1、核醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)第六章第六章 體外標(biāo)記免疫分析體外標(biāo)記免疫分析體外標(biāo)記在核醫(yī)學(xué)中的地位 體內(nèi)診斷：體內(nèi)診斷：臟器顯像臟器顯像 功能測(cè)定功能測(cè)定 診斷診斷 體外診斷：體外診斷：放射分析放射分析 臨床核醫(yī)學(xué)臨床核醫(yī)學(xué) 治療：治療：131131I I治療甲亢治療甲亢核醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué) 實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)：實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)：利用核技術(shù)探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)和物利用核技術(shù)探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)和物 質(zhì)變化規(guī)律質(zhì)變化規(guī)律體外標(biāo)記免疫分析體外標(biāo)記免疫分析是一門(mén)綜合性學(xué)科，也是一門(mén)邊緣學(xué)科。是集基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)及臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科。在當(dāng)前的各種免疫診斷技術(shù)中，標(biāo)記免疫分析是最活躍、發(fā)展最快的一個(gè)領(lǐng)域。體外標(biāo)記免疫分析概念：概念： 是利用

2、放射分析方法或其派生的相關(guān)非放射分析技術(shù)測(cè)定生物樣品中微量生物活性物質(zhì)含量的一類(lèi)分析方法。體外標(biāo)記免疫分析特點(diǎn)：特點(diǎn)： 利用抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特異性，加上各種標(biāo)記物（標(biāo)記抗原或抗體）的可測(cè)量性來(lái)達(dá)到方便敏感地檢測(cè)各種體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)，包括內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、腫瘤標(biāo)志物、血藥濃度等。體外標(biāo)記免疫分析鼻祖: (Yalow,July 19, 1921 (Yalow,July 19, 1921 ) ) 美國(guó)科學(xué)家美國(guó)科學(xué)家YalowYalow和和BersonBerson。于于19561956年創(chuàng)建的年創(chuàng)建的放射免疫分析放射免疫分析(RIA)(RI

3、A)，測(cè)定人血漿胰島素，測(cè)定人血漿胰島素獲得成功。獲得成功。樹(shù)立了超微量物質(zhì)體外標(biāo)記免疫分析的里程碑。樹(shù)立了超微量物質(zhì)體外標(biāo)記免疫分析的里程碑。 19681968年，年，MilesMiles和和HalesHales建立了建立了免疫放射分析免疫放射分析(IRMA)(IRMA)。體外標(biāo)記免疫分析獲獎(jiǎng)獲獎(jiǎng): : 在在19771977年年YalowYalow和和BersonBerson因創(chuàng)建了放射免疫因創(chuàng)建了放射免疫分析，使微量物質(zhì)的測(cè)定成為可能，而榮獲諾貝分析，使微量物質(zhì)的測(cè)定成為可能，而榮獲諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 。體外標(biāo)記免疫分析v貢獻(xiàn)貢獻(xiàn): : 隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，在RIA標(biāo)記

4、抗原競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合、IRMA標(biāo)記抗體非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的理論基礎(chǔ)上，相繼派生出許多其它的標(biāo)記免疫分析方法，如酶標(biāo)記免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光免疫分析等多種形式、多種反應(yīng)模式的綜合性標(biāo)記免疫分析體系，并廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、教學(xué)及科研諸多領(lǐng)域，有力地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展。體外標(biāo)記免疫分析發(fā)展發(fā)展: : 電化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析 時(shí)間分辨熒光免疫分析 酶標(biāo)記免疫分析 放射受體分析放射受體分析 免疫放射分析免疫放射分析 放射免疫分析放射免疫分析體外標(biāo)記免疫分析競(jìng)爭(zhēng)放射結(jié)合分析：競(jìng)爭(zhēng)放射結(jié)合分析：標(biāo)記抗原，抗體限量標(biāo)記抗原，抗體限量非

