1、會計學1微生物的實驗室培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng)(piyng)課件課件第一頁，共62頁。 了解有關培養(yǎng)基的基礎知識，進行無菌技術的操作(cozu)，進行微生物的培養(yǎng)。 一、課題(kt)目標： 掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(jsh)，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術的操作。二、課題重點和難點：三、技能目標：第2頁/共62頁第二頁，共62頁。一、基礎知識：（一）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖(fnzh)使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、

2、鑒定(jindng)等。（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型(lixng)和用途第3頁/共62頁第三頁，共62頁。液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基據(jù)物理性質分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基據(jù)化學成分分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基據(jù)用途分常用(chn yn)于工業(yè)生產(chǎn)常用于觀察微生物的運動(yndng)、鑒定菌種用于微生物的分離、計數(shù)常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加

3、入高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。第4頁/共62頁第四頁，共62頁。固體(gt)培養(yǎng)基：菌落第5頁/共62頁第五頁，共62頁。液體(yt)培養(yǎng)基：表面(biomin)生長均勻混濁(hnzhu)生長沉淀生長第6頁/共62頁第六頁，共62頁。半固體(gt)培養(yǎng)基：無動力(dngl) 有動力(dngl)(彌散)(是否

4、(sh fu)運動) 第7頁/共62頁第七頁，共62頁。2、培養(yǎng)基配制(pizh)原則： （1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)(piyng)目的等確定配制培養(yǎng)(piyng)基的種類，因為不同的微生物對培養(yǎng)(piyng)物質的需求不同。 （2）營養(yǎng)要協(xié)調：注意各種營養(yǎng)物質的濃度和比例。 （3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。 細菌pH為：6.5-7.5； 放線菌pH為：7.5-8.5； 真菌pH為：5.0-6.0。第8頁/共62頁第八頁，共62頁。第9頁/共62頁第九頁，共62頁。4、微生物的五種(w zhn)營養(yǎng)要素碳源 （carbon source） 氮源（nitrogen

5、 source） 生長因子（growth factor） 無機鹽（mineral salts） 水（wahtor） Cncnc-micro第10頁/共62頁第十頁，共62頁。 凡能為微生物提供生長(shngzhng)繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質都稱為碳源 。Cncnc-micro碳源第11頁/共62頁第十一頁，共62頁。碳源是異養(yǎng)微生物的主要能源物質。碳源功能(gngnng)第12頁/共62頁第十二頁，共62頁。碳源種類(zhngli)Cncnc-micro第13頁/共62頁第十三頁，共62頁。氮源(nitrogin source)Cncnc-micro第14頁/共62頁第十四頁，共62頁。氮源功

6、能(gngnng)Cncnc-micro第15頁/共62頁第十五頁，共62頁。氮源種類(zhngli)Cncnc-micro第16頁/共62頁第十六頁，共62頁。無機鹽（mineral salts） 無機鹽功能(gngnng)Cncnc-micro第17頁/共62頁第十七頁，共62頁。無機鹽種類(zhngli)Cncnc-micro第18頁/共62頁第十八頁，共62頁。Cncnc-micro生長因子第19頁/共62頁第十九頁，共62頁。維生素Cncnc-micro第20頁/共62頁第二十頁，共62頁。氨基酸Cncnc-micro第21頁/共62頁第二十一頁，共62頁。堿基Cncnc-micro

7、第22頁/共62頁第二十二頁，共62頁。水Cncnc-micron形態(tài)）。第23頁/共62頁第二十三頁，共62頁。來 源常用原料功 能碳源CO2、NaHCO3、糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等糖類構成細胞物質和一些代謝產(chǎn)物，有些還是異養(yǎng)做生物的主要能源物質氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、尿素、牛肉膏和蛋白胨等銨鹽、硝酸鹽等合成蛋白質、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物生長因子維生素、氨基酸、堿基酶、核酸等的組成成分第24頁/共62頁第二十四頁，共62頁。加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌(mjn)等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)

8、基: 分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導入了目的基因的受體細胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細胞第25頁/共62頁第二十五頁，共62頁。 根據(jù)細胞生存所需物質的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助(fzh)物質。 優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。 合成(hchng)培養(yǎng)基:第26頁/共62頁第二十六頁，共62頁。 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限;

9、成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結果的分析;易發(fā)生(fshng)支原體污染;天然(tinrn)培養(yǎng)基：第27頁/共62頁第二十七頁，共62頁。1.無菌技術(jsh)的概念 無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范(gufn)地進行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。 第28頁/共62頁第二十八頁，共62頁。（）消毒定義：利用(lyng)化學或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。2.消毒(xio d)與滅菌的概念及兩者的區(qū)別 第29頁/共62頁

