1、如何在體外表達(dá)一個(gè)基因？如何在體外表達(dá)一個(gè)基因？如何檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)？如何檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)？如何在體外表達(dá)一個(gè)基因？如何在體外表達(dá)一個(gè)基因？如何在體外表達(dá)一個(gè)基因如何在體外表達(dá)一個(gè)基因基因的獲取基因的獲取基因的克隆基因的克隆重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)基因的表達(dá)基因的表達(dá)基因產(chǎn)物的鑒定基因產(chǎn)物的鑒定表達(dá)產(chǎn)物的純化表達(dá)產(chǎn)物的純化 獲取目標(biāo)基因常常是基因操作的首要步驟。獲取目標(biāo)基因常常是基因操作的首要步驟。常規(guī)方法有常規(guī)方法有PCRPCR法，基因組文庫(kù)法，基因組文庫(kù)或或cDNAcDNA文庫(kù)法文庫(kù)法以及以及化學(xué)合成法化學(xué)合成法。應(yīng)根據(jù)具體的研究目的和。應(yīng)根據(jù)具體的研究目的和實(shí)驗(yàn)條件選用合適的方法

2、。實(shí)驗(yàn)條件選用合適的方法?；虻墨@取基因的獲取獲取基因的序列獲取基因的序列在獲取基因之前如果能知道基因的序列將使在獲取基因之前如果能知道基因的序列將使這一過(guò)程變得非常方便。這一過(guò)程變得非常方便。人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提供了所有已知基因的序人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提供了所有已知基因的序列。列。地址為地址為//化學(xué)合成法化學(xué)合成法較短的基因（較短的基因（100 base100 base）用途：用途：PCRPCR引物引物 測(cè)序引物測(cè)序引物 定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變 核酸雜交探針核酸雜交探針基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)10PCR

3、PCR3555PCRPCR擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因加樣孔DNA Marker以基因組以基因組DNADNA為模板，得到的為模板，得到的PCRPCR產(chǎn)物是含有產(chǎn)物是含有內(nèi)含子內(nèi)含子的基因的基因逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶PCRPCR（RT-PCRRT-PCR）RT-PCRRT-PCR是以是以mRNAmRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成成cDNAcDNA。使微量的。使微量的mRNAmRNA（pgpg水平）迅速擴(kuò)增水平）迅速擴(kuò)增（達(dá)（達(dá)ngngugug水平）水平）比基因組比基因組DNADNA少了內(nèi)含子少了內(nèi)含子cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)RT-PCRhttp:/www.bio.davidson.

4、edu/Courses/genomics/RTPCR/RT_PCR.html基因的克隆基因的克隆重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)20人體基因克隆人體基因克隆Restriction enzyme EcoRIBacterial enzyme that stops viral reproduction by cleaving viral DNAAct as molecular scisssors (cut plasmids and foreign human DNA)Produce short single stranded “sticky ends” where insertions of forei

5、gn DNA can be made基因重組技術(shù)需要：基因重組技術(shù)需要：一個(gè)載體：一個(gè)載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、質(zhì)粒、噬菌體、病毒、cosmidcosmid、BACBAC和和YACYAC等等二個(gè)酶：二個(gè)酶：限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶連接酶連接酶質(zhì)粒是最常用的載體質(zhì)粒是最常用的載體ori復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)oriori篩選基因篩選基因多克隆位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)（Multiple Multiple cloning site cloning site ，MCSMCS）限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶“分子剪刀分子剪刀”限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶共同作用可將不同的限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶共同作用可將不同的DNADNA分子連接形成

6、重組分子連接形成重組DNADNA分子分子 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過(guò)過(guò) 程程切切接接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)篩篩質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞感染感染 (infection)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡2. 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等篩篩：

7、重組體的篩選：重組體的篩選( (插入失活法插入失活法) ) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇 互補(bǔ)互補(bǔ)利用利用互補(bǔ)原理篩選重組體互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18 重組DNA技術(shù)基因的表達(dá)基因的表達(dá) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)量高簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)量高不足不足：不宜表達(dá)真核基因組不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。很難表達(dá)大量可溶性蛋白。1. 原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 (E.coli表達(dá)體系最為常表達(dá)體系最為常用用) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組及真核基

8、因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢(qián)、產(chǎn)量低操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢(qián)、產(chǎn)量低 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 2.2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲(chóng)、哺乳類(lèi)動(dòng)真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲(chóng)、哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞）物細(xì)胞）表達(dá)載體的選擇表達(dá)載體的選擇表達(dá)載體必需具備轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件：?jiǎn)?dòng)子、表達(dá)載體必需具備轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件：?jiǎn)?dòng)子、起始密碼子、終止密碼子等起