5、競(jìng)爭(zhēng)放射結(jié)合分析：非競(jìng)爭(zhēng)放射結(jié)合分析：標(biāo)記抗體，抗體過(guò)量標(biāo)記抗體，抗體過(guò)量分分 類(lèi)類(lèi)第一節(jié)體外標(biāo)記免疫分析的基本原理第一節(jié)體外標(biāo)記免疫分析的基本原理體外標(biāo)記免疫分析基本原理:非競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性(標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體)IRMA體體外外標(biāo)標(biāo)記記免免疫疫分分析析競(jìng)爭(zhēng)性競(jìng)爭(zhēng)性(標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原)RIA放射免疫分析（RIA）原理v放射免疫技術(shù)是標(biāo)記抗原與未標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)有限量放射免疫技術(shù)是標(biāo)記抗原與未標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)有限量的抗體，然后通過(guò)測(cè)定標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中放的抗體，然后通過(guò)測(cè)定標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中放射性強(qiáng)度的改變，測(cè)定出未標(biāo)記抗原量。射性強(qiáng)度的改變，測(cè)定出未標(biāo)記抗原量。放射免疫分析（RIA）原理 AgAg 待測(cè)抗

6、原待測(cè)抗原 + + * *Ag + Ab Ag + Ab * *AgAb + AgAb + * *Ag Ag ( (標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原) () (特異性抗體特異性抗體) () (標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物) () (游離的標(biāo)記抗原游離的標(biāo)記抗原) ) AgAb + Ag AgAb + Ag 抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物放射免疫分析（放射免疫分析（RIA）原理）原理標(biāo)記抗原(*Ag)和非標(biāo)記原(Ag)與限量抗體(Ab)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。*Ag和Ag具有相同的與 Ab結(jié)合的能力RIA(RIA(競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)) )原理示意圖原理示意圖AgAg*AbCFAg*BFB/F. *Ag:定量、足量

7、定量、足量 . Ab:限量、特異限量、特異. *Ag和和Ag具有相同的免疫活性具有相同的免疫活性. Ag+ *AgAb的有效結(jié)合位點(diǎn)的有效結(jié)合位點(diǎn). *Ag和和Ag通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)的方式與通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)的方式與Ab結(jié)合，隨著結(jié)合，隨著Ag增加，增加， *Ag與與Ab結(jié)合結(jié)合形成的形成的*AgAb復(fù)合物的量減少?gòu)?fù)合物的量減少放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）實(shí)驗(yàn)操作步驟：實(shí)驗(yàn)操作步驟：加樣（加樣（AgAg，* *AgAg，Ab) Ab) 混勻，溫育（反應(yīng)達(dá)到平混勻，溫育（反應(yīng)達(dá)到平衡）衡）分離分離測(cè)量測(cè)量數(shù)據(jù)處理，質(zhì)量控制數(shù)據(jù)處理，質(zhì)量控制測(cè)量測(cè)量復(fù)合物計(jì)數(shù)示意圖：測(cè)量復(fù)合物計(jì)數(shù)示意圖： 光子光子(

8、(射線能射線能) )與閃爍體的作用與閃爍體的作用 閃爍體閃爍體( (光脈沖、光能光脈沖、光能) ) 光電倍增管光電倍增管( (電能電能) ) 前置放大器前置放大器( (電脈沖電脈沖) ) 電子探測(cè)儀電子探測(cè)儀 （計(jì)數(shù)單位是探測(cè)器輸出的電脈沖數(shù)，（計(jì)數(shù)單位是探測(cè)器輸出的電脈沖數(shù)，CPMCPM或或CPSCPS）RIA(RIA(競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合) )標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線依所測(cè)得的復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)依所測(cè)得的復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)(CPM)，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線，求知待測(cè)品的含量，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線，求知待測(cè)品的含量免疫放射分析(IRMA)原理單位點(diǎn)：?jiǎn)挝稽c(diǎn)： Ag + Ag +

