1、心力衰竭大鼠腦脊液及血清瘦素改變的研究                      作者：冷秀玉, 曾武濤, 熊艷， 陳國偉， 王禮春 【摘要】  【目的】 檢測心力衰竭大鼠血清、腦脊液瘦素水平及腦脊液/血清瘦素比值改變，對心衰大鼠的瘦素水平、瘦素抵抗及瘦素在血-腦脊液處的轉運進行初步探討?！痉椒ā?

2、#160;通過縮窄雄性Wistar大鼠腹主動脈制成心力衰竭模型。30只大鼠隨機分成空白對照組、假手術對照組和心衰組。預實驗應用超聲心動圖和血流動力學檢測證實術后4個月大鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯心衰。術后4個月采集腦脊液、血清，ELISA法測定瘦素水平。【結果】 心衰組的血清瘦素水平較假手術及空白對照組明顯升高(8.1 ± 4.0) ng/mL vs (3.7 ± 1.7) ng/mL, (3.1 ± 1.4) ng/mL，P< 0

3、.01。 3組腦脊液瘦素水平無顯著差異。心衰組腦脊液/血清瘦素比值較兩對照組明顯降低（10 ± 7 vs 18 ± 8, 22 ± 12, P< 0.01）。兩對照組血清瘦素水平及腦脊液/血清瘦素比值無顯著差異。對照組腦脊液瘦素與血清瘦素呈正相關（r=0.724, P< 0.05），心衰組兩者相關性消失?！窘Y論】 心衰大鼠血清瘦素水平升高，腦脊液瘦素水平無顯著改變，腦脊液/血清瘦素比值下降，腦脊液瘦素與血

4、清瘦素相關性減弱。支持瘦素血-腦脊液飽和轉運系統(tǒng)的存在，提示瘦素進入中樞系統(tǒng)的轉運障礙是瘦素抵抗的一個重要原因。 【關鍵詞】  心力衰竭; 瘦素; 瘦素抵抗; 血-腦脊液轉運     Abstract：【Objective】 To investigate the leptin level, letpin resistance and leptin transport at

5、60;blood-cerebral barrier in the rats with heart failure through assaying cerebrospinal fluid (CSF) and serum leptin level and CSF/serum leptin ratio.  【Methods】 Thirty male W

6、istar rats were randomly divided into blank control group (BC), pseudo-operation control group (OC) and heart failure group (HF) after heart failure was induced by constrictin

7、g abdominal aorta for 16 weeks. Leptin level of serum and CSF were determined by ELISA. 【Results】 Serum level of lepin was increased in HF group compared to BC&

8、#160;and OC groups(8.1 ± 4.0) ng/mL vs (3.7 ± 1.7) ng/mL, (3.1 ± 1.4) ng/mL，P< 0.01. There was no significant difference of CSF leptin level among three

9、 groups. CSF/serum ratio was significantly decreased in HF group compared to BC and OC groups（10 ± 7 vs 18 ± 8, 22 ± 12, P< 0.01）. No signific

10、ant difference of serum leptin level and CSF/serum ratio was found between two control groups. CSF leptin level correlated positively with serum leptin level （r=0.724, P<&#

11、160;0.05）in BC and OC groups and the relationship disappeared with increased serum leptin level in HF group. 【Conclusions】 Serum level was increased in the rats with hear

12、t failure while there was no significant change of CSF leptin level. Decreased CSF/serum leptin ratio and weakend correlation between CSF and serum leptin level indicates 

13、;the existence of saturable leptin blood-CSF transport system and that deteriorating letpin transport from peripheral blood to CSF is one possible reason for letpin resistance.

14、0;   Key words：heart failure; leptin; leptin resistance; blood-CSF transport    J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28（）:654-657    瘦素（leptin）是調節(jié)機體能量和體質量的重要物質，研究證實瘦素與心血管疾病有密切關系1。近期，

15、在肥胖個體中發(fā)現(xiàn)的瘦素抵抗開始成為研究熱點，尤其是瘦素在血-腦屏障的運輸環(huán)節(jié)2。我們之前的臨床研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)患者血清瘦素水平升高，可能存在瘦素抵抗3，但心衰患者臨床研究尚未就瘦素變化得出定論4。原因之一是瘦素水平影響因素多，在臨床研究中較難控制。動物模型則可盡量避免瘦素影響因素，但目前為止，心力衰竭動物的瘦素系統(tǒng)變化尚未見報道。本部分通過縮窄腹主動脈的方法建立大鼠心衰模型，通過檢測心力衰竭大鼠血清、腦脊液瘦素水平及腦脊液/血清瘦素濃度比值，對心衰大鼠的瘦素水平、瘦素抵抗及瘦素在血-腦屏障處的運輸進行初步

16、探討。    1   材料和方法    1.1   心衰模型的建立和實驗分組    清潔級的雄性Wistar大鼠30只,體質量200250 g,由中山大學動物實驗中心提供。隨機分成空白對照組（blank control, BC組, 8只）、假手術對照組（operation control, OC組，8只），和心衰組（chronic heart

