1、分子生物學實驗原理分子生物學實驗原理第一節(jié) 分子生物學開展概述l分子生物學分子生物學molecular biology是在分子程是在分子程度上研討生物的構(gòu)造、組織和功能的科學。度上研討生物的構(gòu)造、組織和功能的科學。l1950年，年，Astbury在一次學術(shù)報告中，初在一次學術(shù)報告中，初次提出并運用了分子生物學這一名詞術(shù)語。次提出并運用了分子生物學這一名詞術(shù)語。l廣義和狹義之分廣義和狹義之分l醫(yī)學分子生物學是運用分子生物學技術(shù)和醫(yī)學分子生物學是運用分子生物學技術(shù)和實際來闡明人體正常生理活動和病理過程實際來闡明人體正常生理活動和病理過程及其調(diào)控的分子機理。及其調(diào)控的分子機理。分子生物學實際與實踐運

2、用的成就分子生物學實際與實踐運用的成就實際方面實際方面1.關(guān)于腫瘤的發(fā)生：關(guān)于腫瘤的發(fā)生： 提出了腫瘤來源提出了腫瘤來源于細胞增殖和分化調(diào)控的失常和細胞于細胞增殖和分化調(diào)控的失常和細胞同它周圍組織關(guān)系的紊亂。同它周圍組織關(guān)系的紊亂。 癌基因：癌基因：100多種；抑癌基因：多種；抑癌基因：20多種多種 細胞周期調(diào)控系統(tǒng)細胞周期調(diào)控系統(tǒng) 細胞凋亡細胞凋亡 端粒酶端粒酶2.關(guān)于艾滋病關(guān)于艾滋病 Acquired Immune Deficiency Syndrome HIV序列；疫苗序列；疫苗3.關(guān)于慢性病關(guān)于慢性病chronic disease，如心血管，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)疾

3、病、肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因及其多態(tài)性。了相關(guān)基因及其多態(tài)性。4.關(guān)于生長、發(fā)育與進化的一致實際，關(guān)于生長、發(fā)育與進化的一致實際，也深化到了分子程度。也深化到了分子程度。實踐運用方面實踐運用方面1.轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物目前已鑒定和克隆化的用于轉(zhuǎn)基因植目前已鑒定和克隆化的用于轉(zhuǎn)基因植物的基因有物的基因有100多個。多個?？钩輨?、抗昆蟲、抗病毒、抗不良抗除草劑、抗昆蟲、抗病毒、抗不良環(huán)境要素抗寒、抗鹽堿地、抗旱、環(huán)境要素抗寒、抗鹽堿地、抗旱、抗?jié)?、提高作物的產(chǎn)量、提高蛋白抗?jié)场⑻岣咦魑锏漠a(chǎn)量、提高蛋白質(zhì)含量、改善氨基酸構(gòu)成等。質(zhì)含量、改善氨基酸構(gòu)成等。2.轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物 19

4、83年，超級小白鼠，體重是正常年，超級小白鼠，體重是正常鼠的鼠的2倍。隨后出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬、羊、倍。隨后出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬、羊、雞、兔、牛、鯉魚等。我國目前研討雞、兔、牛、鯉魚等。我國目前研討了金魚、鯉魚、圓頭魴。了金魚、鯉魚、圓頭魴。3.基因工程多肽藥物與疫苗基因工程多肽藥物與疫苗 主要指主要指DNA體外重組技術(shù)所研制的體外重組技術(shù)所研制的產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因動物和植物所研制的產(chǎn)產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因動物和植物所研制的產(chǎn)品，以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)所研制或改品，以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)所研制或改良的產(chǎn)品。良的產(chǎn)品。 4.基因診斷與基因治療 基因診斷gene diagnosis是指經(jīng)過直接探查基因的存在形狀或缺陷，從而對疾病作出診斷