9、 * *Ab Ab (Ag- (Ag-* *Ab) + Ab) + * *AbAb 抗原（待測(cè)）抗原（待測(cè)） 標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體 抗原標(biāo)記抗體復(fù)合物抗原標(biāo)記抗體復(fù)合物雙位點(diǎn)：雙位點(diǎn)： Ad-Ag + Ad-Ag + * *Ab Ab Ad-Ag- Ad-Ag-* *AbAb 固體抗體固體抗體- -抗原（待測(cè)）抗原（待測(cè)） 標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體 固體抗體固體抗體- -抗原抗原- -標(biāo)記抗體復(fù)合物標(biāo)記抗體復(fù)合物IRMA(非竟?fàn)幗Y(jié)合)反應(yīng)原理IRMA(非竟?fàn)幗Y(jié)合)劑量反應(yīng)曲線RIA RIA IRMA IRMA 的區(qū)別的區(qū)別方法方法RIARIAIRMAIRMA1.1.標(biāo)記標(biāo)記* *AgAg* *AbAb2.

10、2.免疫反應(yīng)式免疫反應(yīng)式Ag+Ag+* *Ag+Ab Ag+Ab * *Ag-Ab+AgAg-Ab+AgAg+Ag+* *Ab Ab A Ag-g-* *Ab+Ab+* *AbAb3.Ab3.Ab限量限量過(guò)量過(guò)量4.4.競(jìng)爭(zhēng)競(jìng)爭(zhēng)競(jìng)爭(zhēng)競(jìng)爭(zhēng)非競(jìng)爭(zhēng)非競(jìng)爭(zhēng)5.5.測(cè)量復(fù)合物測(cè)量復(fù)合物* *Ag-AbAg-AbAg-Ag-* *AbAb6.6.測(cè)量物計(jì)數(shù)值與標(biāo)本含量測(cè)量物計(jì)數(shù)值與標(biāo)本含量呈反比呈反比呈正比呈正比7.7.標(biāo)準(zhǔn)曲線形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線形態(tài)8.8.靈敏度靈敏度較低較低高高9.9.測(cè)量范圍測(cè)量范圍較窄較窄較寬較寬第二節(jié) 體外標(biāo)記免疫分析的基本試劑和基本技術(shù)基本試劑和基本技術(shù)基本試劑和基本技術(shù). . 標(biāo)準(zhǔn)

11、品、質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品. . 特異性抗體特異性抗體. . 示蹤劑示蹤劑( (標(biāo)記品標(biāo)記品) ). . 分離技術(shù)分離技術(shù) . . 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品 (1) (1)化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)構(gòu): : 應(yīng)與待測(cè)物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)應(yīng)與待測(cè)物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu) (2)(2)化學(xué)純度：高度純化化學(xué)純度：高度純化 (3)(3)化學(xué)度量：化學(xué)度量： 準(zhǔn)確準(zhǔn)確 (4)(4)穩(wěn)定性：不易變質(zhì)、不易降解穩(wěn)定性：不易變質(zhì)、不易降解. . 特異性抗體特異性抗體 (1) (1)親和力大親和力大 (2)(2)高滴度高滴度 (3)(3)特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) (4)(4)可長(zhǎng)期保存可長(zhǎng)期保存. . 示蹤劑（標(biāo)記品）示蹤劑（標(biāo)記品）（1 1）高

12、比活度）高比活度（2 2）生物活性與免疫活性與標(biāo)記前一致）生物活性與免疫活性與標(biāo)記前一致（3 3）化學(xué)純度）化學(xué)純度95%95%（4 4）穩(wěn)定性好：標(biāo)記品不易脫落）穩(wěn)定性好：標(biāo)記品不易脫落. . 分離技術(shù)分離技術(shù)-要求要求(1)(1)結(jié)合部分與游離部分盡可能完全分開(kāi)結(jié)合部分與游離部分盡可能完全分開(kāi)(2)(2)非特異性結(jié)合率（非特異性結(jié)合率（NSB%NSB%）低，小于）低，小于5%5%(3)(3)分離的成分便于測(cè)量分離的成分便于測(cè)量(4)(4)分離效果不受外界環(huán)境影響分離效果不受外界環(huán)境影響(5)(5)分離試劑操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉易得分離試劑操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉易得微孔濾膜法微孔濾膜法鹽析法鹽析法活性炭吸附

