1、一一 細胞融合的定義細胞融合的定義 細胞融合是細胞融合是20世紀世紀60年代發(fā)展起來的一項細年代發(fā)展起來的一項細胞工程技術。胞工程技術。細胞融合細胞融合(Cellfusion)又稱體細胞雜又稱體細胞雜交交(Somatic hybridization)，是指將不同來源的原是指將不同來源的原生質(zhì)體生質(zhì)體(除去細胞壁的細胞除去細胞壁的細胞)相融合并使之分化再相融合并使之分化再生、形成新物種或新品種的技術。生、形成新物種或新品種的技術。二二.細胞融合的意義細胞融合的意義1.通過原生質(zhì)體融合進行體細胞雜交已成為細通過原生質(zhì)體融合進行體細胞雜交已成為細胞工程研究的重要內(nèi)容之一?？砂堰@種技術胞工程研究的重要

2、內(nèi)容之一?？砂堰@種技術應用于遺傳性狀改良、克服遠緣雜交中的不應用于遺傳性狀改良、克服遠緣雜交中的不親和障礙、更加廣泛地組合起各種植物的優(yōu)親和障礙、更加廣泛地組合起各種植物的優(yōu)良遺傳性狀，從而培育出理想的新品種。良遺傳性狀，從而培育出理想的新品種。2.進行體細胞融合可以避開生殖細胞的受精過進行體細胞融合可以避開生殖細胞的受精過程，從而在親緣更遠的物種間實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，程，從而在親緣更遠的物種間實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造出自然界中所沒有的新物種。創(chuàng)造出自然界中所沒有的新物種。3.體細胞融合還有一個重要的價值，就是創(chuàng)造體細胞融合還有一個重要的價值，就是創(chuàng)造細胞質(zhì)雜種。在體細胞雜交中雙親的細胞質(zhì)細胞質(zhì)雜種。在體

3、細胞雜交中雙親的細胞質(zhì)都有一定的貢獻。據(jù)試驗，融合后的雜種細都有一定的貢獻。據(jù)試驗，融合后的雜種細胞質(zhì)最終會選擇某一親本的葉綠體，但線粒胞質(zhì)最終會選擇某一親本的葉綠體，但線粒體可以實現(xiàn)雙親重組。因此，有可能通過細體可以實現(xiàn)雙親重組。因此，有可能通過細胞融合獲得細胞核、葉綠體、線粒體基因組胞融合獲得細胞核、葉綠體、線粒體基因組的不同組合，這在育種上無疑有著重大價值。的不同組合，這在育種上無疑有著重大價值。4.體細胞雜交在作物育種和種質(zhì)創(chuàng)新上有其獨體細胞雜交在作物育種和種質(zhì)創(chuàng)新上有其獨到的意義和作用。隨著新的融合技術到的意義和作用。隨著新的融合技術(如電融如電融合技術合技術)進一步完善和發(fā)展，體細

4、胞雜交對作進一步完善和發(fā)展，體細胞雜交對作物改良必將發(fā)揮出更大的作用。物改良必將發(fā)揮出更大的作用。三三 基本原理基本原理 對于植物細胞而言，對于植物細胞而言，1、一般先將兩種不同植物的體細胞、一般先將兩種不同植物的體細胞(來自其葉或來自其葉或根根)經(jīng)過纖維素酶、果膠酶消化，除去其細胞壁，經(jīng)過纖維素酶、果膠酶消化，除去其細胞壁，得到原生質(zhì)體；、得到原生質(zhì)體；、而后通過物理或化學方法誘導其細胞融合形成雜而后通過物理或化學方法誘導其細胞融合形成雜種細胞；、種細胞；、繼而再以適當?shù)募夹g進行雜種細胞的分檢和培養(yǎng)，繼而再以適當?shù)募夹g進行雜種細胞的分檢和培養(yǎng)，促使促使 雜種細胞分裂形成細胞團、愈傷組織、直雜

5、種細胞分裂形成細胞團、愈傷組織、直至形成雜種植株，從而實現(xiàn)基因在遠緣物種間的至形成雜種植株，從而實現(xiàn)基因在遠緣物種間的轉(zhuǎn)移。、由轉(zhuǎn)移。、由于這個新細胞得到了來自兩個細胞的染色體組和于這個新細胞得到了來自兩個細胞的染色體組和細胞質(zhì)，在適宜的條件下來培養(yǎng)，長成的生物個細胞質(zhì)，在適宜的條件下來培養(yǎng)，長成的生物個體就是一個新的物種或品系。體就是一個新的物種或品系。 下圖所示的是兩個不同的原生質(zhì)體或細胞融合成下圖所示的是兩個不同的原生質(zhì)體或細胞融合成一個新的融合細胞的原理示意圖：將不同來源的一個新的融合細胞的原理示意圖：將不同來源的兩個原生質(zhì)體或細胞通過細胞融合，得到含有兩兩個原生質(zhì)體或細胞通過細胞融合

6、，得到含有兩者遺傳信息的新的雜合細胞，然后通過培養(yǎng)基篩者遺傳信息的新的雜合細胞，然后通過培養(yǎng)基篩選出這種雜合細胞，就有可能得到一個新生物。選出這種雜合細胞，就有可能得到一個新生物。顯微鏡下的細胞融合過程見圖顯微鏡下的細胞融合過程見圖5-2 細胞融合主要經(jīng)過了兩原生質(zhì)體或細胞互細胞融合主要經(jīng)過了兩原生質(zhì)體或細胞互相靠近、細胞橋形成、胞質(zhì)滲透、細胞核融相靠近、細胞橋形成、胞質(zhì)滲透、細胞核融合幾個步驟。合幾個步驟。其中細胞橋的形成是細胞融合其中細胞橋的形成是細胞融合最關鍵的一步，融合過程中兩個細胞膜從彼最關鍵的一步，融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的具體變化過程圖此接觸到破裂形成細胞橋