5、的方法。 目的物：DNA或RNA 方法：核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、 DNA芯片技術(shù) 疾?。哼z傳性疾??；傳染病或感染性疾病基因治療基因治療gene therapy 指將正常的外源基因?qū)肷镏笇⒄５耐庠椿驅(qū)肷矬w靶細胞內(nèi)，以彌補所缺失的體靶細胞內(nèi)，以彌補所缺失的基因，封鎖或降低異常表達的基因，封鎖或降低異常表達的基因，以到達治療疾病的目的?；颍缘竭_治療疾病的目的。治療疾病：治療疾病： 遺傳病遺傳病 惡性腫瘤惡性腫瘤 傳染病傳染病5.環(huán)境監(jiān)測與凈化環(huán)境監(jiān)測與凈化 area survey and depollution 監(jiān)測：可檢測環(huán)境中的病毒和監(jiān)測：可檢測環(huán)境中的病毒和細菌細菌 凈化

6、：改造細菌分解環(huán)境中的凈化：改造細菌分解環(huán)境中的石油、殘留的農(nóng)藥和有毒金屬石油、殘留的農(nóng)藥和有毒金屬6.克隆動物克隆動物Clone animal 1997年年“多利克隆羊多利克隆羊 克隆器官干細胞克隆器官干細胞stem cell技技術(shù)術(shù)7.人類基因組方案人類基因組方案human genome project;HGP1990年，美國國立衛(wèi)生研討院年，美國國立衛(wèi)生研討院NIH 和美國能源部結(jié)合發(fā)表和美國能源部結(jié)合發(fā)表了人類基因組方案。了人類基因組方案。30億個堿基對，估計有億個堿基對，估計有3萬萬4萬萬個人類基因。個人類基因。2000年年6月月26日，初次繪成人類基日，初次繪成人類基因組因組“任務

7、框架圖任務框架圖 。2003年年4月月14日，中、美、日、德、日，中、美、日、德、法、英等法、英等6國科學家及指點人宣布國科學家及指點人宣布人類基因組序列圖繪制勝利，人人類基因組序列圖繪制勝利，人類基因組方案的一切目的全部實類基因組方案的一切目的全部實現(xiàn)?，F(xiàn)。 意意 義義與與“阿波羅登月方案相媲美阿波羅登月方案相媲美1996年諾貝爾化學獎得主羅伯特年諾貝爾化學獎得主羅伯特柯特以為，柯特以為，20世紀是物理學和化學的世紀，世紀是物理學和化學的世紀，21世紀將世紀將是生物學的世紀。是生物學的世紀。推進分子生物學更加快速地開展：蛋白質(zhì)推進分子生物學更加快速地開展：蛋白質(zhì)組學、代謝蛋白質(zhì)組學、藥物蛋白

8、質(zhì)組學、組學、代謝蛋白質(zhì)組學、藥物蛋白質(zhì)組學、毒物蛋白質(zhì)組學、營養(yǎng)蛋白質(zhì)組學及各種毒物蛋白質(zhì)組學、營養(yǎng)蛋白質(zhì)組學及各種方案方案對其他相關(guān)學科的影響對其他相關(guān)學科的影響1.向其他學科浸透向其他學科浸透2.構(gòu)成了許多新興的邊緣學科構(gòu)成了許多新興的邊緣學科 根底醫(yī)學方面：腫瘤分子生物學、免疫分子生根底醫(yī)學方面：腫瘤分子生物學、免疫分子生 物學、神經(jīng)分子生物學等物學、神經(jīng)分子生物學等 預防醫(yī)學方面：分子營養(yǎng)學、分子毒理學、分預防醫(yī)學方面：分子營養(yǎng)學、分子毒理學、分 子流行病學、遺傳流行病學、人子流行病學、遺傳流行病學、人 類基因組流行病學、類基因組流行病學、 公共衛(wèi)生公共衛(wèi)生 遺傳學遺傳學在預防醫(yī)學中

9、的運用及開展方向在預防醫(yī)學中的運用及開展方向1.1.慢性病的研討慢性病的研討 慢性病的發(fā)病緣由絕慢性病的發(fā)病緣由絕大多數(shù)是基因與外界環(huán)境要素相互作用大多數(shù)是基因與外界環(huán)境要素相互作用的結(jié)果。的結(jié)果。2.2.環(huán)境要素對人類遺傳物質(zhì)損傷的研討環(huán)境要素對人類遺傳物質(zhì)損傷的研討及及“三致毒性的研討：生物標志物的研三致毒性的研討：生物標志物的研討和評價方法的建立討和評價方法的建立3.3.環(huán)境監(jiān)測與污染物的凈化。環(huán)境監(jiān)測與污染物的凈化。4.4.遺傳病的產(chǎn)前診斷基因型預防及早期診遺傳病的產(chǎn)前診斷基因型預防及早期診斷表型預防。斷表型預防。5.5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。某些重要疾病的生物工程疫苗的研

