1、DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)DNA Sequencing三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 盛 德 喬n 人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃（Human genome project, HGP）用了大約用了大約10年的時(shí)間，各國政府相繼投入了幾十年的時(shí)間，各國政府相繼投入了幾十億美元，才完成了人類個(gè)體全基因組序列的測(cè)序億美元，才完成了人類個(gè)體全基因組序列的測(cè)序工作。而工作。而2005年以來，出現(xiàn)的年以來，出現(xiàn)的新一代新一代測(cè)序技術(shù)，測(cè)序技術(shù)，卻可在卻可在1個(gè)月內(nèi)，花費(fèi)十幾萬美元就可完成一個(gè)人個(gè)月內(nèi)，花費(fèi)十幾萬美元就可完成一個(gè)人類個(gè)體全基因組序列的測(cè)序工作?，F(xiàn)在，美國、類個(gè)體全基因組序列的測(cè)序工作?，F(xiàn)在，美國、歐洲等各大生物技

2、術(shù)公司、大型生物醫(yī)藥研究機(jī)歐洲等各大生物技術(shù)公司、大型生物醫(yī)藥研究機(jī)構(gòu)等投入大量的人力物力開始了新一輪的構(gòu)等投入大量的人力物力開始了新一輪的下一代下一代測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)的技術(shù)競(jìng)賽，力爭(zhēng)實(shí)現(xiàn)的技術(shù)競(jìng)賽，力爭(zhēng)實(shí)現(xiàn)1000美元完成一美元完成一個(gè)人的全基因組序列的測(cè)序，加速個(gè)人基因組時(shí)個(gè)人的全基因組序列的測(cè)序，加速個(gè)人基因組時(shí)代的到來。代的到來。一、一、DNA測(cè)序技術(shù)概述測(cè)序技術(shù)概述nDNA測(cè)序測(cè)序核酸核酸DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項(xiàng)重要子生物學(xué)一項(xiàng)重要的技術(shù)。的技術(shù)。核苷酸的排列順序核苷酸的排列順序堿基的排列順序堿基的排列順序n1963年，年，Sange

3、r和和Thompson等人第一次完成胰島等人第一次完成胰島素素51個(gè)氨基酸的序列測(cè)定。個(gè)氨基酸的序列測(cè)定。n70年代后期，年代后期，Sanger和和Maxam-Gilbert等人又建等人又建立了核酸序列測(cè)定的方法，立了核酸序列測(cè)定的方法，Sanger雙脫氧末端終雙脫氧末端終止法止法和和Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法將核酸序列化學(xué)裂解法將核酸序列測(cè)定技術(shù)推進(jìn)到測(cè)定技術(shù)推進(jìn)到“直讀直讀”階段，使核酸序列測(cè)定階段，使核酸序列測(cè)定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測(cè)定容易，這樣人們變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測(cè)定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基

4、酸的序列。酸的序列。測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷史測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷史n雙脫氧末端終止法雙脫氧末端終止法 (Sanger 測(cè)序法測(cè)序法)1970s 同位素標(biāo)記，手工同位素標(biāo)記，手工1980s 熒光標(biāo)記，自動(dòng)熒光標(biāo)記，自動(dòng)1990s 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳n合成測(cè)序法（第二代測(cè)序）合成測(cè)序法（第二代測(cè)序）焦磷酸測(cè)序（焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing, Roche/454）合成測(cè)序（合成測(cè)序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa）連接測(cè)序（連接測(cè)序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD）n單分子測(cè)序技術(shù)（第三代測(cè)序）單分子測(cè)序技術(shù)（

5、第三代測(cè)序）HelicosPacific BiosciencesOxford Nanopore 代數(shù)代數(shù)測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)特點(diǎn)代表儀器代表儀器第一代第一代Sanger測(cè)序法測(cè)序法 低通量，高成低通量，高成本本ABI 3730XL第二代第二代循環(huán)芯片技術(shù)循環(huán)芯片技術(shù)高通量高通量高效率高效率成本底成本底Illumina GA ROCH-454 ABI-SOLID第三代第三代單分子測(cè)序單分子測(cè)序試劑用量少，成試劑用量少，成本更低本更低HeliScope二、二、 第一代測(cè)序方法第一代測(cè)序方法1、末端終止法、末端終止法2、化學(xué)裂解法、化學(xué)裂解法3、DNA測(cè)序自動(dòng)化測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物與單使用特異性