7、的具體變化過程圖解如圖解如圖5-3所示。所示。 細胞融合現(xiàn)象最初是在動物細胞中發(fā)現(xiàn)的。細胞融合現(xiàn)象最初是在動物細胞中發(fā)現(xiàn)的。 后來，細胞融合技術逐步擴展到植物細胞后來，細胞融合技術逐步擴展到植物細胞和微生物細胞。和微生物細胞。四四 融合材料融合材料（一）植物或微生物原生質(zhì)體的制備（一）植物或微生物原生質(zhì)體的制備 植物和許多微生物細胞外有一層堅韌的細胞植物和許多微生物細胞外有一層堅韌的細胞壁，如植物細胞質(zhì)膜外面包裹一層細胞壁，各壁，如植物細胞質(zhì)膜外面包裹一層細胞壁，各細胞壁間有果膠層將細胞聯(lián)結(jié)在一起。為了促細胞壁間有果膠層將細胞聯(lián)結(jié)在一起。為了促使這樣細胞的融合就必須先得到單個細胞，除使這樣細胞

8、的融合就必須先得到單個細胞，除去細胞壁，才能獲得植物原生質(zhì)體或微生物原去細胞壁，才能獲得植物原生質(zhì)體或微生物原生質(zhì)球。因此對于植物和微生物細胞的融合一生質(zhì)球。因此對于植物和微生物細胞的融合一般又可稱為原生質(zhì)體融合。般又可稱為原生質(zhì)體融合。（二）動物單個細胞的獲得（二）動物單個細胞的獲得 動物細胞雖然沒有細胞壁，但細胞間的連接動物細胞雖然沒有細胞壁，但細胞間的連接方式多樣而復雜，在進行有效的細胞融合之前，方式多樣而復雜，在進行有效的細胞融合之前，也必須獲得單個分散的細胞。主要步驟如下：也必須獲得單個分散的細胞。主要步驟如下：1. 組織的獲得組織的獲得 采用各種適宜的方法處死動物，取出組織塊采用各

9、種適宜的方法處死動物，取出組織塊放入小燒杯中，用剪刀將組織塊剪碎成放入小燒杯中，用剪刀將組織塊剪碎成lmm3大大小，用吸管吸取小，用吸管吸取Hanks溶液沖下剪刀上的碎塊，溶液沖下剪刀上的碎塊，補加補加3-5ml的的Hanks溶液，用吸管輕輕吹打，低溶液，用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊。速離心，棄去上清液，留下組織塊。2.組織的消化組織的消化 通過生物化學的方法將剪碎的組織塊分散成通過生物化學的方法將剪碎的組織塊分散成細胞團或單細胞。可根據(jù)不同的組織對象采用不細胞團或單細胞?？筛鶕?jù)不同的組織對象采用不同的酶消化液，如最常用的有胰蛋白酶和膠原酶同的酶消化液，如最常用的有胰蛋白酶

10、和膠原酶等。其他的酶如鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等。其他的酶如鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動物組織的消化。等也可用于動物組織的消化。EDTA最適合消化最適合消化傳代細胞，常與胰蛋白酶使用。傳代細胞，常與胰蛋白酶使用。 下面分別以胰蛋白酶和膠原酶為例介紹一下下面分別以胰蛋白酶和膠原酶為例介紹一下動物組織的消化方法：動物組織的消化方法： 胰蛋白酶：尤其適合于細胞間質(zhì)較少的軟組織，胰蛋白酶：尤其適合于細胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎以及傳代細胞等。如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎以及傳代細胞等。用胰蛋白酶消化動物細胞的基本步驟如下：用胰蛋白酶消化動物細胞的基本步驟如下： (1)

11、向剪碎的組織塊中加入向剪碎的組織塊中加入30-50倍體積的倍體積的0.25濃度的胰蛋白酶。濃度的胰蛋白酶。 (2)在在37水浴內(nèi)消化水浴內(nèi)消化3060min，每每5-l0min搖動搖動一次，根據(jù)具體情況可以中間更換消化液。一次，根據(jù)具體情況可以中間更換消化液。 (3)Hanks液漂洗兩次，每次液漂洗兩次，每次23min 。 (4)800rmin離心離心5min，棄上清液，加入營養(yǎng)液。棄上清液，加入營養(yǎng)液。如果有大塊，可用紗網(wǎng)過濾。如果有大塊，可用紗網(wǎng)過濾。 膠原酶：是一種由細菌中提取的酶，對膠原和細胞間質(zhì)膠原酶：是一種由細菌中提取的酶，對膠原和細胞間質(zhì)有較強的消化作用，適用于消化纖維組織、上皮

12、組織、有較強的消化作用，適用于消化纖維組織、上皮組織、癌組織等。膠原酶不受癌組織等。膠原酶不受Ca 2+、Mg2+的螯合影響，可的螯合影響，可 用用BSS和含血清培養(yǎng)基配制成和含血清培養(yǎng)基配制成200Uml或或0.10.3mgml濃度，作用溫和，無需機械振蕩。具體消化方法如下：濃度，作用溫和，無需機械振蕩。具體消化方法如下： (1)向培養(yǎng)瓶中放入向培養(yǎng)瓶中放入15mm3大小的組織塊，加大小的組織塊，加5m12000Uml的膠原酶母液，最終濃度為的膠原酶母液，最終濃度為200Uml，pH=6.5 。 (2)36.5 水浴水浴448h，無需搖動，中間可更換酶液一次。無需搖動，中間可更換酶液一次。

13、(3)當組織變軟，分散于瓶底時，輕輕振蕩即散成細胞當組織變軟，分散于瓶底時，輕輕振蕩即散成細胞團或單個細胞，小心倒出培養(yǎng)液。團或單個細胞，小心倒出培養(yǎng)液。 (4)800rmin離心離心5min，棄上清液，重新懸浮棄上清液，重新懸浮BSS溶液溶液 中，再離心一次。中，再離心一次。 (5)加入培養(yǎng)液制成細胞懸浮液。加入培養(yǎng)液制成細胞懸浮液。 五五 細胞融合技術細胞融合技術 為了使制備好的原生質(zhì)體或細胞能融合在一為了使制備好的原生質(zhì)體或細胞能融合在一起，選擇適宜有效的誘導融合方法很重要。誘導起，選擇適宜有效的誘導融合方法很重要。誘導融合的方法可分為物理法、化學法及生物法。物融合的方法可分為物理法、化

