1、會(huì)計(jì)學(xué)1常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique第1頁/共59頁n核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA復(fù)性復(fù)性過程中，如果把不同過程中，如果把不同DNA單單鏈分子放在同一溶液中，或把鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放放在一起，只要在在一起，只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈之間形成雜化雙鏈

2、(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理第2頁/共59頁復(fù)性復(fù)性RNADNA第3頁/共59頁（一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。 第4頁/共59頁用放射性核素、生物素或熒光染料用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為為“探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核

3、酸分子存在。苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術(shù)第5頁/共59頁二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern blotting)（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern blotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western blotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。第6頁/共59頁n其他：其他：斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣

4、(DNA array) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip)第7頁/共59頁三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較第8頁/共59頁分子雜交實(shí)驗(yàn)第9頁/共59頁放放射射自自顯顯影影照照片片第10頁/共59頁DNA芯片技術(shù)第11頁/共59頁P(yáng)CR技術(shù)的原理與應(yīng)用技術(shù)的原理與應(yīng)用The Principle and Application of PCR Technology第12頁/共59頁5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、PCR技術(shù)的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 第13頁/共59頁Cycle 35

5、5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含的含量可以擴(kuò)大量可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。第14頁/共59頁P(yáng)CR技術(shù)原理示意圖技術(shù)原理示意圖 第15頁/共59頁n PCR的基本反應(yīng)步驟變性95C延伸72C退火Tm-5C第16頁/共59頁 模板DNA 特異性引物 耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR體系基本組成成分第17頁/共59頁 利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段； 利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序

6、列相似的基因片段； 利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。 二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆第18頁/共59頁利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。 PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變第19頁/共59頁將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性 。（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析第20

7、頁/共59頁（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)第21頁/共59頁（二）原位PCR技術(shù)第22頁/共59頁（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動(dòng)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。 第23頁/共59頁n實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理技術(shù)原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物RQ 3355第24頁/共59頁n實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PRC非探針類探針類1. TaqMan探針法 2. 分子信標(biāo)探針法 3. F

8、RET探針法 第25頁/共59頁圖20-3 TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖第26頁/共59頁基因文庫基因文庫Gene Library第27頁/共59頁 基因組DNA文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫(cDNA library) n基因文庫(gene library)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。第28頁/共59頁一、基因組一、基因組DNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫是指生物的文庫是指生物的基因組基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群

9、體。 用于構(gòu)建基因組文庫的載體有用于構(gòu)建基因組文庫的載體有 噬菌體、噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。第29頁/共59頁n基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選第30頁/共59頁第一輪篩選第一輪篩選第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選n基因組文庫篩選結(jié)果舉例第31頁/共59頁cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部條件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、c

10、DNA文庫文庫第32頁/共59頁生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique第33頁/共59頁是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA片段有規(guī)律地緊密片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被

11、稱作DNA微陣微陣列列(DNA microarray)。 一、基因芯片n基因芯片(gene chip)第34頁/共59頁n基因芯片工作流程示意圖第35頁/共59頁是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)n蛋白質(zhì)芯片(protein chip)n蛋白質(zhì)芯片作用原理第36頁/共59頁生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA I

12、nteraction Study第37頁/共59頁一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交 各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)第38頁/共59頁標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。 第39頁/共59頁標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖第40頁/共59頁（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途第41頁/共59頁n酵母雙雜交系統(tǒng)的

13、應(yīng)用 證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測(cè)。的生物信息學(xué)推測(cè)。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。 將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合基因融合成為成為“誘餌誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融基因融合的合的“獵物獵物”基因表達(dá)文庫，篩選未知的相互基因表達(dá)文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。作用蛋白質(zhì)。第42頁/共59頁（三）免疫共沉淀技術(shù)的基本原理和用途 免疫沉淀（免疫

14、沉淀（immunoprecipitation IP） 免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。合體系沉淀下來。 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP） 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確

15、定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。性相互作用的有效方法。 CO-IP與質(zhì)譜分析與質(zhì)譜分析 以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白蛋白的結(jié)合蛋白第43頁/共59頁n免疫沉淀原理圖解第44頁/共59頁n免疫共沉淀原理圖解第45頁/共59頁n免疫共沉淀原理圖解蛋白A ， 蛋白B 抗A抗體C進(jìn)行洗脫抗B抗體D進(jìn)行驗(yàn)證IP C ACO-IP C A+B D第46頁/共59頁nCO-IP與質(zhì)譜分

16、析流程第47頁/共59頁電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gel shift assay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定第48頁/共59頁放放射射自自顯顯影影未結(jié)合探針未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)記探針未標(biāo)記

17、探針10Xn凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖第49頁/共59頁染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法第50頁/共59頁n染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖第51頁/共59頁二、RNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。應(yīng)用范圍：研究蛋白與DNA動(dòng)態(tài)作用研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)之間的關(guān)系研究蛋白與RNA的相互作用第

18、52頁/共59頁激光共聚集顯微鏡應(yīng)用技術(shù)Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)第53頁/共59頁激光經(jīng)放大、激光經(jīng)放大、分光后由物鏡分光后由物鏡聚焦于焦平面聚焦于焦平面上，同時(shí)，焦上，同時(shí)，焦平面上被激光平面上被激光掃描的點(diǎn)掃描的點(diǎn)F F所所發(fā)出的一定波發(fā)出的一定波長的熒光通過長的熒光通過檢測(cè)針孔光欄檢測(cè)針孔光欄達(dá)到檢測(cè)器，達(dá)到檢測(cè)器，并成像于顯示并成像于顯示器上，得到相器上，得到相應(yīng)的熒光圖象。應(yīng)的熒光圖象。n激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖第54頁/共59頁n人眼及各類顯微鏡分辯率 人眼分辯率人眼分辯率 0.20mm 光學(xué)顯微鏡分辯率光學(xué)顯微鏡分辯率 0.25um 共焦顯微鏡分辯率共焦顯微鏡分辯率 0.18um 電子顯微鏡分辯率電子