1、人胚胎干細胞的研究進展周進 學號10170807【摘要】干細胞（Stem Cell）是一類具有分化潛能和自我復制的早期未分化細胞。胚胎干細 胞（Embryonic stem cells, ES細胞）是一種早期胚胎內細胞（inner cell mass, ICM ）或原始生殖細胞（primordial germ cell, PGC ）經體外分化抑制培養(yǎng)，分離和克隆得到的具有 發(fā)育全能性的高度未分化細胞。人類胚胎干細胞系的建立是人類發(fā)育生物學研究的重大突破，揭示了人體發(fā)生發(fā)展奧秘的進程，可能為現(xiàn)代臨床醫(yī)療模式帶來革命性的變化?，F(xiàn)對人類 胚胎干細胞的來源，建系、生物學特性、應用前景及所涉及的倫理學問

2、題作一綜述?！娟P鍵詞】胚胎干細胞；克?。粋惱韺W，醫(yī)學；綜述1、胚胎干細胞的概念胚胎干細胞是從哺乳動物早期胚胎內細胞團（ICM）或桑棋胚分離出來的、能在體外長期培養(yǎng)的、高度未分化的全能細胞系，可在適合的條件下分化為胎兒或成體的各種類型的組織 細胞。胚胎干細胞屬全能干細胞。 ESCs這一名詞因其來源于胚胎而得名，但從研究角度來說，其概念一直沒有一個特殊的標準，2001年美國國立衛(wèi)生院根據 Austin Smith 對小鼠ESCs的研究，概括了 ESCs的一些基本特征，對其概念提出了一系列標準 1:、來源于內細胞 團或囊胚上胚層；、能夠無限地進行對稱分裂并保持未分化狀態(tài)（長期自我更新）；、顯示并維持

3、正常、完整（二倍體）和穩(wěn)定的染色體核型；、全能的ESCs能夠分化成三個胚 層（內胚層、中胚層、外胚層）來源的所有細胞類型；、在發(fā)育過程中能整合到所有胚胎組 織中（體外經長期培養(yǎng)的小鼠 ESCs,被植入另一胚胎形成嵌合體動物后，仍能產生所有組織）；、具有能克隆形成胚胎細胞系的能力，并能產生卵子或精子細胞；、基因克隆，即一個單一的ESCs能產生一群具有相同遺傳特性的細胞（克?。@些細胞有著與親代細胞相同的特征；、表達轉錄因子 Oct- 4,后者繼而激活或抑制大量的靶基因,以使ESCs維持未分化狀態(tài)；、可被誘導而繼續(xù)增殖或進入分化狀態(tài)；、缺乏細胞周期中的 G1期的限制點。ESCs大部分時間都處于細

4、胞周期的S期，在此期進行DNA合成。與已分化的體細胞不同,ESCs不需任 何外界刺激來啟動 DNA的復制。其中、不適用 于人的EGCs,和不適用于人的 ESCs,所有的標準都適用于小鼠的ESCs。2、胚胎干細胞的獲取途徑及其“多能性目前胚胎干細胞的獲取途徑主要有2個:一是從自然胚胎中獲取，可在胚胎發(fā)育的不同階段獲得；二是通過細胞克隆得到的胚胎中獲取，也可在胚胎的不同發(fā)育階段獲得。隨著克隆技術的發(fā)展后者顯得更為容易。胚胎干細胞的多能性表現(xiàn)在它具有多種分化發(fā)育的潛能。其 多能性學術上用兩個詞來加以區(qū)分：全能（totipotent）,即指受精卵及囊胚細胞所具有的能力，除具有分化為機體所有細胞類型的潛