14、學法及生物法。物理法主要包括顯微操作、電場刺激等；化學法主理法主要包括顯微操作、電場刺激等；化學法主要是用聚乙二醇要是用聚乙二醇PEG結(jié)合高結(jié)合高pH、高鈣離子法；高鈣離子法；生物法有仙臺病毒法等。具體應用時要根據(jù)不同生物法有仙臺病毒法等。具體應用時要根據(jù)不同對象選擇不同的細胞融合方法和條件。對象選擇不同的細胞融合方法和條件。誘導動物誘導動物細胞融合，仙臺病毒細胞融合，仙臺病毒HVJ誘導、誘導、PEG法、電融合法、電融合法都適用；植物細胞融合常用法都適用；植物細胞融合常用PEG法和電融合法；法和電融合法；微生物細胞融合只適用微生物細胞融合只適用PEG法。表法。表5-1顯示不同顯示不同細胞融合的

15、條件及其主要應用。細胞融合的條件及其主要應用。（一）生物法（一）生物法仙臺病毒法仙臺病毒法 我們知道很多病毒都具有凝集細胞的能力，它一邊黏我們知道很多病毒都具有凝集細胞的能力，它一邊黏接在一個細胞表面，另外一邊黏接在另一個細胞表面，接在一個細胞表面，另外一邊黏接在另一個細胞表面，從而使兩個細胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。從而使兩個細胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。 在動物細胞融合中，仙臺病毒在動物細胞融合中，仙臺病毒(HVJ)已成為產(chǎn)生細胞已成為產(chǎn)生細胞雜種的標準融合劑。雜種的標準融合劑。 病毒促使細胞融合的主要步驟如下：病毒促使細胞融合的主要步驟如下： (1)兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結(jié)作用下

16、彼此靠近。兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近。 (2)通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透。間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透。 (3)兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合，融為一體。兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合，融為一體。 (4)進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種子細胞。的雜種子細胞。 過程圖解如下圖所示。過程圖解如下圖所示。 （二）化學法（二）化學法PEG結(jié)合高結(jié)合高Ca2+、pH誘導法誘導法 細胞融合中的化學法誘導主要包括：細胞融合中的化學法誘導主要包括：NaNO

17、3誘導誘導(NaNO3可中和原生質(zhì)體表面負電荷，促進可中和原生質(zhì)體表面負電荷，促進原生質(zhì)體聚集，對原生質(zhì)體無損害，但融合效率原生質(zhì)體聚集，對原生質(zhì)體無損害，但融合效率低低)、高、高Ca2+和和pH誘導法、誘導法、PEG誘導、高誘導、高Ca2+和和pH誘導誘導PEG結(jié)合誘導等。上面幾種方法中以后結(jié)合誘導等。上面幾種方法中以后者最為常用，下面做一重點介紹：者最為常用，下面做一重點介紹：1 .基本原理基本原理 聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一是一種多聚化合物，分子式為種多聚化合物，分子式為H(OHCH2CH2)nOH，商品名卡波蠟商品名卡波蠟(Carbowax)

18、。實驗實驗室用的室用的PEG平均相對分子質(zhì)量在平均相對分子質(zhì)量在200- 20000之之間，一般間，一般1000以下者為液體，以下者為液體，1 000以上者為以上者為固體。固體。1974年人們用它誘導大麥、大豆等植年人們用它誘導大麥、大豆等植物原生質(zhì)體融合，以后又用物原生質(zhì)體融合，以后又用PEG誘導與用高誘導與用高Ca2+和和pH誘導相結(jié)合，極大地提高了融合效誘導相結(jié)合，極大地提高了融合效率。率。2. 基本過程基本過程 以植物原生質(zhì)體為例，以植物原生質(zhì)體為例，PEG法誘導原生質(zhì)法誘導原生質(zhì)體融合的過程見圖體融合的過程見圖5-4所示。所示。 融合中應注意：融合中應注意： (1)事先要做好兩種原生

19、質(zhì)體的識別標記，如事先要做好兩種原生質(zhì)體的識別標記，如色素、缺陷型、抗性標記等。色素、缺陷型、抗性標記等。 (2)原生質(zhì)體的密度應在原生質(zhì)體的密度應在105個個ml左右，兩種左右，兩種原生質(zhì)體按原生質(zhì)體按1:1等量混合。等量混合。 (3)常用常用PEG的分子量通常為的分子量通常為40006000，加熱熔，加熱熔化與化與Eagle溶液配成溶液配成50(WV)濃度濃度(小分子質(zhì)小分子質(zhì)量的量的PEG配成配成55濃度濃度)。加入。加入PEG后，后，24 培育培育10-20min(注意時間宜短不宜長，過長，使注意時間宜短不宜長，過長，使原生質(zhì)體周圍包裹一層膜形成凝集體，會降低原生質(zhì)體周圍包裹一層膜形成

20、凝集體，會降低融合率融合率)，緩緩加入高，緩緩加入高pH、高鈣離子溶液，高鈣離子溶液，15min后用沖洗液清洗，離心收集原生質(zhì)體。后用沖洗液清洗，離心收集原生質(zhì)體。(4)計算：融合率計算：融合率=(融合細胞的細胞核總數(shù)視野融合細胞的細胞核總數(shù)視野內(nèi)全部細胞的細胞核總數(shù)內(nèi)全部細胞的細胞核總數(shù))100(三三)物理法物理法電融合誘導法電融合誘導法1 基本原理基本原理 電融合法是電融合法是20世紀世紀80年代出現(xiàn)的細胞融合技年代出現(xiàn)的細胞融合技術。在直流電脈沖的誘導下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面術。在直流電脈沖的誘導下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異

21、種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。與直到閉和成完整的膜形成融合體。與PEG法比較，法比較，電融合法優(yōu)點較多，如融合率高、重復性強、對電融合法優(yōu)點較多，如融合率高、重復性強、對原生質(zhì)體傷害??；裝置精巧、方便簡單、可在顯原生質(zhì)體傷害??；裝置精巧、方便簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程；免去微鏡下觀察或錄像融合過程；免去PEG誘導后的誘導后的洗滌過程、誘導過程可控制性強等等。電融合設洗滌過程、誘導過程可控制性強等等。電融合設備及原理如圖備及原理如圖5-5：2 基本過程基本過程 電融合裝置的電極有兩種：微電極

