1、蛋白質(zhì)相互作用的研究方法 摘要 過(guò)去15年來(lái),蛋白質(zhì)組學(xué)得到迅速發(fā)展,蛋白質(zhì)間的相互作用作為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要內(nèi)容,更是成為國(guó)內(nèi)外競(jìng)相研究的重點(diǎn),研究方法的快速發(fā)展為蛋白質(zhì)間相互作用的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本文綜述了當(dāng)前研究蛋白質(zhì)相互作用的主要技術(shù)方法，包括酵母雙雜交技術(shù)，GST pull-down技術(shù)，免疫共沉淀技術(shù)和串聯(lián)親和純化技術(shù)等多種研究方法，總結(jié)了各種研究方法的原理及應(yīng)用。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)，相互作用，研究方法1 酵母雙雜交技術(shù)(two hybrid system)1.1基本原理 真核生物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子一般都含有2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain, B

2、D)和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription activation domain, AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互獨(dú)立但功能上又相互依賴,它們之間只有通過(guò)某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的活性。將擬研究的編碼“獵物”蛋白的基因與AD序列結(jié)合,編碼“誘餌”蛋白的基因與BD序列結(jié)合,形成兩段融合基因,并在同一菌株核內(nèi)表達(dá),若“誘餌”蛋白與“獵物”蛋白在核內(nèi)存在相互作用,就可以重新形成完整的有活性的轉(zhuǎn)錄因子,從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)與否,即可判斷“誘餌”蛋白與“獵物”蛋白之間是否具有相互作用。1.2應(yīng)用 Hurst等利用酵母雙雜交的方法研究與乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1（

3、BRMS1）的相互作用蛋白，得到此蛋白為Hsp90伴侶蛋白。Reddi等利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究肝炎B病毒反式作用因子HBx蛋白的自我偶聯(lián)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBx蛋白在分子環(huán)境中可以通過(guò)其碳末端區(qū)域產(chǎn)生自我偶聯(lián)作用。酵母雙雜交技術(shù)也應(yīng)用于大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究，Lim等人利用此技術(shù)鑒定了770多個(gè)可能相互作用的蛋白，有75對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用，其中有83%相互作用的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到驗(yàn)證。1.3優(yōu)點(diǎn) 在檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用方面，酵母雙雜交系統(tǒng)具有非常高的靈敏度，尤其對(duì)蛋白質(zhì)間微弱的、瞬間的作用也能夠通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)到。酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用是基于酵母細(xì)胞內(nèi)

4、的試驗(yàn)，不需要經(jīng)過(guò)提純蛋白來(lái)研究蛋白的相互作用，避免了提純過(guò)程引起的蛋白變性，因而研究的是有生物活性的蛋白-蛋白相互作用，反映體內(nèi)的真實(shí)的相互作用情況。1.4缺點(diǎn) （1）對(duì)相互作用蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位要求嚴(yán)格，酵母雙雜交不能檢測(cè)定位于胞漿內(nèi)、細(xì)胞膜和通過(guò)分泌泡分泌到細(xì)胞外的蛋白而且融合表達(dá)可能會(huì)影響目的蛋白修飾和折疊，尤其在研究異源蛋白相互作用時(shí)，蛋白不一定能正確修飾和折疊，從而影響蛋白的活性。（2）由于某些蛋白質(zhì)本身具有轉(zhuǎn)錄激活功，使"獵物"蛋白AD融合基因與“誘餌”蛋白BD融合基因表達(dá)產(chǎn)物無(wú)需特異結(jié)合就能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。（3）DBD-X和AD-Y不是通過(guò)

5、DBD-X-Y-AD直接激活轉(zhuǎn)錄，而是通過(guò)第3種蛋白或多蛋白的復(fù)合體把X、Y募集到一起，激活轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。解決方法：Kim等設(shè)計(jì)了一種新的酵母遺傳篩選方法一加二雜交系統(tǒng)（one plus two hybrid system），這個(gè)系統(tǒng)可以高效率地篩選特異干擾已知相互作用蛋白的無(wú)義突變，這種系統(tǒng)允許在同一細(xì)胞中存在雙重報(bào)告系統(tǒng)。分裂-泛素膜酵母雙雜交系統(tǒng)。主要是用于檢測(cè)膜蛋白的相互作用。Vidalain等為了解決高通量酵母雙雜交技術(shù)的假陽(yáng)性問(wèn)題，主要是通過(guò)陽(yáng)性酵母細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)消除污染獵物質(zhì)粒的影響。2 免疫共沉淀技術(shù)(coimmunoprecipitation)2.1基本原理 細(xì)胞

