1、發(fā)酵工程學實驗姓名： 劉云謠 學號： 124120434 學院： 生命科學學院 專業(yè)、班級： 12生物技術 實驗課程名稱 發(fā)酵工程實驗 指導教師及職稱 唐湘華 開課學期 2014 至 2015 學年 下 學期 云南師范大學教務處編印實驗名稱：（一）特定產物工業(yè)生產菌種發(fā)酵及應用性質研究實驗時間第十三周實驗室睿智3-121小組合組是小組成員一、 實驗目的：1、掌握菌種選育、菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化和微生物酶制劑酶活測定的基本方法；2、了解酶學性質的研究.二、 實驗原理：1、理論依據(jù)（1）、果膠酶概況（2）、果膠酶的酶活測定方法（3）、微生物發(fā)酵生產特定產物受培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和附加條件等的制約（4）

2、、酶催化反應的進行受多種因素的影響2、果膠酶概況果膠質：是高等植物細胞壁內及細胞壁間的結構性多糖，是一類高分子碳水化合物，它的存在往往給果蔬加工等工藝帶來許多麻煩和損失。果膠酶：是指能分解果膠質的多種酶的總稱，廣泛存在于高等植物和微生物中。產生果膠酶的微生物：細菌、放線菌、酵母和霉菌，但目前商品果膠酶多數(shù)來自霉菌。果膠酶的應用：主要是用于果膠的分解，在水果加工、葡萄酒生產、麻類脫膠和飼料等方面有著廣泛的應用。3、 果膠酶的酶活測定方法 粘度降低法：利用粘度計測量在一定溫度、酶濃度和一定反應時間內，標準果膠溶液的粘度降低值。 脫膠作用時間法：以脫膠作用的時間來測定果膠酶的酶活力。 次亞碘酸法：用

3、滴定法定量測定半乳糖醛酸的生成量，以表示果膠酶的活力。 還原糖法（DNS法）：測定在一定溫度、酶濃度和一定反應時間內，水解果膠產生的還原糖的量。 DNS法：根據(jù)果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，后者是一種還原糖，與3，5 -二硝基水楊酸共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定的范圍內，還原糖的量和反應液的顏色呈比例關系，可利用比色法在540nm進行測定。4、 微生物發(fā)酵生產產品受以下條件制約：培養(yǎng)基成分：C源、N源、無機鹽、水和生長因子培養(yǎng)條件：溫度、pH、溶解氧等附加條件：誘導物、表面活性劑等5、酶催化反應的進行受多種因素的影響 底物濃度 酶濃度 溫度 pH 激活劑 抑制劑三、 實驗材料（一）試

4、劑 1、酶活測定用試劑和DNS 2、新鮮果汁（二）儀器燒杯、三角瓶、試管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、試劑瓶、研缽等；天平、滅菌鍋、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、電爐、恒溫水浴鍋、記時器（精確到秒）、分光光度計等。（三）培養(yǎng)基1、菌種篩選使用2、黑曲霉Asp-2固體發(fā)酵用1、菌種篩選使用培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基: 果膠 1% ，磷酸氫二鈉0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，瓊脂 2.0%。分離培養(yǎng)基果膠 0.5%，磷酸氫二鈉0.5%，瓊脂2.0%，pH4.5（3）發(fā)酵培養(yǎng)基果膠 1% ，磷酸氫二鈉0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。2、 黑曲霉Asp-2固體發(fā)酵培養(yǎng)基菌種斜面培養(yǎng)基（查氏培養(yǎng)基） NaNO3 0

5、.2% K2HPO4 0.1% KCl 0.05% MgSO4 0.05%FeSO4 0.001% 蔗糖 3%瓊脂 2.5% 自然pH種子培養(yǎng)基 麩皮 3.0% ，橘子粉 2.0% ，硫酸銨0.5%,葡萄糖 1% ，KH2PO4 0.1% pH4.5固體發(fā)酵培養(yǎng)基：5瓶 / 組麩皮 10g，橘子粉 2.5g，(NH4)SO4 0.1g（0.8%干料計）葡萄糖 0.125g（1%干料計），水 15ml 要求：按組統(tǒng)一配制后分裝三角瓶先將(NH4)SO4 、葡萄糖用水溶解，再加其它。四、 實驗方法、步驟及注意事項：（1） 固體發(fā)酵果膠酶1、 菌種準備菌種活化：試管保存菌種斜面活化30培養(yǎng)約60h液

6、體培養(yǎng)：將菌種接種入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶內，30，200rpm，培養(yǎng)約40h，備用。2、 氮源的選擇和選擇的氮源添加量對產酶的影響(第一組）選擇硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏按照1%濃度替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，接種5%液體種子，培養(yǎng)48小時，測定酶活。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5% （按干料計）濃度的已選擇的氮源，保持培養(yǎng)基的其它成分不變，在相同接種量（約5%，即1.5ml）相同培養(yǎng)條件下（30，60h）發(fā)酵，測定酶活。3、 碳源的選擇和選擇的碳源添加量對產酶的影響 (第二組)選擇果膠、葡萄糖、橘子粉按照1%濃度替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，接