22、型電融合裝置的電極有兩種：微電極型(圖圖55中中B)和平行多電極型和平行多電極型(圖圖5-5中中A)，它們的特點與它們的特點與操作如下：操作如下： (1)將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室中，微電極型只有一個小室小室中，微電極型只有一個小室(圖圖5-5中中B)，平平行電極型有行電極型有4個小室個小室(圖圖5-5中中A)，兩電極間隔兩電極間隔3mm，整個裝置放在一個培養(yǎng)皿中。整個裝置放在一個培養(yǎng)皿中。 (2)微電極型的兩個電極的端部同時與兩個靠近微電極型的兩個電極的端部同時與兩個靠近的原生質(zhì)體膜表面接觸，微電極所產(chǎn)生的的原生質(zhì)體膜表面接觸，微電極所產(chǎn)

23、生的512mA的脈沖電流間斷刺激的脈沖電流間斷刺激15ms，原生質(zhì)體原生質(zhì)體在累計幾秒到幾十秒鐘的時間內(nèi)會發(fā)生暫時性的在累計幾秒到幾十秒鐘的時間內(nèi)會發(fā)生暫時性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個個泡囊，經(jīng)點連接到面連接，最后形成融合體，個個泡囊，經(jīng)點連接到面連接，最后形成融合體，整個過程大約整個過程大約1030min。 (3)平行多電極通過平行多電極通過1兆赫兆赫(MHz)交流電場發(fā)生雙交流電場發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場力的作用下，極化產(chǎn)向電脈沖，原生質(zhì)體在電場力的作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開

24、成串珠狀(圖圖5-5中中C)。在適當時間和強度在適當時間和強度(如如50mA l.22kVcm)的的直流電脈沖作用下，質(zhì)膜被擊穿，進一步形成融直流電脈沖作用下，質(zhì)膜被擊穿，進一步形成融合體。應用如下圖所示。合體。應用如下圖所示。 (四四) 細胞融合的影響因素細胞融合的影響因素1. 植物細胞融合植物細胞融合 植物原生質(zhì)體融合無種屬特異性，故其融合效率僅植物原生質(zhì)體融合無種屬特異性，故其融合效率僅與外界條件有關，而與其自身種屬無關。如何確定不同與外界條件有關，而與其自身種屬無關。如何確定不同材料的融合條件，需經(jīng)過具體實驗制定出最佳融合方案。材料的融合條件，需經(jīng)過具體實驗制定出最佳融合方案。 植物細

25、胞融合的影響因素如下：植物細胞融合的影響因素如下： (1)PEG誘導融合的關鍵是作用時間，尤其是高誘導融合的關鍵是作用時間，尤其是高Ca 2+和和pH溶液處理時間長短非常重要。時間過長原生質(zhì)體損溶液處理時間長短非常重要。時間過長原生質(zhì)體損傷嚴重，融合效率降低；過短則不融合。傷嚴重，融合效率降低；過短則不融合。 (2)PEG規(guī)格和純度與融合效率亦有關系。以往認為規(guī)格和純度與融合效率亦有關系。以往認為PEG 分子質(zhì)量越大，對細胞毒性越大，因此選用分子質(zhì)量小分子質(zhì)量越大，對細胞毒性越大，因此選用分子質(zhì)量小的的PEG。但是目前發(fā)現(xiàn)但是目前發(fā)現(xiàn)PEG毒性是其中雜質(zhì)所致，經(jīng)純毒性是其中雜質(zhì)所致，經(jīng)純化后即

26、無毒性。故目前應用分子質(zhì)量較大者化后即無毒性。故目前應用分子質(zhì)量較大者(40006000)居多。因此操作時應注意居多。因此操作時應注意PEG純度。純度。 (3)在電場誘導融合時，融合率與原生質(zhì)體密度在電場誘導融合時，融合率與原生質(zhì)體密度有關；密度小于有關；密度小于104個個ml融合效率低；大于融合效率低；大于105個個 ml會融合成團，難以達到預期效果。最適會融合成團，難以達到預期效果。最適宜的密度一般為宜的密度一般為21048 104個個 ml 。 (4)在融合液中加入少量在融合液中加入少量CaCl2，既可維持一定電既可維持一定電導率，對細胞也有保護作用；其次交變電流強弱、導率，對細胞也有保

27、護作用；其次交變電流強弱、處理時間長短及電脈沖大小均會影響融合率。處理時間長短及電脈沖大小均會影響融合率。 (5)此外，用混合鹽溶液對原生質(zhì)體進行融合前此外，用混合鹽溶液對原生質(zhì)體進行融合前預處理，以及在促融劑中添加伴刀豆球蛋白、二預處理，以及在促融劑中添加伴刀豆球蛋白、二甲基亞砜、胰蛋白酶、精胺或亞精胺等亦可提高甲基亞砜、胰蛋白酶、精胺或亞精胺等亦可提高融合效率。融合效率。 2.動物細胞融合動物細胞融合 在動物細胞融合過程中，除促融劑外，其他如細胞在動物細胞融合過程中，除促融劑外，其他如細胞性質(zhì)、溫度、性質(zhì)、溫度、pH、離子強度及離子種類等均會影響細離子強度及離子種類等均會影響細胞融合效率。

28、胞融合效率。 (1)首先，親本細胞表面性質(zhì)影響較大，表面覆蓋絨毛首先，親本細胞表面性質(zhì)影響較大，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則者較易融合，而表面光滑者較難融合。而不規(guī)則者較易融合，而表面光滑者較難融合。 (2)細胞種類不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化細胞種類不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化細胞較易融合，而淋巴細胞或血球細胞幾乎不融合。細胞較易融合，而淋巴細胞或血球細胞幾乎不融合。 (3)細胞融合時需要適宜溫度和運動狀態(tài)。如仙臺病毒細胞融合時需要適宜溫度和運動狀態(tài)。如仙臺病毒誘導歐利希氏腹水癌細胞融合時，于誘導歐利希氏腹水癌細胞融合時，于37 振搖時易于振搖時易于融合，且融合效率與病毒量呈正比。但

29、在融合，且融合效率與病毒量呈正比。但在34 振搖則振搖則融合率下降。在融合率下降。在37時不振搖則幾乎不融合。時不振搖則幾乎不融合。 (4)細胞融合過程中，通常耗氧量較大，缺氧時經(jīng)細胞融合過程中，通常耗氧量較大，缺氧時經(jīng)常不融合。空氣中含氧量大于常不融合?？諝庵泻趿看笥?0時有一定融合時有一定融合率，但有些細胞在無氧條件下也可融合。率，但有些細胞在無氧條件下也可融合。 (5)有些細胞融合時需要有些細胞融合時需要Ca2+ ，否則不融合，細否則不融合，細胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生變化。實驗表明胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生變化。實驗表明Sr2+、Ba2+ 、Mg2+ 、Mn2+ 等離子可代替等離子可代替Ca2+，但有效濃度

