1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器與專用微載體 為什么要進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)? 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)、培養(yǎng)條件及存在問題 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的控制 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)專用微載體內(nèi)容提要內(nèi)容提要?jiǎng)游锛?xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)是指離體細(xì)胞在無菌條件下分裂、生長 ，在整個(gè)培養(yǎng)過程中不出現(xiàn)分化，不再形成組織。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的意義 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)生產(chǎn)生物工程產(chǎn)品,特別是功能蛋白質(zhì)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì):1)同源性: 直接進(jìn)行翻譯后加工,蛋白質(zhì)可直接折疊成正確的構(gòu)象 翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。2)有利于產(chǎn)品的分離純化:分泌胞外、純化方便動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的意義 醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域 生物工程

2、生物制藥領(lǐng)域羊水細(xì)胞培養(yǎng)羊水細(xì)胞培養(yǎng) 羊水細(xì)胞培養(yǎng)是培養(yǎng)羊水內(nèi)脫落的胎兒細(xì)胞，做成染色體核型分析，用于診斷胎兒染色體病及胎兒畸形，是一種科學(xué)的、結(jié)果可靠的、安全的產(chǎn)前診斷法。 常用于生物工程及制藥行業(yè)的動(dòng)常用于生物工程及制藥行業(yè)的動(dòng)物細(xì)胞體系物細(xì)胞體系 W1-38 W1-38：正常胚肺組織人二倍體正常胚肺組織人二倍體 細(xì)胞系。細(xì)胞系。 核型為核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，。成纖維細(xì)胞， 能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME （Eagle Basal medium）。）。10%小牛血清，小牛血清，pH7.2,同工酶為同工酶為G6PD B型。型。倍增時(shí)間為倍增時(shí)間為24h，有限壽命有限壽

3、命50代。代。安全，用于制備疫苗。安全，用于制備疫苗。 MRC-5MRC-5：從正常男性肺組織：從正常男性肺組織 中獲得的人二倍體細(xì)胞系。中獲得的人二倍體細(xì)胞系。 核型為核型為2n=46。 屬成纖維細(xì)胞。屬成纖維細(xì)胞。 培養(yǎng)基用加小牛血清。培養(yǎng)基用加小牛血清。 同工酶同工酶G6PD B型。型。 有限壽命有限壽命4246代。增殖代。增殖 速度較速度較W1-38快，對(duì)不良快，對(duì)不良 環(huán)境敏感性較環(huán)境敏感性較W1-38低。低。 對(duì)人的病毒敏感。對(duì)人的病毒敏感。 用于生產(chǎn)疫苗。用于生產(chǎn)疫苗。 BHK-21: BHK-21:從從5 5只無性別的生長只無性別的生長1 1天的地鼠幼天的地鼠幼鼠腎臟中分離的鼠

4、腎臟中分離的; ;成纖維樣細(xì)胞成纖維樣細(xì)胞, ,核型為核型為2n=44;2n=44;培養(yǎng)基為培養(yǎng)基為DMEMDMEM加加7%7%胎牛血清。用胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。工程細(xì)胞構(gòu)建。 Vero Vero：從正常成年非洲綠猴：從正常成年非洲綠猴 腎臟分離的。腎臟分離的。 為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞， 核型核型2n=602n=60； 培養(yǎng)基為培養(yǎng)基為199199培養(yǎng)基，培養(yǎng)基， 加加5%5%胎牛血清；用于增殖病毒，胎牛血清；用于增殖病毒， 包括多

5、瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、 狂犬病毒?？袢《?。 Namalwa Namalwa：從肯尼亞患有淋巴瘤?。簭目夏醽喕加辛馨土霾?人獲取，建成的人的類淋巴母細(xì)胞。人獲取，建成的人的類淋巴母細(xì)胞。2.8%2.8%的高倍體率，的高倍體率，12121414條標(biāo)記染條標(biāo)記染 色體。單條色體。單條X X，無，無Y Y。培養(yǎng)基為。培養(yǎng)基為RPMI 1640RPMI 1640，添加添加7%7%胎牛血清。用于生產(chǎn)胎牛血清。用于生產(chǎn) 干擾素。干擾素。 SP2/0-Ag14 SP2/0-Ag14：通過融合的方法，：通過融合的方法， 從有羊抗紅細(xì)胞活性的從有羊抗紅細(xì)胞活性的BALB/cBALB/c