6、裂解物中加入抗體,與抗原形成特異免疫復(fù)合物,經(jīng)過(guò)洗脫,收集免疫復(fù)合物,然后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting分析.如果蛋白質(zhì)X用其抗體免疫沉淀，則在細(xì)胞內(nèi)與X穩(wěn)定結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。蛋白質(zhì)Y的沉淀是基于與X的物理性相互作用，被稱為免疫共沉淀。2.2應(yīng)用 用于確定生理?xiàng)l件下目的蛋白在細(xì)胞或組織內(nèi)是否存在與其相互作用的蛋白質(zhì)；用于驗(yàn)證兩個(gè)已知相互作用的蛋白質(zhì)。Operana等利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證UGT1A蛋白質(zhì)之間的相互作用，證實(shí)了每個(gè)UGT1A蛋白都可以潛在的形成同型二聚體。免疫共沉淀技術(shù)結(jié)果還表明UGT1A可以與所有的UGT1A蛋白形成異型二聚體，確證了在活細(xì)胞中

7、利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)得到的結(jié)果。Walker等利用免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)死亡蛋白和p53蛋白形成的復(fù)合物存在于白血病的血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中而不存在于正常血細(xì)胞中。2.3優(yōu)點(diǎn):(1)與蛋白親和層析一樣,檢測(cè)的產(chǎn)物是粗提物;(2)抗原與相互作用蛋白以細(xì)胞中相類似的濃度存在,避免了過(guò)量表達(dá)測(cè)試蛋白所造成的人為效應(yīng);(3)蛋白以翻譯后被修飾的天然狀態(tài)存在;(4)復(fù)合物以天然狀態(tài)存在。2.4缺點(diǎn)：免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白,而是通過(guò)第三者間接相互作用的蛋白.另外,其靈敏度不及蛋白親和層析高,因?yàn)楦信d趣蛋白濃度不如后者高,這樣驅(qū)動(dòng)復(fù)合物形成的能力小。2.5驗(yàn)證免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)

8、性：（1）抗原的沉淀是由本身抗體的結(jié)合引起的，單克隆抗體不存在此問(wèn)題，故建議使用單克隆抗體。（2）確保抗體的特異性，就是在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中加入抗體也不會(huì)出現(xiàn)共沉淀現(xiàn)象。（3）相互作用是真實(shí)的體內(nèi)過(guò)程，而不是細(xì)胞裂解的結(jié)果。3噬菌體展示技術(shù)(phage display approach)3.1基本原理 噬菌體展示技術(shù)是將編碼目的蛋白的基因與編碼噬菌體表面蛋白的基因融合后,以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面的一種技術(shù)。將不同蛋白的cDNA插入噬菌體載體進(jìn)行表達(dá),得到表達(dá)不同蛋白的一定規(guī)模的噬菌體展示庫(kù)。將“誘餌”蛋白固定化,基于“誘餌”蛋白與“獵物”蛋白之間的相互作用,可將展示庫(kù)中與固定化的

9、“誘餌”蛋白有相互作用的“獵物”蛋白分離純化出來(lái),再對(duì)“獵物”蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。3.2應(yīng)用 噬菌體展示技術(shù)常用于構(gòu)建隨機(jī)肽庫(kù)、抗體庫(kù)和蛋白質(zhì)庫(kù),研究受體或抗體的結(jié)合蛋白及相互作用位點(diǎn),改造和提高蛋白質(zhì)、酶及抗體的生物學(xué)和免疫學(xué)屬性等。Li等用噬菌體抗體庫(kù)篩得SARS病毒的單克隆抗體,同時(shí)發(fā)現(xiàn)SARS病毒S1區(qū)域的血管緊張肽轉(zhuǎn)移酶的結(jié)合位點(diǎn)可作為藥物治療SARS的一個(gè)新靶點(diǎn)。3.3優(yōu)點(diǎn) (1)可以直接得到基因;(2)高選擇性地篩選復(fù)雜混合物(達(dá)1091010);(3)在淘篩過(guò)程中,通過(guò)改變洗脫條件,可以直接評(píng)價(jià)結(jié)合的特異性.3.4缺點(diǎn) (1)噬菌體文庫(kù)中插入的DNA片段大小有所限制;(2)用細(xì)菌