30、較但有效濃度較Ca2+大的多。融合時最適合的離子強度一般為大的多。融合時最適合的離子強度一般為0.1molL。 (6)最適合的最適合的pH為為7.47.8之間，在此范圍之外，之間，在此范圍之外，融合率均較低。融合率均較低。六六. 融合細胞的選擇融合細胞的選擇 通過各種技術手段可以獲得各種類型的融通過各種技術手段可以獲得各種類型的融合體。細胞發(fā)生融合后，根據(jù)融合細胞中所含合體。細胞發(fā)生融合后，根據(jù)融合細胞中所含的類型，可將其分為以下幾種類型：的類型，可將其分為以下幾種類型： (1)同核體同核體同源原生質(zhì)體的融合體。由于是同源原生質(zhì)體的融合體。由于是同源細胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。同源細胞

31、，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。 (2)異核體異核體非同源原生質(zhì)體的融合體。一非同源原生質(zhì)體的融合體。一般是親源關系較近的細胞，這種親核雜種細般是親源關系較近的細胞，這種親核雜種細胞含有雙親全部細胞核和細胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)胞含有雙親全部細胞核和細胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)育的個體也有可育的，如煙草種間的細胞雜育的個體也有可育的，如煙草種間的細胞雜種。種。 (3)多核體多核體含有雙親不同比例核物質(zhì)的融含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親源關系較遠的細胞間融合，融合體合體。親源關系較遠的細胞間融合，融合體以一個細胞的核物質(zhì)為主，只加入另外一個以一個細胞的核物質(zhì)為主，只加入另外一個細胞少量的遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹

32、形細胞少量的遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹形成部分親核的雜種細胞。成部分親核的雜種細胞。 植物原生質(zhì)體融合后，融合物在培養(yǎng)基中再生植物原生質(zhì)體融合后，融合物在培養(yǎng)基中再生細胞壁，通過有絲分裂，產(chǎn)生由親本細胞、同源細胞壁，通過有絲分裂，產(chǎn)生由親本細胞、同源細胞及雜種細胞組成的混合群體。細胞及雜種細胞組成的混合群體。 不同的融合產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下有著不同的命運。不同的融合產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下有著不同的命運。未融合的原生質(zhì)體和同源融合的原生質(zhì)體能較快未融合的原生質(zhì)體和同源融合的原生質(zhì)體能較快地適應培養(yǎng)條件而生長發(fā)育。而異源融合體往往地適應培養(yǎng)條件而生長發(fā)育。而異源融合體往往因它們發(fā)育緩慢而受到優(yōu)勢生長的親本原

33、生質(zhì)體因它們發(fā)育緩慢而受到優(yōu)勢生長的親本原生質(zhì)體融合細胞的抑制，不易發(fā)育成雜種。因此需要通融合細胞的抑制，不易發(fā)育成雜種。因此需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細胞，分離出需要過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細胞，分離出需要的雜種細胞，從而解決融合細胞的選擇問題。的雜種細胞，從而解決融合細胞的選擇問題。 最簡單的選擇方法是利用雙親細胞形態(tài)和色澤上的差最簡單的選擇方法是利用雙親細胞形態(tài)和色澤上的差異識別雜種細胞，但多數(shù)是根據(jù)細胞生理遺傳上的特性異識別雜種細胞，但多數(shù)是根據(jù)細胞生理遺傳上的特性來選擇。比較常用的雜種細胞篩選方法包括：來選擇。比較常用的雜種細胞篩選方法包括： (1)遺傳互補篩選法：利用每一親

34、本貢獻一個功能正常等遺傳互補篩選法：利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因，糾正另外一親本的缺陷，從而令雜種細胞表現(xiàn)位基因，糾正另外一親本的缺陷，從而令雜種細胞表現(xiàn)正常功能的原理選擇雜種細胞。正常功能的原理選擇雜種細胞。 (2)抗性互補篩選法：利用親本原生質(zhì)體對抗生素、除草抗性互補篩選法：利用親本原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其他毒性物質(zhì)抗性差異來選擇雜種細胞。對抗性突劑及其他毒性物質(zhì)抗性差異來選擇雜種細胞。對抗性突變體或抗藥性有差異的可采用這種方法。變體或抗藥性有差異的可采用這種方法。 (3)生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應的差異選擇

35、雜種細胞。例如：親本原生質(zhì)體生長要反應的差異選擇雜種細胞。例如：親本原生質(zhì)體生長要求外源激素，而有的雜種細胞由于雙親互補作用會產(chǎn)生求外源激素，而有的雜種細胞由于雙親互補作用會產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。內(nèi)激素，從而使雜種細胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。 (4)物理特性篩選法：利用親本原生質(zhì)體大小、物理特性篩選法：利用親本原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度等差異選擇雜種細胞。如用離心顏色、漂浮密度等差異選擇雜種細胞。如用離心方法可以把異核體與親本原生質(zhì)體分開，從而獲方法可以把異核體與親本原生質(zhì)體分開，從而獲得融合體。得融合體。 (5)其他方法：采用顯微操作技術也能把單個異其他方法

36、：采用顯微操作技術也能把單個異核體分離出來進行培養(yǎng)。因為如果是融合細胞，核體分離出來進行培養(yǎng)。因為如果是融合細胞，就必定具有與雙親本不同的熒光標記，所以科學就必定具有與雙親本不同的熒光標記，所以科學家發(fā)明了一種普遍適用的方法，即采用無毒的熒家發(fā)明了一種普遍適用的方法，即采用無毒的熒光素標記雙親原生質(zhì)體。融合后利用一種電子光素標記雙親原生質(zhì)體。融合后利用一種電子 熒光激活選擇器自動分類和選擇融合細胞。熒光激活選擇器自動分類和選擇融合細胞。 以上方法中利用選擇性培養(yǎng)基是一個很常用以上方法中利用選擇性培養(yǎng)基是一個很常用的雜種細胞選擇方法。的雜種細胞選擇方法。 七七. 細胞融合技術的應用舉例細胞融合技