10、制。 6.6.對環(huán)境要素敏感基因及易感人群的研討環(huán)境對環(huán)境要素敏感基因及易感人群的研討環(huán)境基因組方案環(huán)境基因組學基因組方案環(huán)境基因組學 1 1環(huán)境應對反響基因環(huán)境應對反響基因 2 2挑選多態(tài)性及易感性挑選多態(tài)性及易感性 3 3根據(jù)易感性制定不同的干涉方案根據(jù)易感性制定不同的干涉方案一、分子生物學一些重要的實際知識一、分子生物學一些重要的實際知識1.分子生物學開展史上一些重要的事件分子生物學開展史上一些重要的事件11865年，年，“遺傳學之父遺傳學之父G.Mendel根據(jù)豌豆雜交實驗結(jié)果，創(chuàng)建了遺傳因根據(jù)豌豆雜交實驗結(jié)果，創(chuàng)建了遺傳因子學說，即遺傳的分別律和自在組合律。子學說，即遺傳的分別律和自

11、在組合律。21903年年W.Sutton提出染色體是提出染色體是Mendel遺傳單位的載體的概念。遺傳單位的載體的概念。31909年，年，W.Johannsen將這種在染將這種在染色體上的遺傳單位定名為基因色體上的遺傳單位定名為基因gene。41910年，現(xiàn)代實驗遺傳學奠基人年，現(xiàn)代實驗遺傳學奠基人TH.Morgan和他的研討生在研討果蠅的遺和他的研討生在研討果蠅的遺傳規(guī)律時發(fā)現(xiàn)了基因的連鎖律和交換律。傳規(guī)律時發(fā)現(xiàn)了基因的連鎖律和交換律。51944年，年，OT.Avery等人等人3人分別人分別出細菌出細菌 DNA，并發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)DNA是攜帶生命遺傳是攜帶生命遺傳物質(zhì)的分子。物質(zhì)的分子。6195

12、0年，年，Astbury在一次演講中，初在一次演講中，初次運用了次運用了 “分子生物學分子生物學 術(shù)語。術(shù)語。71953年，年，Watson和和Crick提出了提出了DNA構(gòu)造的雙螺旋模型，提示了遺傳物質(zhì)自我構(gòu)造的雙螺旋模型，提示了遺傳物質(zhì)自我復制的機制。復制的機制。81961年至年至1966年，年，Nirenberg和和Crick 等人破譯了等人破譯了DNA遺傳密碼，遺傳密碼，1966年年 破譯了破譯了64個遺傳密碼。個遺傳密碼。 提出了遺傳信息由提出了遺傳信息由DNA RNA蛋白蛋白質(zhì)傳送的中心法那么。質(zhì)傳送的中心法那么。 91969年，年，Jonathan Beckwith及其同及其同事

13、在哈佛大學勝利分別出第一個基因。事在哈佛大學勝利分別出第一個基因。101970年，發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。年，發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。111961年，年，F(xiàn).Jacob和和J.Monod提出了提出了乳糖支配子學說。乳糖支配子學說。12自自1946年起的年起的20年當中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)年當中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多質(zhì)粒；了許多質(zhì)粒；1968年至年至1970年又發(fā)現(xiàn)了許年又發(fā)現(xiàn)了許多限制性內(nèi)切酶，為多限制性內(nèi)切酶，為DNA體外重組提供了體外重組提供了有利工具。有利工具。131973年，重組年，重組DNA技術(shù)問世。技術(shù)問世。141986年，年，K.Mullis等建立了等建立了PCR技術(shù)技術(shù)151990年，人類基因組方案。年，人類

