胎牛血清，1青鏈霉素，10 nmol/L 地塞米松，50 mg/L 維生素C，10 mmol/L B甘油磷酸鈉），于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔35d換液。待骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長致瓶底80面積時(shí)傳代。鈣鈷法染色爬滿原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞的蓋玻片，光鏡觀

5、察絕大多數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)可見均勻分別的棕褐色顆粒，說明堿性磷酸酶染色陽性。(3)細(xì)胞接種培養(yǎng)：取傳3代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，用025胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)使其密度達(dá)到104/ml。取96孔培養(yǎng)板3塊，均設(shè)陰性對(duì)照組和試驗(yàn)組，每孔加入細(xì)胞懸液100l，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。試驗(yàn)組加材料浸提液100l，陰性對(duì)照組加100l DMEM條件培養(yǎng)液，使孔內(nèi)最終濃度為50，每塊板復(fù)合8孔，放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。(4)形態(tài)學(xué)觀察及MTT檢測：培養(yǎng)后2、4、6d各取1塊96孔培養(yǎng)板，倒置顯微鏡觀察活細(xì)胞形態(tài)。加入5mg/ml MTT 20l繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出各孔培養(yǎng)液, 加入二甲基亞砜(DM

6、SO ) 100l /孔,經(jīng)微型混合振蕩器振蕩10min, 用分光光度儀于490 nm 處測定各孔吸光度值(OD ) 。1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件，將同一時(shí)間組間吸光度值作方差分析和均數(shù)間兩兩比較。通過吸光度值繪制細(xì)胞增值曲線，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）。計(jì)算公式：RGR（試驗(yàn)組X / 陰性對(duì)照組X）×100，根據(jù)6級(jí)毒性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)換成毒性級(jí)。2  結(jié)果2.1  細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 2d試驗(yàn)組細(xì)胞基本貼壁生長，折光性良好，可見少量懸浮死細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，也可見少量懸浮死細(xì)胞；4d試驗(yàn)組細(xì)胞貼壁生

7、長良好，形態(tài)呈梭形，數(shù)目增加明顯。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，數(shù)目增加；6d試驗(yàn)組細(xì)胞大量呈梭形生長，排列密集，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，密集排列生長。2.2  MTT法檢測結(jié)果見表1，RGR及毒性級(jí)別見表2，細(xì)胞在材料浸提液中的生長曲線見圖1。表1  試驗(yàn)組和對(duì)照組吸光度值（略）表2  細(xì)胞相對(duì)增殖率（）和毒性級(jí)別（略）     2.3  統(tǒng)計(jì)結(jié)果 陰性對(duì)照組和試驗(yàn)組組間差異無顯著性(0.001)。3  討論    關(guān)于牡蠣作為生物材料的報(bào)道最早是

8、在1965年，研究表明將其植入小鼠體內(nèi)沒有任何不良反應(yīng)。將牡蠣作為原始材料加工成為牡蠣碳酸鈣補(bǔ)鈣劑于1997年經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)，2002年牡蠣鈣獲得國家衛(wèi)生部批號(hào)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)處理過的牡蠣殼具有良好的生物材料活性。牡蠣殼表面的多孔結(jié)構(gòu)形成材料的三維通道，增大了材料與受植區(qū)組織器官的界面，有利于加速界面結(jié)合的反應(yīng)過程，為新骨組織長入材料中提供通道和容納場所，并為攜帶骨誘導(dǎo)物質(zhì)(BMP、骨髓)提供空間。經(jīng)過粉碎等加工處理后，其仍然具有較好的生物活性。Currey  JD等測定牡蠣殼的強(qiáng)度數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中牛的皮質(zhì)骨相似，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于濱珊瑚，說明其具有較好的皮質(zhì)骨替代潛能。  &

9、#160; 骨生物材料應(yīng)用于臨床的最基本條件是對(duì)人體無害，生物相容性好。體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)常被用以考察材料生物相容性的優(yōu)劣，它與體內(nèi)試驗(yàn)相比具有試驗(yàn)周期短、耗費(fèi)少、試驗(yàn)條件因素容易控制、重復(fù)性良好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。不過由于體內(nèi)外細(xì)胞生存的環(huán)境存在一定的差別，因此所得的結(jié)果也可能有差異。盡管如此，它仍不失為一種有效的方法。作者參考呂曉迎的方法制備材料浸提液，采用MTT法評(píng)定牡蠣殼材料的生物相容性。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果、細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析和材料毒性評(píng)級(jí)均表明：牡蠣殼材料具有較好的生物相容性，對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生長無抑制作用。因此牡蠣殼材料有望成為新型骨組織工程多孔支架材料，本試驗(yàn)結(jié)果也為牡蠣殼材料的進(jìn)一步研究奠定

10、了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Velich N, Szabo G. Bone substitution and remodeling of the jaw bones.Fogorv Sz， 2003，96(4):165169. 2 Mount AS, Wheeler AP, Paradkar RP, et al. Hemocyte-mediated shell mineralization in the eastern oyster.Science， 2004，304(5668):297230.3 韓雪，楊曉東. 納米復(fù)合烤瓷材料的生物相容性試驗(yàn). 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2001,30:105107.4 湯蘇陽，艾玉峰，董兆麟，等. 新型生物降解材料聚羥基丁酸的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià). 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000,21:760761.5 Imkiss K. The organic matrix of the oyster shell.Comp Biochem Physiol， 1965，16(4):427435.6 Currey JD, Zioupos P, Davies P, et al. Mechani