6、引物與單鏈模板鏈模板DNA退火，退火，在在DNA聚合酶作用聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用終止，用PAGE區(qū)分長度僅相區(qū)分長度僅相差差1個(gè)核苷酸的個(gè)核苷酸的ssDNA，從而完成測(cè)，從而完成測(cè)序的方法。序的方法。用化學(xué)試劑在用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)各種長度的短鏈，經(jīng)過過PAGE放射自顯影可放射自顯影可直讀直讀DNA順序。順序。類似末端終止法，所不類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣泛。

7、泛。不需酶促反應(yīng)，可以不需酶促反應(yīng)，可以對(duì)寡核苷酸測(cè)序。對(duì)寡核苷酸測(cè)序。1、高負(fù)荷，、高負(fù)荷，1塊膠可測(cè)塊膠可測(cè)16個(gè)樣品；個(gè)樣品；2、機(jī)讀不、機(jī)讀不需放射自顯影；需放射自顯影；3、安、安全不用同位素；全不用同位素；4、簡(jiǎn)、簡(jiǎn)單迅速單迅速8-10h。測(cè)序的基本過程測(cè)序的基本過程1.制備待測(cè)制備待測(cè)DNA序列模板；序列模板；2.酶促或化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變酶促或化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變“等差數(shù)列等差數(shù)列”（n=1）；）；3.電泳電泳PAGE；4. 讀序。讀序。第一代測(cè)序computer analysis凝膠中凝膠中DNA移動(dòng)方向移動(dòng)方向樣品槽樣品槽激光器激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡成象透鏡聚焦透鏡聚

8、焦透鏡高靈敏度相機(jī)高靈敏度相機(jī)旋光鏡旋光鏡/棱鏡組件棱鏡組件Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 化學(xué)裂解是化學(xué)裂解是Maxam和和Gilbert等人等人1977年創(chuàng)建的，用來測(cè)定年創(chuàng)建的，用來測(cè)定DNA序列?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在序列?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定地裂處特定地裂解解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列 n=1），），經(jīng)過經(jīng)過PAGE和放射自顯影后，可以直接讀出和放射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。的順序。 某些試劑能修飾或破壞某些試劑能修飾或破壞DNA鏈上特定核苷酸的堿基進(jìn)而鏈上特定核苷酸的堿基進(jìn)而使使N-

9、糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環(huán)以糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環(huán)以-消除反應(yīng)，在消除反應(yīng)，在3和和5位位上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。4種核苷酸的特異裂解種核苷酸的特異裂解和鑒別方法如下：和鑒別方法如下：反應(yīng)體反應(yīng)體系系堿基修飾堿基修飾試劑試劑堿基修飾堿基修飾反應(yīng)反應(yīng)主鏈斷裂主鏈斷裂試劑試劑斷裂點(diǎn)斷裂點(diǎn)GDMSG甲基化甲基化六氫吡啶六氫吡啶GG+A甲酸甲酸脫嘌呤脫嘌呤六氫吡啶六氫吡啶G or AC+T肼肼嘧啶開環(huán)嘧啶開環(huán)六氫吡啶六氫吡啶C or TC肼（加鹽）肼（加鹽）胞

10、嘧啶開環(huán)胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶六氫吡啶C原原 理理1.用放射性核素標(biāo)記待測(cè)用放射性核素標(biāo)記待測(cè)DNA一側(cè)末端一側(cè)末端2.將標(biāo)記將標(biāo)記DNA分為分為G、A+G、C+T、C 4個(gè)反應(yīng)個(gè)反應(yīng)體系體系3.用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機(jī)斷用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機(jī)斷裂裂DNA片段某種堿基中的任何一個(gè)，產(chǎn)生一片段某種堿基中的任何一個(gè)，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的小的DNA片段的混合物片段的混合物4.電泳分離，放射自顯影得到互相錯(cuò)落的梯形圖電泳分離，放射自顯影得到互相錯(cuò)落的梯形圖譜，即可讀出譜，即可讀出DNA序列序列n反應(yīng)產(chǎn)物電泳