14、基因組方案。 2.三個重要實際三個重要實際important theory(1)DNA的構(gòu)造、復制、中心法那么的構(gòu)造、復制、中心法那么根本構(gòu)成單位是核苷酸根本構(gòu)成單位是核苷酸核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸構(gòu)成。核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸構(gòu)成。堿基分別是腺嘌呤堿基分別是腺嘌呤 (A)、鳥嘌呤、鳥嘌呤 (G)、胸腺嘧啶胸腺嘧啶 (T)和胞嘧啶和胞嘧啶(C)。相鄰的兩個核苷酸以磷酸二酯鍵相連相鄰的兩個核苷酸以磷酸二酯鍵相連進一步盤旋、折疊，構(gòu)成三級或四級進一步盤旋、折疊，構(gòu)成三級或四級構(gòu)造構(gòu)造RNARNA與與DNADNA有如下不同點：有如下不同點：五碳糖為核糖五碳糖為核糖( (不是脫氧核糖不是脫氧核

15、糖) )；堿基中有尿嘧啶堿基中有尿嘧啶U(uracil)U(uracil)而沒有胸腺而沒有胸腺嘧啶嘧啶RNARNA為單鏈，不是雙鏈，但為單鏈，不是雙鏈，但RNARNA單鏈之單鏈之間相鄰的堿基可由氫鍵作用構(gòu)成部分間相鄰的堿基可由氫鍵作用構(gòu)成部分雙鏈。雙鏈。 DNADNA存在于細胞核的染色體、線粒體以存在于細胞核的染色體、線粒體以及染色體以外的質(zhì)粒中及染色體以外的質(zhì)粒中( (質(zhì)粒是一些雙質(zhì)粒是一些雙鏈，閉環(huán)的鏈，閉環(huán)的DNADNA分子分子) )。 DNA(或RNA) 構(gòu)造給我們的啟示 DNA(或RNA)是水溶性的。這是由于含有磷酸基因、羥基和氨基。在核酸提取過程中，我們保管的是水相、而不是有機相。

16、核酸是兩性電離，既帶正電荷，又帶負電荷。它的等電點(PI)為22.5。在中性溶液中帶負電荷。對核酸進展電泳時，點樣時應點在負極；雜交時選擇尼龍膜時，最好選擇帶正電荷的尼龍膜。(核酸帶負電荷，容易吸附到帶正電荷的膜上，結(jié)實，不掉) DNADNA在細胞中存在部位不同在細胞中存在部位不同( (細胞核、線粒細胞核、線粒體、質(zhì)粒體、質(zhì)粒) )，所以應留意提取方法的不同，所以應留意提取方法的不同 由于由于DNADNA空間構(gòu)象不同，在電泳時遷移率空間構(gòu)象不同，在電泳時遷移率不同。不同。根據(jù)堿基互補配對原那么，可設(shè)計引物和根據(jù)堿基互補配對原那么，可設(shè)計引物和探針雜交。探針雜交。由于由于DNADNA的雙螺旋構(gòu)造

17、和的雙螺旋構(gòu)造和RNARNA易由于分子內(nèi)易由于分子內(nèi)氫鏈作用構(gòu)成二級構(gòu)造，所以在進展雜交等氫鏈作用構(gòu)成二級構(gòu)造，所以在進展雜交等反響時，首先應加熱變性，破壞二級構(gòu)造。反響時，首先應加熱變性，破壞二級構(gòu)造。l 在解旋酶的作用下，翻開在解旋酶的作用下，翻開DNADNA雙鏈雙鏈 l 在特定的復制起始點在特定的復制起始點l 以每條以每條DNADNA鏈為模板鏈為模板l 在在DNADNA聚合酶的催化下聚合酶的催化下l 以以4 4種脫氧核苷酸為前體物，合成種脫氧核苷酸為前體物，合成一條互補一條互補DNADNA鏈。鏈。lDNADNA的復制雙稱為半保管復制。的復制雙稱為半保管復制。DNA的復制的復制DNA在復制