37、術的應用舉例 1970年以來，通過原生質(zhì)體融合已獲得了年以來，通過原生質(zhì)體融合已獲得了很多體細胞雜種，表很多體細胞雜種，表5-2是其中的一些實例。是其中的一些實例。下面重點對一些已獲成功的應用如單克隆抗下面重點對一些已獲成功的應用如單克隆抗體大量生產(chǎn)、微生物新菌株的構建、以及通體大量生產(chǎn)、微生物新菌株的構建、以及通過原生質(zhì)體融合再生植株作一介紹。應用如過原生質(zhì)體融合再生植株作一介紹。應用如下圖所示。下圖所示。 (一一)動物細胞融合動物細胞融合單克隆抗體生產(chǎn)單克隆抗體生產(chǎn) 高等動物的免疫主要是機體能識別外源異物高等動物的免疫主要是機體能識別外源異物與自身的物質(zhì)。例如種牛痘預防天花及接種麻疹疫與自

38、身的物質(zhì)。例如種牛痘預防天花及接種麻疹疫苗預防麻疹已得到廣泛應用。高等動物與外界相通苗預防麻疹已得到廣泛應用。高等動物與外界相通的呼吸道及生殖泌尿系統(tǒng)等被稱為外分泌的淋巴系的呼吸道及生殖泌尿系統(tǒng)等被稱為外分泌的淋巴系統(tǒng)；不與外界接觸的胸腺、骨髓、脾臟、扁桃腺及統(tǒng)；不與外界接觸的胸腺、骨髓、脾臟、扁桃腺及淋巴結(jié)等稱免疫內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)。胸腺位于胸骨后，淋巴結(jié)等稱免疫內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)。胸腺位于胸骨后，由兩葉構成，能生產(chǎn)淋巴細胞，這類依賴胸腺的淋由兩葉構成，能生產(chǎn)淋巴細胞，這類依賴胸腺的淋巴細胞叫巴細胞叫T細胞。它們能誘導細胞免疫，調(diào)動吞噬細胞。它們能誘導細胞免疫，調(diào)動吞噬細胞等包圍及吞噬并將病原菌消滅

39、；脾臟在人體左細胞等包圍及吞噬并將病原菌消滅；脾臟在人體左腹，是最大的淋巴器官，能產(chǎn)生多種淋巴細胞。其腹，是最大的淋巴器官，能產(chǎn)生多種淋巴細胞。其中中B淋巴細胞是能形成抗體的細胞；骨髓是產(chǎn)生干淋巴細胞是能形成抗體的細胞；骨髓是產(chǎn)生干細胞的器官，因此骨髓是免疫功能的發(fā)源地。細胞的器官，因此骨髓是免疫功能的發(fā)源地。 用常規(guī)免疫方法制備的免疫血清抗體只能是數(shù)目眾多用常規(guī)免疫方法制備的免疫血清抗體只能是數(shù)目眾多的單克隆抗體的混合物，一般稱其為多克隆抗體的單克隆抗體的混合物，一般稱其為多克隆抗體(PcAb)。這種多克隆抗體存在特異性差、效價低、數(shù)量有限、動這種多克隆抗體存在特異性差、效價低、數(shù)量有限、動

40、物間個體差異大，難以重復制備等固有缺陷。物間個體差異大，難以重復制備等固有缺陷。 1975年，英國劍橋大學分子生物學研究室的科萊爾年，英國劍橋大學分子生物學研究室的科萊爾(Kohler)和米爾斯坦和米爾斯坦(Milstein)合作將已適應于體外培合作將已適應于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞與綿羊紅細胞免疫小鼠脾細胞養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞與綿羊紅細胞免疫小鼠脾細胞(B淋淋巴細胞巴細胞)進行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細胞具有雙進行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征：即像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)時能夠親細胞的特征：即像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)時能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體，通過克

41、無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體，通過克隆化可使雜交細胞成為單純的細胞系，由此單克隆系就隆化可使雜交細胞成為單純的細胞系，由此單克隆系就可以獲得結(jié)構與各種特性完全相同的高純度抗體，即單可以獲得結(jié)構與各種特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體克隆抗體(McAb)。上述方法創(chuàng)立了一項具有劃時代意。上述方法創(chuàng)立了一項具有劃時代意義的新技術義的新技術利用細胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體。利用細胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體。 制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量

42、生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟一系列實驗步驟(見圖見圖5-6)。單克隆抗體的制備大。單克隆抗體的制備大致是按以下步驟進行：首先取得抗原致是按以下步驟進行：首先取得抗原(包括細菌、包括細菌、病毒或某種純的蛋白病毒或某種純的蛋白)注射到小鼠體內(nèi)，大約注注射到小鼠體內(nèi)，大約注射射4次，使小鼠免疫并產(chǎn)生相應的抗體。取小鼠次，使小鼠免疫并產(chǎn)生相應的抗體。取小鼠的血清與抗原作用，確認產(chǎn)生抗原的血清與抗原作用，確認產(chǎn)生抗原抗體凝集反抗體凝集反應。取出免疫鼠的脾臟制成脾細胞懸浮液，與鼠應。取出免疫鼠的脾臟制成脾細胞懸浮液，與鼠骨髓瘤細胞混合，加入聚乙二醇骨髓瘤細胞

43、混合，加入聚乙二醇(PEC 4000)形成形成融合細胞，又叫雜交瘤。它具有分泌抗體又能迅融合細胞，又叫雜交瘤。它具有分泌抗體又能迅速生長的特性，叫單克隆抗體雜交株。利用單克速生長的特性，叫單克隆抗體雜交株。利用單克隆抗體的診斷方法很多，如酶聯(lián)吸附法隆抗體的診斷方法很多，如酶聯(lián)吸附法(ELISA)、熒光抗體法、膠體金銀染色法等已在臨床診斷上熒光抗體法、膠體金銀染色法等已在臨床診斷上應用。應用。單克隆抗體的大量制備過程如下：單克隆抗體的大量制備過程如下：1. 細胞融合前準備細胞融合前準備(1)動物免疫與免疫脾細胞懸液的制備動物免疫與免疫脾細胞懸液的制備 一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫一般要經(jīng)過初次