11、n放射自顯影n閱讀Sanger雙脫氧末端終止法雙脫氧末端終止法n原理原理DNA鏈的合成反應(yīng)，只不過反應(yīng)體系中加入鏈的合成反應(yīng)，只不過反應(yīng)體系中加入了四種雙脫氧核糖核苷酸（了四種雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP）中的一）中的一種。種。在在DNA鏈合成過程中鏈合成過程中ddNTP會(huì)代替部分會(huì)代替部分dNTP作為底物進(jìn)行作為底物進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。合成反應(yīng)。一旦一旦ddNTP摻入到合成摻入到合成DNA鏈中，正在延伸鏈中，正在延伸的的DNA鏈將終止。鏈將終止。n經(jīng)電泳分離，放射自顯影，直接讀出經(jīng)電泳分離，放射自顯影，直接讀出DNA的核苷酸序列的核苷酸序列反應(yīng)體系反應(yīng)體系n引物引物n模板：模板：純單鏈純單鏈

12、DNA和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈DNAnDNA聚合酶：聚合酶：Klenow大片段大片段n放射性同位素標(biāo)記的放射性同位素標(biāo)記的dNTP：32P-dNTP、-32S-dNTPnddNTPn用于測(cè)序的變性凝膠電泳：用于測(cè)序的變性凝膠電泳：膠長膠長40cmddNTP 讀出模板互讀出模板互補(bǔ)序列補(bǔ)序列dNTP 凝膠電泳凝膠電泳 較大片段較大片段 較小片段較小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物Klenow酶酶 未知序列的單鏈未知序列的單鏈DNA 讀出待測(cè)讀出待測(cè)序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 A C T GddGddGddGdd

13、GGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 Sanger雙脫氧末端雙脫氧末端終止法終止法n化學(xué)降解法程序復(fù)雜化學(xué)降解法程序復(fù)雜 后來逐漸被后來逐漸被Sanger法代替法代替 這這種方法都需要放射性同位素標(biāo)記種方法都需要放射性同位素標(biāo)記 操作繁瑣操作繁瑣 不能不能自動(dòng)化不能滿足大規(guī)模測(cè)序的要求。自動(dòng)化不能滿足大規(guī)模測(cè)序的要求。n到了到了20世紀(jì)世紀(jì)80年代末年代末 研究人員逐漸利用熒光標(biāo)記研究人員逐漸利用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記測(cè)序代替同位素標(biāo)記測(cè)序 產(chǎn)物，經(jīng)過平板電泳分離產(chǎn)物，經(jīng)過平板電泳分離 熒熒光分子在激光的激發(fā)下可以發(fā)射出不同波長的熒光分子在激光的激發(fā)下可以發(fā)射出

14、不同波長的熒 光光 ，根，根 據(jù)據(jù) 熒熒 光光 信信 號(hào)號(hào) 可可 以以 確確 定定DNA序序 列。列。目前所用自動(dòng)測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳多色熒光標(biāo)記多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 單色熒光標(biāo)記單色熒光標(biāo)記平板電泳平板電泳同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記平板電泳平板電泳A C G TA C GT測(cè)序圖譜測(cè)序圖譜T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T毛細(xì)管電泳n基本原理：基本原理：與鏈終止法測(cè)序原理相同，只是用不同與鏈終止法測(cè)序原理相同，只是用不同的熒光色彩標(biāo)記的熒光色彩標(biāo)記ddNTP，如，如ddATP標(biāo)記標(biāo)記紅色紅色熒光熒光,，ddTTP標(biāo)記標(biāo)記綠