9、始密碼子、終止密碼子等原核表達(dá)載體：原核表達(dá)載體：S-DS-D序列序列真核表達(dá)載體：增強(qiáng)子、真核表達(dá)載體：增強(qiáng)子、Poly APoly A元件元件cDNAcDNA是首選對(duì)象，既可在原核細(xì)胞又可在真核細(xì)胞是首選對(duì)象，既可在原核細(xì)胞又可在真核細(xì)胞中表達(dá)中表達(dá)基因組基因組DNADNA只能在真核細(xì)胞中表達(dá)只能在真核細(xì)胞中表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定表達(dá)產(chǎn)物的鑒定表達(dá)產(chǎn)物的純化表達(dá)產(chǎn)物的純化安瑪西亞快速蛋白純化儀（安瑪西亞快速蛋白純化儀（FPLC） 如何檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)如何檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)mRNAmRNA的檢測(cè)的檢測(cè)northern blotnorthern blotRT-PCRRT-PCRmRNAmRNA的

10、定量檢測(cè)的定量檢測(cè)實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRPCR蛋白質(zhì)的定性與定量蛋白質(zhì)的定性與定量western blotwestern blot和和ELISAELISA細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)mRNAmRNA的定位檢測(cè)的定位檢測(cè)原位雜交原位雜交細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位檢測(cè)免疫組化免疫組化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位檢測(cè)熒光顯微分析熒光顯微分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù)核酸分子雜交核酸分子雜交序列互補(bǔ)的單鏈序列互補(bǔ)的單鏈DNADNA與與DNADNA、DNADNA與與RNARNA及及RNARNA與與RNARNA間可按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成雜交間可按照堿基

11、互補(bǔ)配對(duì)原則形成雜交分子分子如果將雜交分子中的一條單鏈連上標(biāo)記物就成了如果將雜交分子中的一條單鏈連上標(biāo)記物就成了核酸探針核酸探針標(biāo)記可以是同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記標(biāo)記可以是同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記MRNA的檢測(cè)的檢測(cè)RNA印跡印跡（NORTHERN BLOT）用用DNADNA探針來(lái)檢測(cè)特異基因的探針來(lái)檢測(cè)特異基因的mRNAmRNA，以分析該，以分析該基因的表達(dá)情況及基因的表達(dá)情況及mRNAmRNA分子的大小，特別用于分子的大小，特別用于分析細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、發(fā)育過(guò)程中有關(guān)基因的表達(dá)。分析細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、發(fā)育過(guò)程中有關(guān)基因的表達(dá)。http:/ TIMETIME RT-PCR RT-PCR）Real

12、 time PCRReal time PCR是一種定量是一種定量PCRPCR技術(shù)，用于定量技術(shù)，用于定量測(cè)定特定基因的起始模板數(shù)。測(cè)定特定基因的起始模板數(shù)。當(dāng)模板為來(lái)自當(dāng)模板為來(lái)自mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物cDNAcDNA時(shí)，可時(shí)，可用于定量測(cè)定用于定量測(cè)定mRNAmRNA的模板數(shù)，從而確定特定基的模板數(shù)，從而確定特定基因的表達(dá)水平因的表達(dá)水平蛋白質(zhì)的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)WWESTERNESTERN BLOTBLOT這是一種利用特異抗體來(lái)鑒定相應(yīng)蛋白質(zhì)的這是一種利用特異抗體來(lái)鑒定相應(yīng)蛋白質(zhì)的技術(shù)技術(shù)蛋白質(zhì)首先經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)首先經(jīng)過(guò)SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，

13、轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，用帶標(biāo)記離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，用帶標(biāo)記的抗體進(jìn)行結(jié)合鑒定的抗體進(jìn)行結(jié)合鑒定抗體標(biāo)記可以是同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記抗體標(biāo)記可以是同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記常用的非同位素標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化酶常用的非同位素標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化酶http:/Western-blot蛋白質(zhì)的定量蛋白質(zhì)的定量ELISAELISA酶聯(lián)免疫吸附法（酶聯(lián)免疫吸附法（ELISAELISA）是利用了抗原抗）是利用了抗原抗體特異識(shí)別與結(jié)合的特性而設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)定體特異識(shí)別與結(jié)合的特性而設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)定量測(cè)定方法，可用于測(cè)定蛋白質(zhì)混合液中特量測(cè)定方法，可用于測(cè)定蛋白質(zhì)混合液中特定蛋白質(zhì)的濃度，是常用的蛋白質(zhì)測(cè)定

14、方法。定蛋白質(zhì)的濃度，是常用的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。http:/ In situ hybridization of TRPM8 mRNA to a prostate adenocarcinoma. 4 m sections were hybridized with the TRPM8 probe used in Northern and dot blot experiments. A) and B) hybridization of the antisense TRPM8 probe to an adenocarcinoma of the prostate. C) sense probe of TRPM8 and D) Haematoxilin and Elaun staining of the same patient. 免疫組化技術(shù)免疫組化技