44、免疫、第二次免疫(向動物腹腔內(nèi)向動物腹腔內(nèi)注射抗體注射抗體)、加強免疫、加強免疫(向動物靜脈內(nèi)注射抗體向動物靜脈內(nèi)注射抗體)三個過程。三個過程。如果需要免疫脾細胞，一般取最后一次加強免疫如果需要免疫脾細胞，一般取最后一次加強免疫3天以天以后的脾臟，制備成細胞懸液。后的脾臟，制備成細胞懸液。(2)骨髓瘤細胞的獲得與培養(yǎng)骨髓瘤細胞的獲得與培養(yǎng) 骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可利用一般的動物細胞培養(yǎng)液。骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可利用一般的動物細胞培養(yǎng)液。小牛血清的濃度一般在小牛血清的濃度一般在1020，細胞的最大密度不，細胞的最大密度不得超得超106個個ml，一般擴大培養(yǎng)以一般擴大培養(yǎng)以1:10稀釋傳代，每稀釋傳代，每3

45、5天傳代一次。細胞的倍增時間為天傳代一次。細胞的倍增時間為1620h。 一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞。保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期和良好的形態(tài)，活胞。保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期和良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于細胞計數(shù)高于95也是決定細胞融合的關鍵。也是決定細胞融合的關鍵。2 細胞融合與雜交瘤選擇細胞融合與雜交瘤選擇(1)細胞融合流程細胞融合流程 取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞，離心，棄上清，用取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌用不完全培

46、養(yǎng)液洗滌2次。同時制備免疫脾細胞次。同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。次。 將骨髓瘤細胞與脾細胞按將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:10或或1:5的比例混合的比例混合在一起，在在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。 30s內(nèi)加入預熱的一定濃度、一定分子量的內(nèi)加入預熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預熱的不邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預熱的不完全培養(yǎng)液，終止完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。作用。 離心，棄上清，用離心，棄上清，用2

47、0小牛血清等輕輕混懸。小牛血清等輕輕混懸。將融合后細胞懸液加入將融合后細胞懸液加入96孔板，孔板，100l孔孔，37、5CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 (2)HAT選擇雜交瘤選擇雜交瘤 一般在融合一般在融合24h后，加后，加HAT選擇培養(yǎng)液。維持選擇培養(yǎng)液。維持培養(yǎng)兩周后，改用培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。改用一般培養(yǎng)液。3 抗體的檢測與雜交瘤選擇抗體的檢測與雜交瘤選擇 篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗細胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。檢測抗體

48、的方法應根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的體。檢測抗體的方法應根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法。一般以快速、類型不同，選擇不同的篩選方法。一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。簡便、特異、敏感的方法為原則。4 單克隆抗體的大量生產(chǎn)單克隆抗體的大量生產(chǎn) 目前，大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：目前，大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種： (1)體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清液中獲取單克隆抗體。從上清液中獲取單克隆抗體。 (2)體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清：體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清： 實體瘤法實體瘤法 腹水的制備腹水的制

49、備 如下圖所示。如下圖所示。 5 單克隆抗體的鑒定單克隆抗體的鑒定 對制備的對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應對其做如下方面的鑒定：的。應對其做如下方面的鑒定： (1)特異性的鑒定特異性的鑒定 (2)McAb的的Ig(免疫球蛋白免疫球蛋白)類與亞類的鑒定類與亞類的鑒定 (3)McAb中和活性的鑒定中和活性的鑒定 (4)McAb識別抗原表位的鑒定識別抗原表位的鑒定 (5)McAb親和力的鑒定親和力的鑒定6 影響因素分析影響因素分析 由于制備由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。其主要失敗

50、原因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。其主要失敗原因和影響因素可能有：因和影響因素可能有： (1)污染污染 包括細菌、霉菌和支原體的污染。包括細菌、霉菌和支原體的污染。 (2)融合后雜交瘤不生長融合后雜交瘤不生長 在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素：在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素： PEG有毒性或作用時間過長。有毒性或作用時間過長。 小牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。小牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。 骨髓瘤細胞污染了支原體。骨髓瘤細胞污染了支原體。 HAT有問題。有問題。(3)雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

51、 雖有雜交瘤細胞生長，但無抗體產(chǎn)生，這可能雖有雜交瘤細胞生長，但無抗體產(chǎn)生，這可能是是HAT中中A失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成A抵抗細胞所致。抵抗細胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮?，可能對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮裕赡苁羌毎гw污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。能發(fā)生染色體丟失。7. 生物反應器培養(yǎng)雜交瘤細胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗生物

52、反應器培養(yǎng)雜交瘤細胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗 由于臨床上對治療用單抗的質(zhì)量要求高、需由于臨床上對治療用單抗的質(zhì)量要求高、需求量大，因此有必要建立采用生物反應器大規(guī)模求量大，因此有必要建立采用生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單抗的設備和工藝技術。下培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單抗的設備和工藝技術。下面以我國八五科技攻關項目面以我國八五科技攻關項目WuT3單克隆抗單克隆抗體的生物反應器生產(chǎn)為例，介紹一下相關技術：體的生物反應器生產(chǎn)為例，介紹一下相關技術：(1)雜交瘤細胞雜交瘤細胞 為抗為抗CD3的的WuT3雜交瘤細胞，由我國衛(wèi)生部雜交瘤細胞，由我國衛(wèi)生部武漢生物制品研究所建株。武漢生物制品研究所建株。(2)生物反應

53、器生物反應器 采用采用3.5L、14L、75L攪拌式生物反應器，有攪拌式生物反應器，有自動消毒、控制溫度、轉(zhuǎn)速、自動消毒、控制溫度、轉(zhuǎn)速、DO和和pH等功能。等功能。 (3)培養(yǎng)液培養(yǎng)液 RPMll640中添加慶大霉素至中添加慶大霉素至100Uml、胎牛胎牛血清血清(NcS)或健康人血清或健康人血清(HuS)、添加劑添加劑HEN(蛋蛋白胨和糖類白胨和糖類)。(4)培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式 控制溫度在控制溫度在37 、pH7.1、轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速4060rmin、DO在在3050，分批和半連續(xù)培養(yǎng)。產(chǎn)物用管，分批和半連續(xù)培養(yǎng)。產(chǎn)物用管式連續(xù)流離心機除去細胞，收集上清液用于單抗式連續(xù)流離心機除去細胞，收集上清液用