15、綠色熒光，色熒光，ddCTP標(biāo)記標(biāo)記藍(lán)藍(lán)色熒光色熒光, ddGTP標(biāo)記標(biāo)記黃色黃色熒熒光，由于每種光，由于每種ddNTP帶有各自特定的熒帶有各自特定的熒光顏色，而簡(jiǎn)化為由光顏色，而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基。種堿基。DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目前商品化生產(chǎn)的測(cè)序儀目前商品化生產(chǎn)的測(cè)序儀ABI3730測(cè)序儀，測(cè)序儀，最長可以測(cè)最長可以測(cè)1200個(gè)堿基個(gè)堿基DNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用1.分析基因組核苷酸排列序列分析基因組核苷酸排列序列2.尋找致病基因?qū)ふ抑虏』?.基因定點(diǎn)誘變的基礎(chǔ)基因定點(diǎn)誘變的基礎(chǔ) 4.基礎(chǔ)研究（基因表達(dá)、突變）基礎(chǔ)研究（基因表達(dá)、突變）

16、5.臨床應(yīng)用（基因診斷、基因治療）臨床應(yīng)用（基因診斷、基因治療）目前所用測(cè)序技術(shù)的缺點(diǎn)目前所用測(cè)序技術(shù)的缺點(diǎn)1.測(cè)序的原理是測(cè)序的原理是DNA鏈終止法，這注定了一個(gè)反應(yīng)鏈終止法，這注定了一個(gè)反應(yīng)所測(cè)序列不可能太長，目前為所測(cè)序列不可能太長，目前為1000個(gè)核苷酸左右。個(gè)核苷酸左右。2.測(cè)序反應(yīng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力測(cè)序反應(yīng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力 科學(xué)家們完成第一個(gè)人類基因組測(cè)序整整花了科學(xué)家們完成第一個(gè)人類基因組測(cè)序整整花了13年的時(shí)間，耗費(fèi)了年的時(shí)間，耗費(fèi)了30億美元的費(fèi)用。億美元的費(fèi)用。3.測(cè)序準(zhǔn)確度不高測(cè)序準(zhǔn)確度不高 DNA聚合酶造成的堿基錯(cuò)配，聚合酶造成的堿基錯(cuò)配，DNA序列判讀錯(cuò)誤。序列判讀錯(cuò)誤。4.測(cè)序基于測(cè)

17、序基于PCR反應(yīng)，需要引物，并且有些些結(jié)構(gòu)反應(yīng)，需要引物，并且有些些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進(jìn)行復(fù)雜的難于進(jìn)行PCR反應(yīng)的片段不能測(cè)序。反應(yīng)的片段不能測(cè)序。三、三、 第二代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)n第二代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)循環(huán)陣列合成測(cè)序法循環(huán)陣列合成測(cè)序法新一代測(cè)序技術(shù)（新一代測(cè)序技術(shù)（Next Generation Gequencing，NGS）n代表技術(shù)為代表技術(shù)為羅氏公司羅氏公司(Roche)的的454測(cè)序儀測(cè)序儀(Roche GS FLX sequencer) （2005）Illumina公司公司的的Solexa基因組分析儀基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)AB

18、I的的SOLiD測(cè)序儀測(cè)序儀(ABI SOLiD sequencer)（2007）Next-generation sequencing technology200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-Ligation1. ROCH-454的優(yōu)勢(shì)的優(yōu)勢(shì)n454平臺(tái)的突出優(yōu)勢(shì)是讀長。目前平臺(tái)的突出優(yōu)勢(shì)是讀長。目前454系統(tǒng)系統(tǒng)的序列讀長已超過的序列讀長已超過400 bp。雖然。雖然454平臺(tái)的平臺(tái)的測(cè)序成本比其他平臺(tái)要高很多，不過對(duì)于測(cè)序成本比其他平臺(tái)要高很多，不過對(duì)于那些需要長讀長

19、的應(yīng)用，如從頭拼接和環(huán)那些需要長讀長的應(yīng)用，如從頭拼接和環(huán)境微生物組學(xué)，它仍是最理想的選擇。境微生物組學(xué)，它仍是最理想的選擇。 2. Illumina GA的特性的特性1. 可擴(kuò)展的超高通量可擴(kuò)展的超高通量Genome Analyzer系統(tǒng)目前每次運(yùn)行后可獲得超過系統(tǒng)目前每次運(yùn)行后可獲得超過20 GB的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)。經(jīng)優(yōu)化后通量還有望上升到的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)。經(jīng)優(yōu)化后通量還有望上升到95 GB，相當(dāng)于人類基因組的相當(dāng)于人類基因組的30倍覆蓋度。倍覆蓋度。2. 需要樣品量少需要樣品量少Genome Analyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，能應(yīng)用在，能應(yīng)用在很多樣品有限