5、能外，還有形成完整生物體的潛能；多能（pluripotent）,即指從內細胞團（ICM）或原始生殖細胞（又稱胚胎生殖系干細胞）衍生而來的細胞或細胞株所 具有的能力，能形成包括生殖系在內的所有組織類型，但形成一個完整的生物體的可能性很小。3、胚胎干細胞研究的主要物種類型3.1人類目前全世界已取得了 60余種不同基因的胚胎干細胞系，主要分布在美國、澳大利亞、新加坡、印度及以色列等地。由于助孕技術中的超促排卵及體外受精2胚胎移植（試管嬰兒）技術的不斷成熟和在世界各地的迅速開展，人胚胎干細胞的來源顯得比其他物種更為容易和豐富，同時因為研究的直接性而為廣大學者所重視。但由于法律和倫理的原因，胚胎干細胞的

6、研究將受到諸多的限制。3. 2 靈長類靈長類動物與人的關系密切且沒有太多法律與倫理上的限制，所以靈長類胚胎干細胞是目前研究最多的胚胎干細胞種類，以恒河猴與絹猴為代表2。恒河猴與人類的關系最為密切，在生殖與生長發(fā)育過程中與人有許多相似之處，因此是胚 胎學研究的最佳模型，恒河猴胚胎干細胞也就成了了解各種人體組織分化的很好的體外模型但其生殖特性(性成熟晚、妊娠期長、單胎孕育等)限制了其應用；絹猴為西半球靈長類動物與人類的關系不如恒河猴近，但因其生殖特性在實驗中獲得了廣泛的應用。絹猴一般是多胎孕育,性成熟期只有18個月，妊娠期較短，更重要的是絹猴的卵巢周期可以在前列腺素的調節(jié)下同步化，這就可能收集到大

7、量生長發(fā)育一致的胚胎。目前，絹猴胚胎干細胞為我們提供了一個了解靈長類胚胎移植和妊娠母系識別的非常重要的模型。從恒河猴與絹猴胚胎中分離出的胚胎干細胞均具有其特有的一套特異性標志物，它們包括階段特異性胚胎抗原 3和4(SSEA-3和SSEA-4)、高分子糖蛋白TRA-1-60 和TRA-1-81、堿性磷酸酶等。這些標志物與標志人胚胎性癌細胞(embryonal carcinomacells , EC細胞)的表面抗原相同。這表明靈長類與人類在胚胎學上有高度的相似性，而鼠胚胎干細胞僅表達SSEA-1與堿性磷酸酶活性，說明胚胎干細胞表面標志物具有物種差異。3. 3 小鼠(mouse)由于歷史上的廣泛應用

8、及已明了的遺傳學機制和多產特性，使小鼠成為哺乳動物胚胎學的主要研究對象。世界上最早的胚胎干細胞株就是首先從小鼠胚胎中分離出來的。胚胎干細胞分離及培養(yǎng)的方法學也是由此建立并發(fā)展起來的。對小鼠胚胎干細胞做進一步研究有助于靈長類及人類胚胎干細胞研究的發(fā)展。3. 4 其他如魚、鳥、兔、豬等脊椎動物中亦能分離出多能胚胎干細胞株。胚胎干細胞研究物種的多樣化對于研究生物體的早期發(fā)生過程是十分必要和重要的，如細胞的譜系定型和重組基因印跡等，對基因修飾及核移植技術的研究和發(fā)展也有重要的作用。4、胚胎干細胞的分離與增殖技術以從靈長類胚胎ICM中分離靈長類胚胎干細胞為例3 簡述如下。4. 1 分離ICM前的準備準備

9、小鼠原始成纖維細胞層。將小鼠原始成纖維細胞用30Gy的丫-射線處理，使它終止有絲分裂活動，以5 X104個/ cm2 的密度置于用0. 1 %動物膠處理后的組織皿中，加入培養(yǎng)液(80 % DMEM 、20 %胎牛血清、0.1mmol/ L 22 疏基乙醇和1 % 非必需氨基酸溶液)，置5 % CO2溫箱中孵育過夜。4. 2分離ICM 將排卵后6d的恒河猴囊胚(或排卵后8d的絹猴囊胚)放入0. 5 % DMEM 中孵育，至透明帶破裂時立即將囊胚移入含兔抗恒河猴脾細胞(或兔抗絹猴脾細胞)抗體的DMEM中，孵育30min ,經DMEM沖洗后再移入1 :10的幾內亞豬補體中 30min ,再經 DME