10、作宿主,有可能使有些蛋白不能象天然狀態(tài)那樣正確折疊或修飾;(3)噬菌體文庫(kù)中編碼蛋白均為融合蛋白,可能改變天然蛋白的結(jié)構(gòu)及功能;(4)在體外檢測(cè)相互作用,可能與天然狀態(tài)不符.4 GST pull-down技術(shù)4.1基本原理 體內(nèi)穩(wěn)定復(fù)合物中相互作用蛋白質(zhì)的鑒定依賴于基于親和力的操作。該技術(shù)是通過(guò)以適當(dāng)標(biāo)簽和目的基因進(jìn)行融合表達(dá)作為誘餌，從細(xì)胞提取物中釣出與目的蛋白相互作用的蛋白。多組分蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離主要利用固定在瓊脂糖樹(shù)脂的反標(biāo)簽系統(tǒng)完成（表1）。表1多組分蛋白質(zhì)復(fù)合物分離常用的親和標(biāo)簽和配位體4.2應(yīng)用 一般來(lái)說(shuō)，GST融合蛋白pull-down方法用于兩個(gè)方面：（1）鑒定能與已知融合蛋

11、白質(zhì)相互作用的未知蛋白質(zhì)；（2）鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-transferase，GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。從此，GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到了極大的推廣。GST融合蛋白pull-down方法是將誘餌蛋白質(zhì)和GST標(biāo)簽融合表達(dá)，一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行孵育，利用谷胱甘肽-Sepharose將GST-融合蛋白-目的蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后進(jìn)行聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。該方法比較簡(jiǎn)便，避免了使用同位素等危險(xiǎn)物質(zhì)，在蛋

12、白質(zhì)相互作用研究中有很廣泛的應(yīng)用。此外，還有很多其它常用的蛋白標(biāo)簽，如與葡萄球菌蛋白A融合的誘餌蛋白可以通過(guò)固定有IgG的親和柱進(jìn)行純化；與寡聚組氨酸肽段融合的誘餌蛋白可以通過(guò)結(jié)合Ni2+的色譜柱進(jìn)行純化。Huang等通過(guò)構(gòu)建GST-p16INK4a融合質(zhì)粒，鑒定了ISOC2是與p16INK4a相互作用的新蛋白質(zhì)。Xiao等利用His標(biāo)簽研究PICK1中PDZ和BAR兩結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。4.3特點(diǎn) 融合蛋白親具有高通量性、高選擇性的特點(diǎn)，由于融合蛋白的多樣性以及表達(dá)系統(tǒng)的多樣性（如細(xì)菌、果蠅、哺乳動(dòng)物），該方法能夠研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中的相互作用。但該方法的成功應(yīng)用取決于是否能夠得到足夠多

13、，并且保持蛋白質(zhì)活性的重組融合蛋白，以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白的干擾。5串聯(lián)親和純化技術(shù)(tandem affinity purification, TAP)5.1基本原理 1999年Rigaut等人共同提出了一套分離復(fù)合蛋白的新方法串聯(lián)親和純化(Tandem affinity puri-fication,TAP),兼具標(biāo)準(zhǔn)親和純化和免疫共沉淀兩種生化方法的優(yōu)點(diǎn),為蛋白質(zhì)復(fù)合體的分離鑒定提供了一條新路徑。串聯(lián)親和純化技術(shù)首先需通過(guò)基因工程給被分離純化蛋白的一端加一個(gè)TAP標(biāo)簽,該標(biāo)簽由IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ProtA)及一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(CBP)組成,結(jié)構(gòu)域與多肽之間由一個(gè)TEV蛋白酶切位點(diǎn)隔

14、開(kāi)。通過(guò)基因重組將細(xì)胞內(nèi)源性的目標(biāo)蛋白基因置換為帶有TAP標(biāo)簽的基因,溫和裂解細(xì)胞,獲取細(xì)胞抽提物,將抽提物加入IgG親和柱,TAP標(biāo)簽的ProtA端會(huì)與IgG形成強(qiáng)結(jié)合,在用洗脫液洗脫掉大部分非特異性結(jié)合物和雜蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脫夜將蛋白質(zhì)復(fù)合體切割下來(lái)。在鈣離子參與下,被切割下來(lái)帶有CBP的蛋白質(zhì)復(fù)合體與鈣調(diào)蛋白緊密結(jié)合,充分洗脫,就可以進(jìn)一步去除非特異作用的蛋白質(zhì)雜質(zhì),最后純化出高純度的目的蛋白復(fù)合體。5.2應(yīng)用 目前TAP技術(shù)已經(jīng)成為快速純化蛋白質(zhì)復(fù)合物及其相關(guān)蛋白質(zhì)的有效方法。如Gavin等運(yùn)用TAP技術(shù)標(biāo)記了1739個(gè)酵母細(xì)胞并純化得到589個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物,并對(duì)其中的