20、的實(shí)驗(yàn)（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。3. 簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化Genome Analyzer系統(tǒng)提供了最簡(jiǎn)單和簡(jiǎn)潔的工作流程。系統(tǒng)提供了最簡(jiǎn)單和簡(jiǎn)潔的工作流程。制備樣品文庫可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，一個(gè)星期內(nèi)就能得到制備樣品文庫可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，一個(gè)星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)。自動(dòng)化的流程不減少了手工操作誤差和高精確度的數(shù)據(jù)。自動(dòng)化的流程不減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機(jī)器人操作或潔凈室。污染可能性，也不需要機(jī)器人操作或潔凈室。3. ABI SOLID的特性的特性n無以倫比的通量無以倫比的通量 目前目前SOLiD 3系

21、統(tǒng)單次運(yùn)行能產(chǎn)生系統(tǒng)單次運(yùn)行能產(chǎn)生50 GB的人基因的人基因組序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的組序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的17倍覆蓋度，這顯倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺(tái)新一代測(cè)序系統(tǒng)都無法達(dá)到的然是其他任一臺(tái)新一代測(cè)序系統(tǒng)都無法達(dá)到的n準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性 新的超精確檢測(cè)模塊（新的超精確檢測(cè)模塊（ECC模塊）將提供高達(dá)模塊）將提供高達(dá)99.99%的精確性；多達(dá)的精確性；多達(dá)98%的可定位堿基的質(zhì)量的可定位堿基的質(zhì)量值高于值高于45；更多標(biāo)簽以提高靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍；更多標(biāo)簽以提高靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍；高準(zhǔn)確性的原始讀序，支持無參考序列的數(shù)據(jù)分高準(zhǔn)確性的原始讀序，支持無參考序列的數(shù)據(jù)分析。析。 n第二代測(cè)序技術(shù)最顯著的

22、特征是第二代測(cè)序技術(shù)最顯著的特征是高通量高通量, 一一次能對(duì)幾十萬到幾百萬條次能對(duì)幾十萬到幾百萬條 DNA 分子進(jìn)行序分子進(jìn)行序列測(cè)序列測(cè)序, 使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或基使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或基因組深度測(cè)序變得方便易行。因組深度測(cè)序變得方便易行。n共同特點(diǎn)：共同特點(diǎn)：1.成了生物醫(yī)學(xué)、計(jì)算機(jī)、微電子學(xué)、光學(xué)、成了生物醫(yī)學(xué)、計(jì)算機(jī)、微電子學(xué)、光學(xué)、材料科學(xué)和精密加工等多學(xué)科技術(shù)。例如，材料科學(xué)和精密加工等多學(xué)科技術(shù)。例如，Roche GS FLX sequencer的圖像采集技術(shù)就的圖像采集技術(shù)就借鑒現(xiàn)代天文望遠(yuǎn)鏡的光學(xué)系統(tǒng)技術(shù)，即超借鑒現(xiàn)代天文望遠(yuǎn)鏡的光學(xué)系統(tǒng)技術(shù)，即超高分辨率的高分

23、辨率的CCD集成光纖束技術(shù)。集成光纖束技術(shù)。2.測(cè)序策略主要基于循環(huán)芯片測(cè)序法（測(cè)序策略主要基于循環(huán)芯片測(cè)序法（Cyclic-array sequencing），即制備），即制備DNA文庫，單分文庫，單分子擴(kuò)增，在固相載體上形成子擴(kuò)增，在固相載體上形成DNA簇陣列，并簇陣列，并行地利用行地利用DNA聚合酶或者連接酶進(jìn)行酶促反聚合酶或者連接酶進(jìn)行酶促反應(yīng)（模板變性、引物退火雜交、延伸或連應(yīng)（模板變性、引物退火雜交、延伸或連接），同時(shí)讀取反應(yīng)產(chǎn)生的特異性熒光信號(hào)，接），同時(shí)讀取反應(yīng)產(chǎn)生的特異性熒光信號(hào)，最終得到超大量的最終得到超大量的DNA序列信息。序列信息。3.高通量并行測(cè)序。例如，高通量并行測(cè)