10、M 沖洗后，用吸管吸除ICM中的滋養(yǎng)層細胞，最后將ICM種植在飼養(yǎng)層上。4. 3 胚胎干細胞的培養(yǎng)和增殖種植710d后，將ICM來源的細胞團移入含 0. 05 %胰蛋白酶的EDTA中35min ,用吸管輕輕吹打使它散開，將細胞種植到新培養(yǎng)基上。細胞集落形成后，再將單個細胞分離出來種植到新培養(yǎng)基上，如此反復，710d進彳T 1次。4. 4 胚胎干細胞的冷凍保存如需要將胚胎干細胞冷凍，最好在培養(yǎng)早期進行，選擇細胞形態(tài)及核型均正常的細胞冷凍，并在液氮中長期保存。4. 5 操作注意事項(1)定期將未分化的細胞集落從已分化的細胞中分離出來并種植到新的培養(yǎng)基上;(2)轉移細胞時盡量快，以免細胞發(fā)生解離和死

11、亡;(3)分離細胞集落時使每個部分含510個細胞，否則細胞過多將導致分化，細胞過少則克隆的效率低;(4)由于胚胎干細胞是對各種內毒素最為敏感的細胞，故要重視培養(yǎng)液和血清的質量 ;(5)重視原始成纖維細胞的質量，沒有原始成纖維細胞所有的胚胎干細胞將在710d內分化或死亡，若原始成纖維細胞質量差，則不能有效地抑制胚胎干細胞的分化而導致培養(yǎng)增殖失敗。總之胚胎干細胞的分離與培養(yǎng)是極其復雜的實驗室技術，目前的培養(yǎng)條件尚不能避免胚胎干細胞的分化，而且隨著培養(yǎng)周期次數的增多，胚胎干細胞的穩(wěn)定性也會下降。因此，如何改進培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術是胚胎干細胞研究中最重要的問題。5、人類胚胎干細胞的來源 主要有：(1)從

12、人類胚胎的囊胚期內細胞群中直接分離多能干細胞4;(2)從終止妊娠的胎兒組織中分離出多能干細胞5；(3)體細胞核轉移(somaticcellnucleartransplantation,SCNT) 。6、人胚胎干細胞系的建立 1989年Prea嘗試從人畸胎瘤分離 ES細胞,初步證明了人 ES 細胞系建立的可能性。1998年Thomson領導的小組將合法獲得的體外受精的人早期胚胎 在體外培養(yǎng)至囊胚期利用免疫外科手術去除透明帶，以抗BeWO細胞的單抗作免疫標記，剔 除外層細胞，以35Gy 丫射線照射小鼠胚胎成纖維細胞作飼養(yǎng)層，以DMEM+胎牛血清+谷氨酰月堂+疏基乙醇+非必需氨基酸作為培養(yǎng)液，體外培

13、養(yǎng)人囊胚內細胞群，915d后將長出的細胞 團吹散或者用胰酶或EDTA消化，然后繼續(xù)在小鼠滋養(yǎng)層細胞上生長，挑選具有均一的未分化形態(tài)的單克隆細胞團，吹散成50100個細胞的小團后再行培養(yǎng)，如此重復直至成系。在此期 間每一步都需觀察細胞染色體核型，以確定它未癌變。此后細胞系經吹打或膠原酶IV處理長期傳代。他們從14個囊胚中，最終建立起5個人類ES細胞系：H1、H13、H14、H7和H19。 這些細胞系繼續(xù)培養(yǎng) 56個月傳32代仍可繼續(xù)生長6。Gearhart領導的小組采用了與 Thomson 小組不同的方法，從59周齡流產胎兒的性腺崎 (gonadalridges) 及腸系膜中分 離原始的干細胞(