6、小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系 P3X63Ag8P3X63Ag8融合雜交瘤融合雜交瘤SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag 亞克隆中分離獲得，亞克隆中分離獲得， 能耐受能耐受8 8氮鳥嘌呤氮鳥嘌呤 20g/ml20g/ml但但 在含在含HAT HAT 選擇培養(yǎng)基中不能存活。選擇培養(yǎng)基中不能存活。 通常用培養(yǎng)基為通常用培養(yǎng)基為DMEMDMEM，添加，添加10%10%胎胎 牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞 和抗體。和抗體。 Sf-9 1983 Sf-9 1983年從親代年從親代IPLBIPLBSF21AESF21AE 中克隆形成。親代細(xì)胞從秋粘蟲的

7、中克隆形成。親代細(xì)胞從秋粘蟲的 蛹卵組織中分離獲得。它對(duì)苜宿尺蛹卵組織中分離獲得。它對(duì)苜宿尺 蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒 高度敏感。高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為通常用的培養(yǎng)基為GraceGrace培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，添加添加3.3g/L 3.3g/L 水解乳蛋白和水解乳蛋白和3.3g/L3.3g/L酵母浸液酵母浸液, 10%, 10%胎牛血清。用于高胎牛血清。用于高效表達(dá)外來蛋白制品。效表達(dá)外來蛋白制品。動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞有兩種類型:1）非貼壁依賴性細(xì)胞(血液、淋巴組織、腫瘤組織）2）貼壁依賴性細(xì)胞（大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞） 培

8、養(yǎng)方法1、貼壁培養(yǎng)2、懸浮培養(yǎng)3、固定化培養(yǎng)貼壁培養(yǎng):貼壁依賴性細(xì)胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展,開始有絲分裂并迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)都采取這種方式.動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分 敏感敏感: 對(duì)理化因素敏感，如：對(duì)理化因素敏感，如： 滲透壓、滲透壓、pH、離子濃度、剪切離子濃度、剪切 力、微量元素等。力、微量元素等。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高: 必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、 微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生 長因子、貼壁因子等。長因子、貼壁因子等。1、培養(yǎng)基組成：血清是目

9、前細(xì)胞培養(yǎng)基中不可缺少的成分，向細(xì)胞提供生長所需要的激素、轉(zhuǎn)移蛋白和其他營養(yǎng)成分，已成為細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到最優(yōu)化和降低成本的主要障礙。 降低血清用量和采用無細(xì)胞培養(yǎng)基是目前研究的熱點(diǎn)。六大限制細(xì)胞生長的因素：六大限制細(xì)胞生長的因素：血清培養(yǎng)基的主要缺點(diǎn)及其原因：血清中含有細(xì)胞生長必須的微量組分，但這些組分的成分及其作用至今未清楚，因此無法取代；血清的存在是產(chǎn)物純化的主要障礙；血清是病毒污染及其他未知因素影響的主要來源，增加了細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品潛在的使用危險(xiǎn)；血清是培養(yǎng)基成本的主要部分；血清同時(shí)也有生長抑制的作用； 血清使用使實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)過程標(biāo)準(zhǔn)化變得困難。2、限制細(xì)胞生長的因素：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能達(dá)到的細(xì)胞

10、密度較低的主要原因是培養(yǎng)條件和最優(yōu)化控制的困難，包括：細(xì)胞代謝產(chǎn)物的毒害：乳酸、氨等；營養(yǎng)物的耗竭可利用的表面積的限制；接種的細(xì)胞最小密度；解決問題的方法是通過過程調(diào)控來實(shí)現(xiàn)：灌注系統(tǒng)、換液、流加等，其中灌注是最好的方法。同時(shí)采用合理的培養(yǎng)系統(tǒng)以增加表面積并提供最佳的物理化學(xué)環(huán)境。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡3、污染的控制：污染來源包括細(xì)胞種子、血清、試劑、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作人員。 污染控制起始于細(xì)胞種子及其保存； 除菌方法的改進(jìn)是關(guān)鍵-血清？可高溫滅菌的培養(yǎng)基的研究； 設(shè)備的合理設(shè)計(jì)及操作人員的培訓(xùn)必不可少。4、產(chǎn)物表達(dá)的控制： 問題：細(xì)胞生長的最優(yōu)化條件并不一定是表達(dá)的產(chǎn)物的最優(yōu)化條件？ 問題的解決在于上