24、序。例如，Roche GS FLX sequencer一次就可對(duì)上百萬條一次就可對(duì)上百萬條DNA分子同時(shí)分子同時(shí)進(jìn)行序列測(cè)定，一次運(yùn)行通量達(dá)到進(jìn)行序列測(cè)定，一次運(yùn)行通量達(dá)到400Mb以以上，而傳統(tǒng)測(cè)序（一代測(cè)序）一輪測(cè)序的通上，而傳統(tǒng)測(cè)序（一代測(cè)序）一輪測(cè)序的通量?jī)H為量?jī)H為80Kb左右。左右。第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用1.從頭測(cè)序從頭測(cè)序 ( de-novo sequencing) 對(duì)于基因組未被對(duì)于基因組未被測(cè)序過的生物測(cè)序過的生物, 其基因組測(cè)序需要從頭測(cè)序。其基因組測(cè)序需要從頭測(cè)序。2.重測(cè)序重測(cè)序3.SNP （Single Nucleotide Polymorphism）

25、研究）研究4.轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 組及表達(dá)組及表達(dá) 譜分析譜分析5.RNA測(cè)序測(cè)序 ( miRNA )6.轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 （ChIP-Seq）廠商廠商RocheIlluminaABI技術(shù)技術(shù)454Solexa GASOLiD測(cè)序儀測(cè)序儀GS20FLXTiIIIIIx123序列數(shù)目（百萬）序列數(shù)目（百萬）52810025040115320單末端測(cè)序（單末端測(cè)序（Single-end）讀長（讀長（bp）1002004003550100253550運(yùn)行時(shí)間（天）運(yùn)行時(shí)間（天）335658通量（通量（Gb）0.050.10.515251416配對(duì)末端測(cè)序（配對(duì)末端

26、測(cè)序（Paired-end）讀長（讀長（bp）2004002352502100225235250庫序列長度（庫序列長度（kb）0.20.2332運(yùn)行時(shí)間（天）運(yùn)行時(shí)間（天）0.30.461010121016通量（通量（Gb）0.10.529502832SolexaSolexa和和SOLiDSOLiD配對(duì)末端測(cè)序所需時(shí)間和產(chǎn)出是單末端的兩倍，配對(duì)末端測(cè)序所需時(shí)間和產(chǎn)出是單末端的兩倍，454454的配對(duì)末端和單末端差異的配對(duì)末端和單末端差異在于建庫方法，所需時(shí)間和測(cè)序量不變。在于建庫方法，所需時(shí)間和測(cè)序量不變。ABI SOLiDABI SOLiD包含兩張芯片，這里的數(shù)據(jù)是一張芯片

27、的量。包含兩張芯片，這里的數(shù)據(jù)是一張芯片的量。 目前使用最廣泛的三大第二代測(cè)序平臺(tái)測(cè)序目前使用最廣泛的三大第二代測(cè)序平臺(tái)測(cè)序能力統(tǒng)計(jì)信息（能力統(tǒng)計(jì)信息（2010年年初數(shù)據(jù)）年年初數(shù)據(jù)）http:/3個(gè)水稻基因組個(gè)水稻基因組/天天12個(gè)水稻基因組個(gè)水稻基因組/天天10個(gè)水稻基因組個(gè)水稻基因組/天天 第二代測(cè)序技術(shù)采用了高通量測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)采用了高通量測(cè)序技術(shù)，使測(cè)序，使測(cè)序通量大大提高，從通量大大提高，從Sanger測(cè)序法一次讀取一條序列到測(cè)序法一次讀取一條序列到毛細(xì)管測(cè)序的一次讀取毛細(xì)管測(cè)序的一次讀取96條序列再到現(xiàn)在的一次讀取條序列再到現(xiàn)在的一次讀取幾百萬條序列的實(shí)現(xiàn)，不得不說這是對(duì)