13、法活性炭吸附法磁化顆粒法磁化顆粒法雙抗體法雙抗體法固相分離法固相分離法分離方法分離方法 第三節(jié)第三節(jié) 體外標(biāo)記免疫分析的類(lèi)型體外標(biāo)記免疫分析的類(lèi)型體外標(biāo)記免疫分析的類(lèi)型體外標(biāo)記免疫分析體外標(biāo)記免疫分析放射性核素標(biāo)記免疫分析(RIA、 IRMA)酶標(biāo)記免疫分析發(fā)光標(biāo)記免疫分析(化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析)時(shí)間分辯熒光免疫分析放射性核素標(biāo)記免疫分析放射性核素標(biāo)記免疫分析概念：概念：一種將放射性核素測(cè)量的高靈敏性、高精確一種將放射性核素測(cè)量的高靈敏性、高精確性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合的體外測(cè)定性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合的體外測(cè)定超微量（超微量（1010-9-

14、91010-15-15g g）物質(zhì)的新技術(shù)。）物質(zhì)的新技術(shù)。放射性核素標(biāo)記免疫分析分類(lèi):競(jìng)爭(zhēng)性競(jìng)爭(zhēng)性(標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原,抗體限量抗體限量)RIA非競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性(標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體,抗體過(guò)量抗體過(guò)量)IRMA放放射射性性核核素素標(biāo)標(biāo)記記放射性核素標(biāo)記免疫分析優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：自自19591959年年YalowYalow和和BersonBerson創(chuàng)建的放射免疫分析（創(chuàng)建的放射免疫分析（RIARIA）具）具有有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便實(shí)用、成本低廉靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便實(shí)用、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。為生等優(yōu)點(diǎn)。為生物醫(yī)學(xué)的微量物質(zhì)分析開(kāi)創(chuàng)了新的領(lǐng)域。發(fā)展到目前為止由物醫(yī)學(xué)的微量物質(zhì)分析開(kāi)創(chuàng)了新的領(lǐng)域。發(fā)展

15、到目前為止由此衍生出了各種各樣的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。此衍生出了各種各樣的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。雖然雖然RIARIA仍有較廣泛的使用市場(chǎng)和價(jià)值，但其方法學(xué)上仍有較廣泛的使用市場(chǎng)和價(jià)值，但其方法學(xué)上固有的弱點(diǎn)使發(fā)展受到一定限制。如必須使用放射性同位素固有的弱點(diǎn)使發(fā)展受到一定限制。如必須使用放射性同位素作為標(biāo)記物，存在人為的因素影響較大、輻射防護(hù)及防止污作為標(biāo)記物，存在人為的因素影響較大、輻射防護(hù)及防止污染的問(wèn)題，試劑盒使用時(shí)間短，可測(cè)量范圍相對(duì)較窄，難以染的問(wèn)題，試劑盒使用時(shí)間短，可測(cè)量范圍相對(duì)較窄，難以實(shí)現(xiàn)操作及測(cè)量的自動(dòng)化等。實(shí)現(xiàn)操作及測(cè)量的自動(dòng)化等。酶標(biāo)記免疫分析（EIA）v概念：概念：是應(yīng)用酶標(biāo)

16、記抗體（抗原）與抗原（抗體）是應(yīng)用酶標(biāo)記抗體（抗原）與抗原（抗體）產(chǎn)生特異性反應(yīng)，根據(jù)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)而定產(chǎn)生特異性反應(yīng)，根據(jù)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)而定量分析待測(cè)抗原或抗體含量。量分析待測(cè)抗原或抗體含量。v分類(lèi)分類(lèi): : 均相均相EIAEIA：酶增強(qiáng)免疫分析（：酶增強(qiáng)免疫分析（EMITEMIT） 非均相非均相EIA:EIA:酶聯(lián)免疫吸附分析法（酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELASAELASA）時(shí)間分辨熒光免疫分析(TrFIA)概念：概念： 是應(yīng)用鑭系元素標(biāo)記抗是應(yīng)用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，利用紫外線或激原或抗體，利用紫外線或激光使其發(fā)射熒光，結(jié)合波長(zhǎng)光使其發(fā)射熒光，結(jié)合波長(zhǎng)和時(shí)間兩種分辨技術(shù)的微量和時(shí)間