11、游分子生物學(xué)的研究5、硬件和過程設(shè)計(jì)參數(shù)：硬件設(shè)計(jì)中的主要問題：細(xì)胞培養(yǎng)條件的控制（溫度、溶解氧、二氧化碳、pH、滲透壓），其中充分的氧傳遞是所有生物反應(yīng)器中的共同問題；而其他條件對(duì)動(dòng)物細(xì)胞來說可以接受的范圍都比較窄。污染的排除；遏制潛在生物毒害物的擴(kuò)散；足夠表面積的提供； 培養(yǎng)過程中剪切力的控制（攪拌、通氣、收獲）6、產(chǎn)物收獲目前細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的收率很低，不及總蛋白的1%，主要原因在于：血清蛋白質(zhì)的污染；細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物濃度低；產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下不穩(wěn)定；解決方法：使用無血清培養(yǎng)基；開發(fā)在無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法；開發(fā)篩選技術(shù)以得到產(chǎn)量高的細(xì)胞克隆；開發(fā)產(chǎn)物分離技術(shù)：親和柱、中空纖維、微囊等

12、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方式1、貼壁培養(yǎng)2、懸浮培養(yǎng)3、固定化培養(yǎng)一.貼壁培養(yǎng) 概念:貼壁依賴性細(xì)胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展,開始有絲分裂并迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)都采取這種方式.1.單層靜置貼壁培養(yǎng)2.多層固定培養(yǎng)法玻璃圓柱鈦碟裝置3. 微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):表面積/體積比大;微載體懸浮于培養(yǎng)基中,細(xì)胞生長環(huán)境均一,便于監(jiān)測(cè)和控制;培養(yǎng)基利用率高;采樣重演性好;收獲過程不復(fù)雜;放大較容易;勞動(dòng)強(qiáng)度小,占用空間小.4.中空纖維培養(yǎng)法中空纖維培養(yǎng)法: 模擬脈管在細(xì)胞間分布擴(kuò)散的原理,采用合成的中空纖維制成類似脈管的分布擴(kuò)散系統(tǒng).細(xì)胞接種于中空纖維外

13、表面與反應(yīng)器內(nèi)表面之間,培養(yǎng)液自入口進(jìn)入儲(chǔ)罐,進(jìn)行再生處理,循環(huán)使用.6.玻璃珠床反應(yīng)器玻璃珠床反應(yīng)器二.懸浮培養(yǎng) 概念:是指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程.主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng),如雜交瘤細(xì)胞等. 是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的;可以借鑒微生物發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn); 由于動(dòng)物細(xì)胞比較脆弱,所以在攪拌通氣等方式上必須比微生物培養(yǎng)更加溫和.三.固定化培養(yǎng) 概念:利用吸附或包埋等固定化的方式將細(xì)胞限制在一定的空間內(nèi),然后以固定化的顆粒進(jìn)行懸浮培養(yǎng).該方法對(duì)貼壁性和非貼壁依賴性細(xì)胞都是適合的. 常用的包埋培養(yǎng)方法:對(duì)非貼壁依賴性細(xì)胞常用海藻酸鈣包埋;對(duì)貼壁依賴性細(xì)胞常用膠原包埋.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方

14、式 分為5種:分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、灌注式一、分批式操作： 概念：是將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時(shí)間后，將整個(gè)反應(yīng)系取出。 培養(yǎng)過程：滯后期、對(duì)數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期、衰退期優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，容易掌握，是最常用的方式；缺點(diǎn)：不能使細(xì)胞自始至終處于最優(yōu)條件下。二、流加式操作：概念：先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)一步代謝，到反應(yīng)終止時(shí)取出整個(gè)反應(yīng)系。特點(diǎn)：1）能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度；2）整個(gè)過程中反應(yīng)體積是變化的。存在二種流加方式：無反饋控制