28、第一代測(cè)序技幾百萬條序列的實(shí)現(xiàn)，不得不說這是對(duì)第一代測(cè)序技術(shù)的一次革命性的變革。術(shù)的一次革命性的變革。 然而第二代測(cè)序技術(shù)并不完美，由于其在測(cè)序前然而第二代測(cè)序技術(shù)并不完美，由于其在測(cè)序前要通過要通過PCR手段對(duì)待測(cè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，因此手段對(duì)待測(cè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，因此增加了測(cè)增加了測(cè)序的錯(cuò)誤率序的錯(cuò)誤率。并且其測(cè)序結(jié)果比較短，更適合重測(cè)序。并且其測(cè)序結(jié)果比較短，更適合重測(cè)序，而不太適用于沒有基因組序列的全新測(cè)序。，而不太適用于沒有基因組序列的全新測(cè)序。四、四、 第三代測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)n雖然第二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得廣泛應(yīng)用，雖然第二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得廣泛應(yīng)用，但是其必須基于但是其必須基于PCR擴(kuò)增

29、，成本、準(zhǔn)確性擴(kuò)增，成本、準(zhǔn)確性等關(guān)鍵問題仍然存在，科學(xué)家正在致力于等關(guān)鍵問題仍然存在，科學(xué)家正在致力于新的測(cè)序解決方案。目前，以新的測(cè)序解決方案。目前，以單分子測(cè)序單分子測(cè)序?yàn)橹饕卣鞯牡谌鷾y(cè)序技術(shù)，也稱為為主要特征的第三代測(cè)序技術(shù)，也稱為next-next-generation sequencing已經(jīng)初現(xiàn)端已經(jīng)初現(xiàn)端 倪倪 。n生物科學(xué)公司生物科學(xué)公司BioScience Corporation的的HeliScope單分子測(cè)序技術(shù)單分子測(cè)序技術(shù) （2008）斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最 近利用近利用 Heliscope單分子測(cè)序儀單分子測(cè)序儀, 用了用了 48000 美元的

30、試劑和美元的試劑和 4 個(gè)星期的時(shí)間個(gè)星期的時(shí)間, 對(duì)一名白人對(duì)一名白人男子的基因組進(jìn)行了測(cè)序。男子的基因組進(jìn)行了測(cè)序。n太平洋生物科學(xué)公司太平洋生物科學(xué)公司PacBio的的SMRT（single cell real time）技術(shù)）技術(shù)目標(biāo)：目標(biāo)：1000美元測(cè)定一個(gè)人類基因組美元測(cè)定一個(gè)人類基因組n牛津納米孔技術(shù)公司牛津納米孔技術(shù)公司Oxford Nanopore technologies的蛋白的蛋白納米孔納米孔測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù) （流行趨勢(shì)流行趨勢(shì)）nPacific Biosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔納米的納米孔zero-mode wav

31、eguides (ZMWs)，單分子的單分子的DNA聚合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么聚合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非常快速地從外面進(jìn)入到孔內(nèi)又出去，脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)。而當(dāng)某一它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這鏈時(shí)，這種特定顏色的熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間，直到新的種特定顏色的熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間，直

32、到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止。聚合酶切除為止。n新型新型納米孔測(cè)序法納米孔測(cè)序法（nanopore sequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測(cè)序的。由于納米逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測(cè)序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方物通過，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方 法來進(jìn)行高通量檢測(cè)。法來進(jìn)行高通量檢測(cè)。納米孔測(cè)序技術(shù)納米孔測(cè)序技術(shù)鏈測(cè)序鏈測(cè)序(strand sequencing) nOxford Nanop