10、第二十九頁，共62頁。（2）滅菌(mi jn)的定義：是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括所有細菌的孢子、芽孢(y bo)、霉菌及病毒，而達到完全無菌之過程。 滅菌與消毒技術是微生物有關工作中最普通也是最重要的技術。第30頁/共62頁第三十頁，共62頁。比比較較項項理化因素的理化因素的作用強度作用強度消滅微生物消滅微生物的數(shù)量的數(shù)量芽孢和孢子芽孢和孢子能否被消滅能否被消滅消消毒毒較為溫和較為溫和部分生活狀部分生活狀態(tài)的微生物態(tài)的微生物不能不能滅滅菌菌強烈強烈全部微生物全部微生物能能消毒與滅菌(mi jn)的比較第31頁/共62頁第三十一頁，共62頁。1、煮沸消毒法:100煮沸5

11、-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行(jnxng)皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒(1)消毒(xio d)的方法：3.常用的消毒與滅菌(mi jn)的方法第32頁/共62頁第三十二頁，共62頁。1、灼燒滅菌接種(jizhng)環(huán)、接種(jizhng)針、試管口2、干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 下維持15-30min.(2)滅菌(mi jn)的方法：第33頁/共62頁第三十三頁，共62頁。 最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱

12、的某些微生物的休眠體，同時(tngsh)可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。 培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設計的。 第34頁/共62頁第三十四頁，共62頁。1.無菌技術除了用來(yn li)防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料(cilio)或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。

13、（1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實驗操作者的雙手 答：無菌技術還能有效避免操作者自身(zshn)被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。第35頁/共62頁第三十五頁，共62頁。1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板(pngbn)5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存第36頁/共62頁第三十六頁，共62頁。三、實驗(shyn)操作 （ 一.）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)(piyng)基（用于培養(yǎng)(piyng)細菌）第37頁/共62頁第三十七頁，共62頁。1計算、稱量2溶化3調pH：pH764過濾：這一步可以省去。5分裝：分

14、裝過程中注意(zh y)不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6加塞7包扎操作步驟第38頁/共62頁第三十八頁，共62頁。 8滅菌: 將50ml培養(yǎng)(piyng)基用玻棒轉移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。將培養(yǎng)(piyng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160170 下滅菌2h。 9倒平板: 待培養(yǎng)(piyng)基冷卻到50 左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種. 10無菌檢查： 將滅菌的培

15、養(yǎng)(piyng)基放入37的溫室中培養(yǎng)(piyng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。第39頁/共62頁第三十九頁，共62頁。第40頁/共62頁第四十頁，共62頁。 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平板(pngbn)。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛(gng gng)不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第41頁/共62頁第四十一頁，共62頁。3.平板(pngbn)冷凝后，為什么要將平板(pngbn)倒置？4.在倒平板的過程中，如果(

16、rgu)不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：平板(pngbn)冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板(pngbn)倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第42頁/共62頁第四十二頁，共62頁。（二）、純化(chn hu)大腸桿菌接種方法(fngf)有：平板劃線法和稀釋涂布平板法 平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作(cozu),將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表

17、面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.第43頁/共62頁第四十三頁，共62頁。第44頁/共62頁第四十四頁，共62頁。菌落(jnlu)細菌(xjn)的菌落特征因種而異 第45頁/共62頁第四十五頁，共62頁。霉菌的菌落(jnlu)特征因種而異菌落(jnlu)第46頁/共62頁第四十六頁，共62頁。第47頁/共62頁第四十七頁，共62頁。 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束(jish)時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為

18、了殺死上次劃線結束(jish)后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束(jish)后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。第48頁/共62頁第四十八頁，共62頁。 2.在灼燒接種(jizhng)環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種(jizhng)環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端(m dun)開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始

19、，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第49頁/共62頁第四十九頁，共62頁。第50頁/共62頁第五十頁，共62頁。第51頁/共62頁第五十一頁，共62頁。 涂布平板的所有操作(cozu)都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作(cozu)要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作(cozu)？ 應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如(lr)，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。第52頁/共62頁第五十二頁，共62頁。第53頁/共62頁第五十三頁，共62頁。四、課題(kt)成果評價 （一）培養(yǎng)(p

20、iyng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)(piyng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)(piyng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)(piyng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)(piyng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。 （三）是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養(yǎng)(piyng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主

21、要是培養(yǎng)(piyng)學生良好的科學態(tài)度與習慣。第54頁/共62頁第五十四頁，共62頁。第55頁/共62頁第五十五頁，共62頁。 1、臨時保藏：接種(jizhng)到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法第56頁/共62頁第五十六頁，共62頁。本課題知識(zh shi)小結:第57頁/共62頁第五十七頁，共62頁?！镜淅馕?ji x)】 例1關微生物營養(yǎng)物質的敘述(xsh)中，正確的是A.是碳源的物質不可能同時是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽 D.無機氮源也能提供能量 解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質有較大差別，要針對微生物的具體

22、情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣(du yn)。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。答案：D第58頁/共62頁第五十八頁，共62頁。例2下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解(lji)不正確的是A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前答案(d n)：B 解析：滅菌是微生物發(fā)酵過