18、起始點，由解旋酶翻開雙鏈，在復制起始點，由解旋酶翻開雙鏈，構(gòu)成復制叉，合成新鏈的方向為構(gòu)成復制叉，合成新鏈的方向為5-3端端前導鏈與后隨鏈前導鏈與后隨鏈后隨鏈的合成是不延續(xù)的。后隨鏈的合成是不延續(xù)的。 先合成先合成RNA引物引物 再合成不延續(xù)的小片段再合成不延續(xù)的小片段(岡崎片段，岡崎片段，1001000核苷酸長度核苷酸長度) 最后在最后在DNA銜接酶作用下，將小片段銜銜接酶作用下，將小片段銜接起，構(gòu)成完好的接起，構(gòu)成完好的DNA鏈。鏈。 DNA 半半 不不 連連 續(xù)續(xù) 復復 制制DNADNA的復制給了我們一些啟示的復制給了我們一些啟示 PCR PCR技術(shù)的原理：在體外要靠技術(shù)的原理：在體外要

19、靠溫度溫度(90(90以上以上) )打雙鏈，而不是打雙鏈，而不是解旋酶，也是以解旋酶，也是以DNADNA為模，需求為模，需求引物，需引物，需DNADNA聚合酶，需求聚合酶，需求dNTPdNTP為前體。為前體。PCRPCR與體內(nèi)與體內(nèi)( (細胞內(nèi)細胞內(nèi))DNA)DNA復制的最大差別是溫度。復制的最大差別是溫度。檢測核分裂指數(shù)：在細胞培育檢測核分裂指數(shù)：在細胞培育中，參與中，參與3H3H標志的標志的dNTPdNTP前體物，前體物，被細胞攝取后，參與被細胞攝取后，參與DNADNA復制，復制，復制速度越快，參入的復制速度越快，參入的3H3H標志的標志的dNTPdNTP越多，可用液閃計數(shù)儀檢測越多，可用

20、液閃計數(shù)儀檢測放射性強度，據(jù)此判別。放射性強度，據(jù)此判別。p遺傳信息的傳送是：遺傳信息的傳送是：p DNARNA DNARNA多肽多肽( (蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)) )p在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，RNARNA可構(gòu)成可構(gòu)成cDNAcDNA，然后再由然后再由RNARNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)p以上就是完好的中心法那么實際，亦可以上就是完好的中心法那么實際，亦可稱為基因的表達稱為基因的表達(expression)(expression)。中心法那么中心法那么中中 心心 法法 那么那么 轉(zhuǎn)錄(transcription) 以DNA為模板，合成RNA的過程。 非模板鏈稱為有意義鏈，而模板常稱為反義鏈。 轉(zhuǎn)錄的

21、過程大致是這樣的： 以DNA一條鏈為模板， 誘導RNA聚合酶活性、RNA聚合酶識別并結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點 以ATP、GTP、CTP和UTP為前體，合成(轉(zhuǎn)錄)RNA 當遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，轉(zhuǎn)錄即停頓。有意義鏈有意義鏈反義鏈反義鏈轉(zhuǎn)錄后的初級產(chǎn)物剪切掉內(nèi)含子，并將外顯轉(zhuǎn)錄后的初級產(chǎn)物剪切掉內(nèi)含子，并將外顯子銜接起來，這樣才干變成成熟的子銜接起來，這樣才干變成成熟的RNARNA分子分子還需求在還需求在5 5- -端加一個特殊的核苷酸，端加一個特殊的核苷酸，7-7-甲甲基鳥嘌呤核苷酸，這個過程叫戴帽基鳥嘌呤核苷酸，這個過程叫戴帽另外，另外，mRNAmRNA的，這一過程又叫穿靴，的，這一過程又叫穿靴，

22、3 3- -端端還要加上一串腺苷酸還要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)(AMP)poly(A)或多聚腺苷或多聚腺苷酸化。酸化。同一機體不同的細胞具有一樣的同一機體不同的細胞具有一樣的DNADNA或基因，或基因，但基因在不同細胞的表達是不同的，具有組織但基因在不同細胞的表達是不同的，具有組織特異性，使不同的細胞具有不同的功能特異性，使不同的細胞具有不同的功能由由RNA RNA 蛋白質(zhì)的過程，又叫翻譯。只需聚合蛋白質(zhì)的過程，又叫翻譯。只需聚合酶酶IIII催化的反響產(chǎn)物是催化的反響產(chǎn)物是mRNAmRNA，而只需，而只需mRNAmRNA才翻譯才翻譯成蛋白質(zhì)。成蛋白質(zhì)?；蚧?DNA)(DNA)