33、ore Technologies與牛津大學(xué)合作與牛津大學(xué)合作, 已設(shè)計(jì)另外一種基因工程蛋白質(zhì)納米孔已設(shè)計(jì)另外一種基因工程蛋白質(zhì)納米孔. 通過遺通過遺傳工程改造傳工程改造, 他們已經(jīng)可以構(gòu)建一種將氨基化環(huán)他們已經(jīng)可以構(gòu)建一種將氨基化環(huán)糊精糊精(Aminocyclodextrin)配體共價(jià)連接到位于脂配體共價(jià)連接到位于脂雙層膜中的雙層膜中的-溶血蛋白內(nèi)生物納米孔。溶血蛋白內(nèi)生物納米孔。n驅(qū)動(dòng)驅(qū)動(dòng)4種核苷酸單磷酸種核苷酸單磷酸(dNMPs)通過生物孔通過生物孔, 通過通過納米孔的電流將分別減少到納米孔的電流將分別減少到4種不同的狀態(tài)種不同的狀態(tài), 每種每種狀態(tài)都與一種核苷酸單磷酸相對(duì)應(yīng)。狀態(tài)都與一種

34、核苷酸單磷酸相對(duì)應(yīng)。n核酸外切酶將核酸外切酶將DNA鏈切成鏈切成單個(gè)核苷酸單個(gè)核苷酸。GridION（2011）MinION （2012）即插即用、一次性）即插即用、一次性英國英國Oxford Nanopore Technologies公司公司2012年年2月的發(fā)布了一款便月的發(fā)布了一款便攜式的基因組測(cè)序儀攜式的基因組測(cè)序儀MinION，約摸只有，約摸只有U盤大小，價(jià)格低于盤大小，價(jià)格低于900美美元，立即引發(fā)市場(chǎng)轟動(dòng)。元，立即引發(fā)市場(chǎng)轟動(dòng)。https:/ X Ten測(cè)序儀測(cè)序儀 nHiSeq X Ten是是Illumina于于2014年推出的最新測(cè)序系統(tǒng)，年推出的最新測(cè)序系統(tǒng)，其功能定位為工

35、廠規(guī)模的測(cè)其功能定位為工廠規(guī)模的測(cè)序系統(tǒng)。序系統(tǒng)。nHiSeq X Ten系統(tǒng)，全球首系統(tǒng)，全球首臺(tái)也是唯一一臺(tái)可以臺(tái)也是唯一一臺(tái)可以1000美美元完成人類基因組元完成人類基因組30X測(cè)序測(cè)序深度的系統(tǒng)。深度的系統(tǒng)。nHiSeq X Ten系統(tǒng)由系統(tǒng)由10臺(tái)以臺(tái)以上的上的HiSeq X組成。組成。HiSeq X Ten測(cè)序儀測(cè)序儀功能強(qiáng)大功能強(qiáng)大價(jià)格昂貴價(jià)格昂貴新一代基因組測(cè)序技術(shù)成本下降走勢(shì)圖新一代基因組測(cè)序技術(shù)成本下降走勢(shì)圖第三代測(cè)序技術(shù)優(yōu)點(diǎn)第三代測(cè)序技術(shù)優(yōu)點(diǎn)1.它實(shí)現(xiàn)了它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)秒可以測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的

36、個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的2萬倍。萬倍。2.它實(shí)現(xiàn)了它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很聚合酶一次可以合成很長的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長的序列。長的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長的序列。 這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。件。3.它的精度非常高，達(dá)到它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。4.直接測(cè)直接測(cè)RNA的序列（類似的序列（類似RT-PCR）5.直接測(cè)甲基化的直接測(cè)甲基化的DNA序列：正常的序列：正常的C或者或者甲基化的甲基化的C為模板

37、，為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的模板的C是否甲基化。是否甲基化。 測(cè)序技術(shù)發(fā)展測(cè)序技術(shù)發(fā)展n便捷；便捷；n低廉；低廉；免費(fèi)？免費(fèi)？n應(yīng)用應(yīng)用：疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)：（患上各種疾病的幾率，以及疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)：（患上各種疾病的幾率，以及您的性狀如體育能力您的性狀如體育能力）癌癥篩查！精確治療！癌癥篩查！精確治療！祖先分析：（性狀從哪里繼承的祖先分析：（性狀從哪里繼承的?）其它：你喝酒會(huì)不會(huì)臉紅？你會(huì)不會(huì)禿其它：你喝酒會(huì)不會(huì)臉紅？你會(huì)不會(huì)禿頂？頂？23andMe公司公司n20萬年前：智人在地球上行走。萬年前：智人在地球上行走。n17萬萬5千年前：現(xiàn)代人類的祖先誕生在非洲