14、primordialgermcells,PGCs), 命名為EG細胞。以期避免因直接利用胚胎所 造成的倫理學上的麻煩。將EG細胞體外培養(yǎng)于小鼠成纖維細胞層上，培養(yǎng)體系中加入重組人LIF,重組人堿性成纖維細胞生長因子及Foskolin,721d后形成較大的多細胞集落，其形態(tài)與小鼠EG或ES細胞集落相似。經過一系列與Thomson實驗室相似的免疫組化及功能實驗，證明獲得了可成系的人胚胎干細胞集落7。迄今為止，除Thomson、Gearhart和Shamblott等的報道外，人ES細胞分離尚無成功報道，主要原因是人ES細胞建株的條件尚不成熟,而對人ES細胞體外誘導分化的研究至今尚無報道。7、胚胎干細

15、胞的應用前景及主要問題由于胚胎干細胞的高度復制能力及多向性分化的潛能，已展示出很好的研究、應用前景。如將特殊改變的基因轉導至ES細胞中，體外選擇后將ES細胞導入機體，使ES中的遺傳信息傳達給子代，可能有助于克服出生缺陷，糾正某些遺傳性疾病8；將經過基因修飾過的 ES或EG細胞與正常細胞放在一起形成嵌合體，研究發(fā)育進程中細胞與細胞之間相互彳用對細胞突變的影響9;將ES或EG細胞中某個基因敲除或將外來的某個基因導入，研究特定基因對胚胎發(fā)育、藥物代謝和腫瘤形成的影響等1012。最近有人用RNAi的方法使hES細胞中某個基因表達下降，獲得較穩(wěn)定的結果13?？茖W家 們認為有希望通過該方法創(chuàng)建免疫無反應的

16、hES細胞系，從而控制hES細胞移植后的排斥反應，使hES細胞移植易于成功。人胚胎干細胞研究有望為目前臨床某些難治性疾病提供治療的新方法甚至治愈的可能性。如可將hES體外誘導分化的心肌細胞導入心室壁，替代己梗死的心肌功能14;應用體外分化的胰島細胞治療1型糖尿病；應用誘導分化的神經細胞前體細胞治療帕金森病。有人預言，將來可應用胚胎干細胞在體外形成的器官取代功能衰竭的體內 器官，為器官移植提供重要的來源保障。當然要實現(xiàn)胚胎干細胞的臨床應用，還要做很多工作需要研究闡明胚胎干細胞基因組印跡狀態(tài)(genomicim printing)。基因組印跡是某些等位基因的表遺傳修飾，與胎兒發(fā)育異常及腫瘤生長有關

17、。在個體發(fā)育不同時期，基因組印跡狀態(tài)不同。己有研究表明，鼠胚胎干細胞基因組印跡異?；虿环€(wěn)定；但另一組研究者則發(fā)現(xiàn)人和小鼠EG細胞的基因組印跡基本正常，這可能為胚胎干細胞臨床應用排除了一大障礙。但對 hES細胞的研究尚未見報道。需要解決免疫排斥問題。研究表明 ，與其他同種異體的組織器官移植相比 ，雖然hES、hEG 細胞移植的排斥反應較輕，但它仍不可避免地會發(fā)生。供者與受者 ABO血型抗原、HLA組 織相容性抗原、微組織相容性復合物抗原 (minor histocompatility complex antigensMHC）的不同而誘發(fā)排斥反應。參考文獻1 Ruth Kirschstein, L

18、ana R. Skirboll Scientific Progress and Future Research DirectionsJ.StemCells.2001.2Thomson JA .Marshall VS. Primate embryonic stem cells J .Current copics in DevelopmentalBiology ,38 :13321.3 Thomson JA , ItskovitzEldor J .Shapiro SS ,et al. Embryonicstem cell lines derived from human blastocysts J

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