17、60;failure, CHF組，14只）。心衰組大鼠以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離出腹主動脈，在腎動脈上方將腹主動脈與鈍頭9號探針（外徑0.8 mm）一起結扎，造成狹窄。假手術組經(jīng)同樣步驟，但不縮窄動脈。術后8周末開始應用超聲，每4周進行一次心功能測定，至術后16周末發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)明顯心衰，取部分大鼠作血流動力學測定進一步確定5。    1.2   腦脊液采集    將大鼠稱重后麻醉，將頭部固定于定向儀上，暴露出枕骨大孔。由枕骨大

18、孔進針直接抽取腦脊液（80120 L），置低溫冰箱保存，待測瘦素。抽取完畢后注入等量的消毒生理鹽水，以保持原來腦脊髓腔的壓力6。    1.3   血流動力學檢測    經(jīng)右頸總動脈插管（傳感器）入左室，應用Biolab生物信號采集與處理系統(tǒng)（四川成都泰盟電子有限公司）記錄左室內壓變化，穩(wěn)定10 min后，測定左室收縮末期壓力（left ventricular end systolic pressure, LVESP

19、）、左室舒張末期壓（left ventricular end diastolic pressure, LVEDP）、左室內壓力最大下降/上升速率（±dp/dt）,各數(shù)值均為連續(xù)10個心搏的平均值。    1.4   血液采集    測定血流動力學指標后，通過動脈插管直接采血12 mL，置于非抗凝干燥管內，靜置30 min，離心后取血清測定瘦素。    1.5 

20、;  瘦素測定    瘦素測定采用DSL-10-24100鼠瘦素ELISA Kit (Murine leptin, 天津天碩生物制品有限公司)?？蓽y最低濃度為0.04 ng/mL，批內變異系數(shù)5.4%6.9%，批間變異系數(shù)3.8%7.3%。    1.6   統(tǒng)計學處理    計量資料采用均數(shù) ± 標準差（±s）表示，多組資料采用ANOV

21、A分析，兩組間差異采用多重比較方法（方差齊性采用LSD法，方差非齊性采用Tambanes T2 法）。非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗，指標間關系分析用相關性分析，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均用SPSS 10.0數(shù)據(jù)處理軟件包進行處理。    2   結   果    2.1   實驗大鼠的一般資料和血流動力學參數(shù)    實驗

22、結束時，空白對照組無死亡，心衰組死亡4只大鼠，假手術對照組2例死亡。心衰組大鼠全部出現(xiàn)活動減少、明顯腹水。3組在體質量和心率上無明顯差異。 但心衰組與后兩組相比左室質量指數(shù)（left ventricle mass index, LVMI）和血流動力學指標存在顯著不同。心衰組的LVMI較兩對照組(假手術對照組和空白對照組)明顯升高。心衰組的+dp/dt，-dp/dt均較對照組顯著降低。同時，心衰組的LVEDP明顯升高，證明已存在明顯心衰（表1）。    2.2   瘦素水平&#

23、160;   心衰組的血清瘦素水平較假手術及空白對照組明顯升高（F=7.88, P< 0.05），腦脊液瘦素水平無顯著差異（F=0.09, P >0.05）。假手術對照組與空白對照組相比，血清和腦脊液瘦素水平均沒有顯著差異（表2）。    2.3   腦脊液/血清瘦素比值    心衰組腦脊液/血清瘦素比值較兩個對照組明顯降低（T=4.49, P< 0.01），假手術對照組與空白對

24、照組相比沒有顯著差異（表2）。    2.4   血清與腦脊液瘦素水平之間的相關性    相關分析顯示對照組（手術對照及空白對照）血清瘦素水平與腦脊液水平呈正相關（r=0.724, P=0.03）。心衰組兩者之間的相關性明顯減弱（r=0.553, P=0.097）。兩者相關性散點圖及趨勢線可看出，兩項指標之間的相關性隨著血清瘦素水平升高而趨于減弱，腦脊液瘦素在高血清瘦素水平時趨于穩(wěn)定，不再繼續(xù)升高（圖2）。    3 

25、;  討   論    多項研究表明神經(jīng)內分泌系統(tǒng)的激活是CHF的一個重要生物學特征7。CHF患者常伴有能量代謝紊亂，并與血流動力學參數(shù)相關8。瘦素由肥胖基因編碼，通過影響食欲和能量代謝來調節(jié)體質量及某些神經(jīng)內分泌功能，據(jù)此推測瘦素可能參與了心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展4。    我們之前的臨床研究亦發(fā)現(xiàn)心衰患者血清瘦素水平升高3，但也有研究者有不同的發(fā)現(xiàn)4。多數(shù)學者認為，臨床研究存在差異的一個主要原因是入選的CHF患者亞組不同，而且即使是同一研究，試驗組和對照組之間的可比