15、232個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用這種技術(shù)鑒定得到的蛋白質(zhì)相互作用在靈敏度、特異性和可靠性等方面都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了酵母雙雜交等研究蛋白質(zhì)相互作用的傳統(tǒng)技術(shù),且這種技術(shù)還能展示出細(xì)胞中的蛋白質(zhì)復(fù)合物組分的動(dòng)態(tài)變化。TAP技術(shù)特別適用于研究自然條件下的蛋白質(zhì)相互作用,已能夠?qū)Υ竽c桿菌、酵母細(xì)胞中蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行大規(guī)模地研究。5.3優(yōu)點(diǎn) 利用酶切的方法進(jìn)行洗脫,條件溫和,不破壞復(fù)合物的結(jié)構(gòu),去除了雜蛋白的干擾,使蛋白質(zhì)相互作用的研究結(jié)果準(zhǔn)確性更高。5.4缺點(diǎn) 由于在高等真核細(xì)胞中難以進(jìn)行原位蛋白標(biāo)記,以及存在內(nèi)源表達(dá)的蛋白質(zhì)干擾,和蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控機(jī)制的不同等因素,使得該技術(shù)在高等真核細(xì)胞中

16、的應(yīng)用受到限制。解決方法 Foler等將TAP技術(shù)與RNAi(RNA interference,干擾RNA)技術(shù)聯(lián)用( iTAP技術(shù)),發(fā)現(xiàn)可以很大程度上降低上述問(wèn)題的影響,并已使TAP技術(shù)在果蠅的S2細(xì)胞中得到了成功應(yīng)用。6其他技術(shù)除以上介紹的方法外，還有其它研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，比如基于生物信息學(xué)的分析方法，化學(xué)交聯(lián)技術(shù)，蛋白質(zhì)微陣列等方法。6.1熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer, FRET)熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí),當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài),在該電子回到基態(tài)前,通過(guò)偶

17、極子相互作用,實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移,即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移。如要研究?jī)煞N蛋白質(zhì)A和B間的相互作用,可以構(gòu)建CFP-蛋白質(zhì)A-YFP-蛋白質(zhì)B這種融合蛋白,用CFP吸收波長(zhǎng)433 nm作為激發(fā)波長(zhǎng),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A與B沒(méi)有發(fā)生相互作用時(shí),CFP與YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,因而檢測(cè)到的是發(fā)射波長(zhǎng)為475 nm的CFP熒光;但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A與B發(fā)生相互作用時(shí),CFP與YFP可充分靠近(小于10 nm),可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,此時(shí)檢測(cè)到的就是發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm的YFP熒光。若將編碼這種融合蛋白的基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),則可以在體無(wú)損研究蛋白質(zhì)間的相互作用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技

18、術(shù)常用于檢測(cè)蛋白質(zhì)間的相互作用以及作用時(shí)蛋白質(zhì)復(fù)合物的構(gòu)像變化,從而確定作用模式,通過(guò)在體無(wú)損成像描述細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用。6.2表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)它是一種物理光學(xué)現(xiàn)象,當(dāng)一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍?cè)诓ＡП砻娴谋咏饘倌ど习l(fā)生全反射時(shí),若入射光的波向量與金屬膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率相一致,光線即被耦合入金屬膜引發(fā)電子共振,即表面等離子共振。它的原理是利用一種納米級(jí)的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當(dāng)待測(cè)蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后，薄膜的共振性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，通過(guò)檢測(cè)便可知這兩種蛋白的結(jié)合情況。SPR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需標(biāo)記物或染料，反應(yīng)過(guò)程可

19、實(shí)時(shí)監(jiān)控。測(cè)定快速且安全，還可用于檢測(cè)蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。6.3原子作用力顯微技術(shù)(atom ic forcem icroscopy, AFM ) AFM通過(guò)力掃描方式,以單分子水平的高分辨率測(cè)量蛋白質(zhì)間的相互作用力。如在配體-受體間相互作用力的研究中,配體被固定于AFM的彈性懸臂表面,受體被固定于適當(dāng)?shù)幕妆砻?在懸臂接近和離開(kāi)基底的過(guò)程中,通過(guò)懸臂的偏折便可測(cè)得配體-受體間的作用力。該技術(shù)常用于直接檢測(cè)蛋白復(fù)合物解體期間的動(dòng)力強(qiáng)度及自由能變化。Yuan等用該技術(shù)測(cè)得鏈霉抗生物素蛋白與生物素之間的結(jié)合力在115170 pN之間。原子作用力顯微技術(shù)能直接有效地檢測(cè)在外力作