23、上三個相鄰的堿基組成一個密碼子，上三個相鄰的堿基組成一個密碼子，一個密碼子決議一種特定的氨基酸，共有一個密碼子決議一種特定的氨基酸，共有43=6443=64個密碼子。個密碼子。在轉(zhuǎn)錄過程中，基因上的三聯(lián)密碼子轉(zhuǎn)錄成在轉(zhuǎn)錄過程中，基因上的三聯(lián)密碼子轉(zhuǎn)錄成mRNAmRNA上的三聯(lián)密碼子。上的三聯(lián)密碼子。mRNAmRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細胞漿中的核糖體上，以三由核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細胞漿中的核糖體上，以三聯(lián)密碼子指點合成蛋白質(zhì)。聯(lián)密碼子指點合成蛋白質(zhì)。翻譯后的蛋白質(zhì)需求加工修飾。翻譯后的蛋白質(zhì)需求加工修飾。 中心法那么給了我們一些啟示：中心法那么給了我們一些啟示：遺傳信息由遺傳信息由DNADNA上的基因決議。一旦

24、基上的基因決議。一旦基因發(fā)生突變，將最終導致所翻譯的蛋白質(zhì)因發(fā)生突變，將最終導致所翻譯的蛋白質(zhì)發(fā)生改動，從而導致生理功能改動，甚至發(fā)生改動，從而導致生理功能改動，甚至出現(xiàn)疾病，如癌癥、肥胖等。出現(xiàn)疾病，如癌癥、肥胖等。 mRNA mRNA更能準確簡便地反映更能準確簡便地反映DNADNA上基因所上基因所攜帶的遺傳信息。因此對基因序列的分析，攜帶的遺傳信息。因此對基因序列的分析，常分析常分析mRNAmRNA的序列即可。的序列即可。 基因的表達有組織特異性，且受許多要素的影響，使mRNA的表達加強、降低甚至封鎖，從而影響機體正常生理功能，甚至出現(xiàn)疾病。因此常需求檢測mRNA的表達的豐度(含量)，常用

25、方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Real time)PCR等。這里需求特別強調(diào)：在檢測mRNA(或蛋白)表達時，一定要先弄清該基因在某種組織中能否有表達。 根據(jù)中心法那么，可以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下構(gòu)成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 根據(jù)mRNA的3端有poly(A)的特點，在進展反轉(zhuǎn)錄時，就以poly(A)為模板設(shè)計了引物。并且純化mRNA的方法，也是根據(jù)poly(A)的原理設(shè)計的。根據(jù)最后的翻譯蛋白質(zhì)去向的不同，建立不同的蛋白質(zhì)提取方法，如在線粒體，在細胞核、在細胞漿、分泌到血液中。 2基因表達調(diào)控 以乳糖支配子學說為例 乳糖支配子的根本組成元件 調(diào)理

26、基因調(diào)理基因 構(gòu)造基因構(gòu)造基因 I P O I P O 抑制基因抑制基因(I) ：是阻遏物編碼區(qū)：是阻遏物編碼區(qū)啟動基因啟動基因(P) ：有：有cAMP受體蛋白受體蛋白(CRP) 和和RNA聚合酶的結(jié)合位聚合酶的結(jié)合位點點支配基因支配基因(O)：是阻遏物結(jié)合位點：是阻遏物結(jié)合位點 ：-半乳糖苷酶構(gòu)造基因半乳糖苷酶構(gòu)造基因：透過酶構(gòu)造基因：透過酶構(gòu)造基因：轉(zhuǎn)乙酰酶的構(gòu)造基因：轉(zhuǎn)乙酰酶的構(gòu)造基因調(diào)理方式調(diào)理方式 當乳糖當乳糖時時,cAMP,cAMP含量增高含量增高 cAMPcAMP與與CAP (CAP (分解產(chǎn)物激活劑蛋白分解產(chǎn)物激活劑蛋白) )結(jié)合成結(jié)合成CRPCRP該復合物與啟動基因上對應的位