26、性也存在著這樣和那樣的缺陷。具體有影響瘦素的一般因素，如年齡、性別、種族、體質量、血壓等。心衰患者心功能分級、病程不同，不同時期、心功能分級以及有無惡液質的心衰患者的瘦素水平有可能不同；治療不同，各研究中心衰患者均未中斷服用治療藥物，而心衰治療藥物對瘦素水平有可能產生影響；心衰病因構成不同，雖多為擴心病和冠心病，但構成比不同。而不同病因所導致的心衰瘦素水平有可能有差異9。這些因素部分可通過完善試驗設計加以糾正，但部分如第點鑒于倫理學考慮在臨床中難以改善。而動物實驗中，這些影響因素得到了較大限度的改善。    本研究采用較為成熟的壓力高負荷誘導的心衰模型。

27、采用外徑約0.8 mm的探針作為縮窄標準，效果理想，在16周對大鼠的血流動力學檢測顯示，大鼠已發(fā)生明顯心衰，與文獻報道一致5 。本研究中心衰大鼠與對照組體質量無顯著差異，證明尚未出現(xiàn)明顯的能量負平衡。心衰組血壓與對照組相比也沒有明顯升高，避免了血壓對瘦素的影響。本部分研究首次提供了心衰大鼠血清瘦素水平較對照組升高的實驗數(shù)據(jù)，支持我們之前在心衰患者中觀察到的高瘦素血癥3。    瘦素的生理作用可分為中樞作用和外周作用。早期瘦素相關研究多集中在瘦素的外周作用，肥胖個體中瘦素抵抗的出現(xiàn)使研究者開始注意到瘦素的中樞作用2。瘦素發(fā)揮中樞作用的一

28、個前提是穿過血-腦脊液屏障，與特異的瘦素受體結合，啟動受體后信號轉導途徑，發(fā)揮生物效應。因此，瘦素在血-腦脊液屏障的運輸機制逐漸受到重視。    1996年Banks等10通過外周靜脈注射125I標記的瘦素測定瘦素在血-腦脊液屏障處的轉運過程。他們的結果顯示125I-leptin該處的轉運常數(shù)為5.87×10-4mL/g/min,比標記的白蛋白的轉運速率高20倍。非標記的瘦素可以劑量依賴性方式抑制125I-leptin的轉運。而同樣具有飽和轉運系統(tǒng)的酪氨酸和胰島素則不能抑制125I-leptin的轉運。提示125I-leptin具有特異的飽和轉

29、運系統(tǒng)。同時，該轉運系統(tǒng)在中樞以外并不存在。Wong等11對9例受試者進行了血漿和腦脊液瘦素濃度24 h監(jiān)測。發(fā)現(xiàn)，血中瘦素水平有明顯的晝夜節(jié)律，每日波動幅度約為50倍。而腦脊液中瘦素濃度沒有明顯晝夜節(jié)律，全日波動幅度僅為2倍。提示血-腦脊液瘦素系統(tǒng)是一個高度易飽和系統(tǒng)。Furuhata等6研究顯示轉基因肥胖小鼠的血清瘦素水平明顯升高，但腦脊液的瘦素水平則無顯著變化。提示瘦素進入中樞系統(tǒng)的轉運障礙是瘦素抵抗的一個重要原因。本研究結果顯示，雖然CHF大鼠的血清瘦素水平較對照組明顯升高，腦脊液的瘦素水平卻沒有明顯差異。盡管腦脊液瘦素水平與血清瘦素在較低血清瘦素水平的對照組中呈正相關，但超

30、過一定的閾值后，隨著血清瘦素水平升高，這種相關性在心衰組中明顯減弱，腦脊液瘦素水平基本維持在一定的穩(wěn)態(tài)濃度，支持瘦素血-腦脊液飽和轉運系統(tǒng)的存在。    Caro等12對有明顯瘦素抵抗的肥胖個體進行了腦脊液瘦素測定，發(fā)現(xiàn)肥胖者血清瘦素較對照組明顯升高，但腦脊液瘦素水平?jīng)]有顯著改變。提出CSF/血清比值降低可能是肥胖患者瘦素抵抗的機制之一。本研究中CHF組CSF/血清瘦素比值較對照組明顯降低,提示CHF中也存在一定程度的瘦素抵抗。    腦脊液瘦素濃度水平僅是瘦素發(fā)揮中樞作用必須經(jīng)過的第一步。之后，還有數(shù)個環(huán)節(jié)影響瘦

31、素生理作用的發(fā)揮，如腦部不同功能區(qū)對瘦素的特異性結合能力。在Banks等10放射性標記瘦素實驗中，發(fā)現(xiàn)腦部不同部位的放射性有顯著差異，提示即使在相同的腦脊液瘦素濃度基礎上，不同組織的親和性也是決定瘦素攝取的因素。此外，胞膜表達的不同受體亞型、受體后信號轉導水平等也是瘦素作用的影響因子。因此，CHF瘦素系統(tǒng)改變及其機制尚需更深入的研究?！緟⒖嘉墨I】  LUO J D, ZHANG G S, CHEN M S. Leptin and cardiovascular

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