17、兩種分辨技術(shù)的微量分析方法。分析方法。常用鑭系元素：常用鑭系元素：銪、鋱、釤、鏑銪、鋱、釤、鏑特點(diǎn)：特點(diǎn)：分析范圍寬分析范圍寬 靈敏度高靈敏度高專(zhuān)一度高專(zhuān)一度高穩(wěn)定性強(qiáng)穩(wěn)定性強(qiáng)1234發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析 （CLIA）電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)分類(lèi)分類(lèi)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析 （CLIA） 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強(qiáng)度來(lái)確定物質(zhì)含量的分析方法。化學(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與待測(cè)的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)

18、過(guò)分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)。發(fā)光Y YY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶吖啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后（1）加入H2O2（pH10）化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析 （CLIA）概念：概念：利用化學(xué)反應(yīng)中釋放大利用化學(xué)反應(yīng)中釋放大量自由能產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間量自由能產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其退激到基態(tài)時(shí)，體，當(dāng)其退激到基態(tài)時(shí)，發(fā)射出光子，對(duì)這些光子發(fā)射出光子，對(duì)這些光子量進(jìn)行測(cè)量從而進(jìn)行定量量進(jìn)行測(cè)量從而進(jìn)行定量分析抗原含量。分析抗原含量。常用發(fā)光劑：常用發(fā)光劑：魯米諾類(lèi)、吖啶酯類(lèi)魯米諾類(lèi)、吖啶酯類(lèi)特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高靈敏度高特異性強(qiáng)

19、特異性強(qiáng)重復(fù)性好重復(fù)性好測(cè)定范圍寬測(cè)定范圍寬1234化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)v是將是將高特異性的高特異性的酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)和具有高靈酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)和具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)相結(jié)合的一種標(biāo)記免疫敏度的化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)相結(jié)合的一種標(biāo)記免疫分析方法。分析方法。v發(fā)光劑：金剛烷發(fā)光劑：金剛烷v特點(diǎn)：特點(diǎn)：標(biāo)記結(jié)合穩(wěn)定標(biāo)記結(jié)合穩(wěn)定發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)有利于測(cè)定有利于測(cè)定123辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)(ECLIA)簡(jiǎn)介：簡(jiǎn)介：是新一代標(biāo)記免疫分析技術(shù)，與其它標(biāo)記發(fā)是新一代標(biāo)記免疫分析技術(shù)，與其它標(biāo)記發(fā)光免疫分析

20、的原理不同，是一種在電極表面由電光免疫分析的原理不同，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，采用更為理想化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，采用更為理想的標(biāo)記物，使用磁性分離及電激發(fā)等新技術(shù)，進(jìn)的標(biāo)記物，使用磁性分離及電激發(fā)等新技術(shù)，進(jìn)一步推動(dòng)了發(fā)光免疫分析的發(fā)展，一步推動(dòng)了發(fā)光免疫分析的發(fā)展，是目前最先是目前最先進(jìn)的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定系統(tǒng)。進(jìn)的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定系統(tǒng)。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)v 原理：原理：以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體（抗原），與啶釕標(biāo)記抗體（抗原），與待測(cè)標(biāo)本中抗原（抗體）產(chǎn)待測(cè)標(biāo)本中抗原（抗體）產(chǎn)生免疫反應(yīng)形成復(fù)合物以三生免疫反應(yīng)形成復(fù)合

21、物以三丙胺丙胺(TPA)(TPA)為電子供體，在為電子供體，在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)發(fā)光和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)電化學(xué)發(fā)光和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)兩個(gè)過(guò)程。兩個(gè)過(guò)程。 特點(diǎn)特點(diǎn)準(zhǔn)確性好準(zhǔn)確性好多元檢測(cè)多元檢測(cè)均相測(cè)量均相測(cè)量穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好靈敏度高靈敏度高 在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗原(抗體)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)