15、流加：反饋控制流加： 最常見的流加物質(zhì)：葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源三、半連續(xù)式操作（反復(fù)分批式、換液培養(yǎng)）： 概念：在分批培養(yǎng)操作的基礎(chǔ)上，不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分，再按分批式操作方式進(jìn)行培養(yǎng)，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。 優(yōu)點(diǎn)：可反復(fù)收獲培養(yǎng)液，對(duì)培養(yǎng)基因工程動(dòng)物細(xì)胞分泌有用產(chǎn)物或病毒培養(yǎng)過程比較實(shí)用。四、連續(xù)操作： 概念：在培養(yǎng)過程中一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。 優(yōu)點(diǎn)：維持細(xì)胞一直處于優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長和產(chǎn)物的形成；對(duì)細(xì)胞生理和代謝規(guī)律的研究是一種重要的手段。五、灌注式操作培養(yǎng)：概念：細(xì)胞

16、培養(yǎng)過程中一方面不斷加入新鮮培養(yǎng)基，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平下的狀態(tài)。第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)必須滿足的條件：生物因素；化學(xué)因素；傳質(zhì)因素；傳熱因素；安全因素；操作因素；反應(yīng)器類型；操作方式；控制方式；攪拌方式歸結(jié)到一、生物反應(yīng)器的種類：懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器空氣提升式；攪拌槽；中空纖維管；陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)用攪拌槽（微載體系統(tǒng)）中空纖維管陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反應(yīng)器包埋培養(yǎng)用流化床固定床氣升式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器： 優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物的湍流溫和而均勻，剪切力

17、相當(dāng)小，對(duì)細(xì)胞損傷小，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營養(yǎng)分布均勻。一般產(chǎn)生泡沫不多。 中空纖維管生物反應(yīng)器： 特點(diǎn)：纖維一般是橫放的； 優(yōu)點(diǎn)：用途廣，可用于懸浮培養(yǎng)和貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞密度高，培養(yǎng)基和細(xì)胞分布均勻，能長期運(yùn)轉(zhuǎn) 通氣攪拌生物反應(yīng)器 無泡攪拌反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的控制 溶氧控制：針對(duì)動(dòng)物培養(yǎng)的合適攪拌，加入 少量溶氧量大的不相溶溶濟(jì)，改變通入氣體的氮氧比； pH控制：采用通入CO2/NaOH緩沖液系統(tǒng)來控制，可避免局部的極端pH出現(xiàn)； 溫度和攪拌轉(zhuǎn)速的控制比較簡(jiǎn)單采用微載體培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞是當(dāng)前最有發(fā)展前途的一種培養(yǎng)模式 微載體:指直徑在60250m、能夠適用于貼壁細(xì)胞

18、生長的微珠。 應(yīng)用微載體于細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：表面積/體積（S/V）大；采用均勻懸浮培養(yǎng)，將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)融合，簡(jiǎn)化了環(huán)境因素的檢測(cè)和控制；培養(yǎng)基利用率高；收獲細(xì)胞過程不復(fù)雜；放大容易；勞動(dòng)強(qiáng)度??；培養(yǎng)系統(tǒng)占用空間小動(dòng)物細(xì)胞貼壁的可能性取決于：細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)率；細(xì)胞與微載體的相融性；微載體表面的物理化學(xué)物性，主要是與電荷極性的電荷密度，以及培養(yǎng)基或微載體上吸附的媒介有關(guān)；與細(xì)胞生長環(huán)境有關(guān)，合適的生長環(huán)境有利于吸附。優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性 不含能毒害細(xì)胞的成分； 微載體須與細(xì)胞有良好的相容性；優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性密度應(yīng)略大于培養(yǎng)基； 粒徑在40120m范圍，生理鹽水溶脹后增大到60250 m，粒度分布均勻，徑差不大于2025 m；優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性良好的光學(xué)透明性； 能在PBS中耐120125C、2030min高溫滅菌；優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性應(yīng)是非剛性材料； 不吸收培養(yǎng)中的營養(yǎng)成分；優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品容易，不影響蛋白質(zhì)分離純化； 價(jià)廉，能重復(fù)使用。微載體主要類型一、交聯(lián)葡萄糖為基質(zhì)的微載體：DEAE-交