54、于單抗?jié)舛?、免疫活性、熱原等分析測定。濃度、免疫活性、熱原等分析測定。(5)結(jié)果與分析結(jié)果與分析 利用生物反應器分批培養(yǎng)雜交瘤細胞，在收獲利用生物反應器分批培養(yǎng)雜交瘤細胞，在收獲時細胞的凋亡比例很高時細胞的凋亡比例很高(約占細胞總量的約占細胞總量的90)，這主要是由于反應器內(nèi)葡萄糖、谷氨酰胺等營養(yǎng)這主要是由于反應器內(nèi)葡萄糖、谷氨酰胺等營養(yǎng)缺乏、有毒代謝產(chǎn)物積累所致。如果采用半連續(xù)缺乏、有毒代謝產(chǎn)物積累所致。如果采用半連續(xù)培養(yǎng)方式，及時補充葡萄糖、谷氨酰胺等營養(yǎng)，培養(yǎng)方式，及時補充葡萄糖、谷氨酰胺等營養(yǎng)，同時及時排出代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)同時及時排出代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)(尤其是氨尤其是氨)，能有效地抑

55、制細胞凋亡，最終促進了細胞生長、能有效地抑制細胞凋亡，最終促進了細胞生長、有效維持了抗體的合成與分泌，并且可以連續(xù)收有效維持了抗體的合成與分泌，并且可以連續(xù)收獲單抗產(chǎn)品。獲單抗產(chǎn)品。(二二) 利用原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)技術培育新植物利用原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)技術培育新植物 組織和細胞培養(yǎng)技術的成熟為植物遺傳育種組織和細胞培養(yǎng)技術的成熟為植物遺傳育種提供了條件。許多遺傳育種技術提供了條件。許多遺傳育種技術(如細胞融合、如細胞融合、染色體工程等染色體工程等)與組織、細胞培養(yǎng)技術結(jié)合在一與組織、細胞培養(yǎng)技術結(jié)合在一起，就能快速培養(yǎng)出具有優(yōu)良遺傳性狀的新型物起，就能快速培養(yǎng)出具有優(yōu)良遺傳性狀的新型物種。種。1

56、 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 從用處上從用處上(實踐和理論上實踐和理論上)講，講，原生質(zhì)體分離與培原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)有以下意義：養(yǎng)有以下意義： 融合產(chǎn)生體細胞雜種。融合產(chǎn)生體細胞雜種。 分離或引入各種細胞器。分離或引入各種細胞器。 導入外源基因。導入外源基因。 誘發(fā)突變體。誘發(fā)突變體。 研究細胞信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運輸?shù)?。研究細胞信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運輸?shù)取?研究細胞壁合成機制。研究細胞壁合成機制。 研究膜的功能與細胞膜相互的作用。研究膜的功能與細胞膜相互的作用。 研究核質(zhì)關系。研究核質(zhì)關系。 研究疾病與抗性機理。研究疾病與抗性機理。(1)原生質(zhì)體的獲得與純化原生質(zhì)體的獲得與純化

57、 從來源上，原生質(zhì)體獲得途徑主要包括：植從來源上，原生質(zhì)體獲得途徑主要包括：植物葉片、根尖、花粉、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細物葉片、根尖、花粉、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細胞等。植物原生質(zhì)體的分離方法已在前面介紹了，胞等。植物原生質(zhì)體的分離方法已在前面介紹了，這里不再重復。植物原生質(zhì)體的純化方法主要采這里不再重復。植物原生質(zhì)體的純化方法主要采用：用： 沉降法沉降法 漂浮法漂浮法 沉降與漂浮結(jié)合法沉降與漂浮結(jié)合法(2)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 液體培養(yǎng)：把純化后的原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)：把純化后的原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。又分為液體淺層培養(yǎng)和液體懸滴培養(yǎng)兩種。中進行培養(yǎng)。又分為液體淺層

58、培養(yǎng)和液體懸滴培養(yǎng)兩種。 固體平板法：就是將原生質(zhì)體均勻地埋入瓊脂培養(yǎng)固體平板法：就是將原生質(zhì)體均勻地埋入瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，類似于微生物的培養(yǎng)?；羞M行培養(yǎng)，類似于微生物的培養(yǎng)。 雙層培養(yǎng)法：在瓊脂培養(yǎng)基上部加入一薄層液體原生雙層培養(yǎng)法：在瓊脂培養(yǎng)基上部加入一薄層液體原生質(zhì)體培養(yǎng)液，能保持好的濕度，利于原生質(zhì)體的生長。質(zhì)體培養(yǎng)液，能保持好的濕度，利于原生質(zhì)體的生長。 原生質(zhì)體的培養(yǎng)一般經(jīng)過細胞壁再生、細胞分裂成原生質(zhì)體的培養(yǎng)一般經(jīng)過細胞壁再生、細胞分裂成細胞團、愈傷組織細胞團、愈傷組織(或胚狀體或胚狀體)、分化成芽和根、完整植、分化成芽和根、完整植株這幾個過程。株這幾個過程。利用原生質(zhì)體培

59、養(yǎng)可以實現(xiàn)優(yōu)良品種的利用原生質(zhì)體培養(yǎng)可以實現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖；而且，當與其他改變遺傳的技術快速繁殖；而且，當與其他改變遺傳的技術(如細胞融如細胞融合、轉(zhuǎn)基因等合、轉(zhuǎn)基因等)相結(jié)合，就有可能實現(xiàn)新品種的培育。相結(jié)合，就有可能實現(xiàn)新品種的培育。 2. 利用原生質(zhì)體融合培育新植株利用原生質(zhì)體融合培育新植株 通過原生質(zhì)體融合再生植株的過程示意圖如通過原生質(zhì)體融合再生植株的過程示意圖如圖圖57所示。利用該技術已經(jīng)實現(xiàn)了多種優(yōu)良品所示。利用該技術已經(jīng)實現(xiàn)了多種優(yōu)良品種的培育，是一非常有用的遺傳育種手段。種的培育，是一非常有用的遺傳育種手段。(三三) 微生物原生質(zhì)體融合構建新菌株微生物原生質(zhì)體融合構建新菌株 原生質(zhì)體融合已成為微生物育種的重要手段，它的最原生質(zhì)體融合已成為微生物育種的重要手段，它的最大特點是超越了生物體所具有的性的障礙，給育種和不大特點是超越了