22、，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。 Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+為標(biāo)記物為標(biāo)記物v三聯(lián)吡啶釕為水溶性、高穩(wěn)定性的小分子，可以三聯(lián)吡啶釕為水溶性、高穩(wěn)定性的小分子，可以確保電化學(xué)發(fā)光的高穩(wěn)定性，并且無(wú)噪音干擾。確保電化學(xué)發(fā)光的高穩(wěn)定性，并且無(wú)噪音干擾。v三聯(lián)吡啶釕結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單三聯(lián)吡啶釕結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, ,分子量小，所以，易于標(biāo)記分子量小，所以，易于標(biāo)記到任何物質(zhì)（如抗原、抗體、核酸，等）上，并到任何物質(zhì)（如抗原、抗體、核酸，

23、等）上，并且對(duì)原物質(zhì)的生物活性及免疫活性影響小。且對(duì)原物質(zhì)的生物活性及免疫活性影響小。vTPATPA是是ECLECL中的電子供體中的電子供體，氧化后生成的中間產(chǎn)物氧化后生成的中間產(chǎn)物是形成激發(fā)態(tài)是形成激發(fā)態(tài)Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+化學(xué)能來(lái)源?；瘜W(xué)能來(lái)源。電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)的標(biāo)記物的標(biāo)記物電化學(xué)發(fā)光免疫電化學(xué)發(fā)光免疫(ECLIA)(ECLIA)反應(yīng)模式圖反應(yīng)模式圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定示意圖第四節(jié)第四節(jié) 體外標(biāo)記免疫分析的質(zhì)量控制體外標(biāo)記免疫分析的質(zhì)量控制質(zhì)量控制的目的v近期目的：近期目的： 通過(guò)對(duì)測(cè)定結(jié)果的分析，對(duì)本次測(cè)定的質(zhì)量作通過(guò)對(duì)測(cè)定結(jié)

24、果的分析，對(duì)本次測(cè)定的質(zhì)量作出評(píng)價(jià)，并按照預(yù)定的要求決定結(jié)果的取舍。出評(píng)價(jià)，并按照預(yù)定的要求決定結(jié)果的取舍。v遠(yuǎn)期目的：遠(yuǎn)期目的： 通過(guò)對(duì)不同批測(cè)定結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)造成成誤通過(guò)對(duì)不同批測(cè)定結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)造成成誤差的原因，從而改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件或設(shè)計(jì)，以提高差的原因，從而改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件或設(shè)計(jì)，以提高質(zhì)量。質(zhì)量。分析誤差 * * 系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差 標(biāo)準(zhǔn)品誤差標(biāo)準(zhǔn)品誤差 加樣誤差加樣誤差 測(cè)量誤差測(cè)量誤差 * * 隨機(jī)誤差隨機(jī)誤差 樣品的采集與制備樣品的采集與制備質(zhì)量控制指標(biāo) . .精密度精密度 . .準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度 . .靈敏度靈敏度 . .特異性特異性. .穩(wěn)定性穩(wěn)定性精密度v用同一實(shí)驗(yàn)方法多次檢測(cè)用同一實(shí)驗(yàn)方法多次檢測(cè)同一樣品所得結(jié)果的一致同一樣品所得結(jié)果的一致性，又稱(chēng)重復(fù)性。性，又稱(chēng)重復(fù)性。v常表示測(cè)量結(jié)果中的隨機(jī)常表示測(cè)量結(jié)果中的隨機(jī)誤差大小。誤差大小。v常用變異系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差值常用變異系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差值等表示。等表示。準(zhǔn)確度v測(cè)定值與真值之間的符合程度測(cè)定值與真值之間的符合程度v由系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差疊加決定由系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差疊加決定v用回收率及健全性來(lái)評(píng)價(jià)用回收率及健全性來(lái)評(píng)價(jià)靈敏度測(cè)定方法的最小檢測(cè)量測(cè)定方法的最小檢測(cè)量影響因素：抗體親和力和特異性、標(biāo)記品的比活度影響因素：抗體親和力和特異性、標(biāo)記品的比活度抗原的免疫原性以及反應(yīng)方式和溫育條件等。抗原的免疫原性以及反