7、種5%液體種子，培養(yǎng)48小時，測定酶活。在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0、0.5%、1.0、2%、3.% 的選擇的碳源，保持培養(yǎng)基的其它成分不變，在相同條件下接種液體種子（約5%，即1.5ml），相同培養(yǎng)條件下，30，發(fā)酵60h ，測定酶活。4、 培養(yǎng)基含水量對產酶的影響(第三組）在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入蒸餾水，使培養(yǎng)基中的含水量分別約為50%、55%、60%、65%和70%；保持培養(yǎng)基的其它成分不變，在相同接種量（5% ，即1.5ml ）相同培養(yǎng)條件下（30，4860h）發(fā)酵，測定酶活。5、 接種量對產酶的影響 (第三組）分別以4%、5%、6%、7%和8%的接種量接種果膠酶產生菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相同

8、的培養(yǎng)條件下（30，4860h）發(fā)酵，測定酶活。注意：由于接種的是液體菌種，所以在配制培養(yǎng)基時要將接種時多出的水分去掉。6、 發(fā)酵時間對產酶的影響 （第四組）在相同的培養(yǎng)基、相同的接種量（5%，即1.5ml ）和相同培養(yǎng)條件下（30）分別發(fā)酵36、48、60、72和84h ，測定酶活。注意：精確計算時間，準時取出發(fā)酵產物。7、 發(fā)酵溫度對產酶的影響 （第五組）保持培養(yǎng)基成分和接種量（5%，即1.5ml ）不變，分別在室溫、30、37和45的溫度條件下發(fā)酵4860h ，測定酶活。先把培養(yǎng)箱調到相應的溫度！8、果膠酶酶活的測定（1） 待測酶液的制備烘干：把發(fā)酵產物倒于平皿中，45烘干過夜；制備酶粉

9、：將烘干的發(fā)酵產物用研缽研磨成粉狀（盡量磨細），裝于塑料袋中備用；制備酶液：稱取0.1g酶粉，充分溶解于10mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（稀釋100倍），紗布（4層）過濾去除雜質；如果測定所得OD值不在有效值（0.2-0.6）范圍內，則相應地降低或增大稀釋倍數(shù)后再進行測定。（2）果膠酶酶活測定方法OD =（A+B）/ 2酶活定義：在pH3.0、 37條件下，每分鐘內從底物溶液中分解釋放1mol半乳糖醛酸所需要的酶量為一個酶活單位U/g。酶活計算公式 酶活（U/g）=A5KN1000/（TWM） A: 樣品的OD值 （平均值） K: 標準曲線的斜率 N: 稀釋倍數(shù) 5： 0.2毫升反應液轉換為1毫

10、升體積 T: 反應時間（min） 1000：轉換因子1mmol=1000mol W: 半乳糖醛酸的分子量（212.16g/mol） M: 稱取酶粉克數(shù)(g)繪制標準曲線的方法先配制一系列濃度不同的標準溶液，用選定的顯色劑進行顯色，在一定波長下分別測定它們的吸光度A。以A為橫坐標，濃度c為縱坐標，則得到一條擬合度較好的直線，稱為標準曲線。然后使用用完全相同的方法和步驟測定被測溶液的吸光度，便可從標準曲線上找出對應的被測溶液濃度或含量。半乳糖醛酸標準曲線的制作 精確稱取0.100g半乳糖醛酸，用緩沖溶液定容至100ml，制得濃度為1mg/ml的半乳糖醛酸的標準溶液。標準曲線如下圖表所示（3）注意事

11、項試管上編號：貼上用圓珠筆寫上編號的膠布，以防止保溫或沸水加熱時脫落；移液槍的使用：向試管內加入待測酶液或DNS時，槍頭不要觸碰管壁，也不要伸入液面下，連續(xù)吸取同一種溶液時可以不用更換槍頭！精確記時：每一管加入酶液的時間要做記錄，每管之間間隔的時間要合理；避免試管進水：煮沸和用流水沖洗時；實驗結果的記錄與分析9、儀器的使用恒溫水浴鍋分光光度計烘箱移液槍UV2000型分光光度計的使用注意提前半小時接通電源，打開機器開關使儀器通電，自檢；將對照液及測定液分別裝入比色杯3/4體積并用鏡頭紙擦干外壁，放入樣品室；調節(jié)測定所用波長；讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關閉開關，將比色杯沖洗干凈、浸泡于30酒精中。注

12、意事項1、接種接種方式是液體固體，用滅菌的移液管或10ml量筒接種或大槍頭；接種后振蕩接種瓶，使菌種充分與固體培養(yǎng)基混合。2、水浴鍋的使用：水量（蒸餾水）要超過試管中的液面3、分光光度計使用時注意：測定OD在540nm、以對照為參比、測定吸光值4、及時清洗用過的槍頭實驗準備內容（1）黑曲霉Asp-2固體發(fā)酵用的培養(yǎng)基固體發(fā)酵培養(yǎng)基：5瓶/組注意配方等的不同，做好標記?。?） 滅菌培養(yǎng)基其它：10ml量筒（紗布和報紙包口）、移液管（塞棉花）等時間：滅菌45min注意事項1、酶粉的選擇：同一大組采用同一酶粉進行應用性質的實驗！2、水浴鍋的使用水浴鍋的水量（蒸餾水）要超過試管中的液面各大組“處理時間”這項實驗共同在1個水浴鍋中進行3、分光光度計使用時注意OD660nm以蒸餾水為參比測定透光率五、 實