20、用下,蛋白質(zhì)分子機(jī)械性質(zhì)的改變。由于該技術(shù)常受到非特異結(jié)合力的干擾,導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。6.4抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)作為規(guī)?；δ艿鞍踪|(zhì)組學(xué)研究的手段的蛋白質(zhì)芯片技術(shù),是DNA芯片技術(shù)的擴(kuò)展,即在固體支持物表面高密度地固定化排列探針蛋白點(diǎn)陣,以特異地捕獲樣品中的靶蛋白,然后通過(guò)檢測(cè)器對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性或定量分析。蛋白質(zhì)芯片能夠同時(shí)高效地分析上千種蛋白質(zhì)間的相互作用,也使得在全基因組水平研究蛋白質(zhì)的功能(如酶活性、抗體特異性配體、受體交互作用)成為可能。6.5雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)( bimolecularfluorescence complementation, BIFC) 利用GFP熒光蛋白家族的報(bào)告

21、基因特性、循環(huán)排列的特殊分子結(jié)構(gòu)性質(zhì),在環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特異位點(diǎn)將熒光蛋白基因切成N端和C端兩段不具有熒光活性的片段后,分別與待測(cè)蛋白基因連接,構(gòu)建重組基因,在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中融合表達(dá).若表達(dá)的2個(gè)蛋白質(zhì)間存在相互作用,熒光蛋白的2個(gè)片段就能夠相互靠近,形成熒光蛋白生色團(tuán)重新發(fā)出熒光。6.6寡沉淀(oligoprecipitation) 該方法以雙鏈寡核苷酸替代免疫共沉淀的含蛋白標(biāo)簽的特異性抗體.首先,合成1條保守結(jié)合序列與激活轉(zhuǎn)錄因子的DNA保守結(jié)合序列相同的雙鏈寡核苷酸,再利用固定化雙鏈寡核苷酸的色譜柱來(lái)結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子,捕獲與處于活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用白質(zhì),在去除與寡核苷酸鏈非特異性結(jié)合的蛋白

22、后,即可洗脫獲得活性轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)復(fù)合體(Fig.1)直接研究具有活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體,避免了非活性時(shí)結(jié)合蛋白質(zhì)的干擾,也可應(yīng)用于能夠被小分子、肽等物質(zhì)激活的蛋白質(zhì)相互作用的研究。6.7減量式定量免疫沉淀(quantitativeimmunoprecipitation combined withknockdown, QUICK) 利用輕、重穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中氨基酸(如賴氨酸、精氨酸),分別供給2組靶蛋白表達(dá)細(xì)胞代謝生長(zhǎng),采用RNA干擾技術(shù)降低其中1組細(xì)胞的靶蛋白表達(dá)量,利用免疫共沉淀方法分別從2組細(xì)胞中獲得與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體,混合2組復(fù)合體,進(jìn)行定量質(zhì)譜分析.由于其中1組細(xì)胞靶

23、蛋白量的減少,導(dǎo)致與其真實(shí)相互作用形成的復(fù)合體量也相應(yīng)降低,在質(zhì)譜圖上應(yīng)表現(xiàn)為非等量的相鄰峰,而等量的相鄰峰則代表了分離純化時(shí)與抗體或基質(zhì)結(jié)合的非特異性相互作用蛋白質(zhì)(Fig.2).該方法最大的優(yōu)勢(shì)在于排除了這些非特異性蛋白對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合體鑒定的干擾.7 展望現(xiàn)如今, 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，出現(xiàn)大量的蛋白質(zhì)間相互作用的研究方法。各種各樣的研究方法都存在著一定的優(yōu)缺點(diǎn)，如何取長(zhǎng)補(bǔ)短，如何將各種技術(shù)融合交叉，將會(huì)是蛋白質(zhì)相互作用研究的主要特點(diǎn)，蛋白質(zhì)相互作用研究將得到進(jìn)一步的良好發(fā)展。參考文獻(xiàn)1 賀福初,等.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,傅玉祥, 2004, 250-251.孫宇,賈凌

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