27、點該復合物與啟動基因上對應的位點結(jié)合后結(jié)合后使使DNADNA雙鏈不穩(wěn)定；隨后雙鏈不穩(wěn)定；隨后RNARNA聚合酶聚合酶那么容易與啟動基因嚴密結(jié)合；假那么容易與啟動基因嚴密結(jié)合；假設(shè)此時支配基因上無阻遏物，那么設(shè)此時支配基因上無阻遏物，那么基因被翻開基因被翻開RNARNA聚合酶從聚合酶從DNADNA的的5 5端開場滑動，端開場滑動，即開場轉(zhuǎn)錄，并合成了即開場轉(zhuǎn)錄，并合成了3 3種酶。種酶。當葡萄糖當葡萄糖cAMPCRPRNA聚合酶那么不能與啟動基因結(jié)合，聚合酶那么不能與啟動基因結(jié)合，也就不能轉(zhuǎn)錄和合成也就不能轉(zhuǎn)錄和合成3種酶。種酶。抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成妨礙蛋白，并與抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成妨礙蛋白，并

28、與支配基因結(jié)合支配基因結(jié)合,阻止阻止RNA聚合酶滑動而抑聚合酶滑動而抑制轉(zhuǎn)錄。這種情況又稱為負調(diào)理制轉(zhuǎn)錄。這種情況又稱為負調(diào)理假設(shè)阻遏蛋白與誘導物結(jié)合假設(shè)阻遏蛋白與誘導物結(jié)合(此處為乳此處為乳糖糖) 。那么這個復合物不能與支配基因結(jié)。那么這個復合物不能與支配基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄和翻譯就能進展。合，轉(zhuǎn)錄和翻譯就能進展。 u支配子學說擴展了基因的概念。即構(gòu)支配子學說擴展了基因的概念。即構(gòu)造基因和調(diào)理基因造基因和調(diào)理基因u調(diào)理基因發(fā)揚正、負調(diào)理受細胞內(nèi)外調(diào)理基因發(fā)揚正、負調(diào)理受細胞內(nèi)外環(huán)境要素的影響。構(gòu)成了基因調(diào)控和表環(huán)境要素的影響。構(gòu)成了基因調(diào)控和表達的概念。達的概念。u基因表達調(diào)控實際，不僅有助于了解

29、基因表達調(diào)控實際，不僅有助于了解生命景象的本質(zhì)，而且對基因工程的建生命景象的本質(zhì)，而且對基因工程的建立是至關(guān)重要。立是至關(guān)重要。 3DNA重組(基因工程)基因工程的兩個重要工具：一是內(nèi)切酶，能特異地識別DNA的堿基序列，并在DNA鏈當中將DNA切開。二是載體，如質(zhì)粒、噬菌體、病毒。載體的共同特點： 環(huán)狀DNA；都能專注感染某一類細胞；具有某種選擇性標志；都具有一些內(nèi)切酶位點；都能隨著染色體的復制而復制，隨著細胞分裂而擴增。 基因工程的根本程序：基因工程的根本程序： 獲得所需求的目的基獲得所需求的目的基因；因； 將目的基因同載體銜將目的基因同載體銜接；接； 再將這個重組環(huán)狀再將這個重組環(huán)狀DNA

30、引入受體細胞引入受體細胞(或稱或稱寄主細胞寄主細胞)； 使目的基因得以表達，使目的基因得以表達，即基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白即基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)。質(zhì)。第二節(jié) 核酸的提取技術(shù)extractive technique of nucleic acid 1. 結(jié)合形狀結(jié)合形狀 2.形狀：分線形和環(huán)形；分雙鏈和單鏈形狀：分線形和環(huán)形；分雙鏈和單鏈 3.分布：分布： DNA分布在細胞核和細胞；分布在細胞核和細胞； RNA 分布在細胞質(zhì)、細胞核和細胞器分布在細胞質(zhì)、細胞核和細胞器一核酸在細胞中的存在形狀和分布一核酸在細胞中的存在形狀和分布二核酸分別提取的原那么、要求 1.原那么：(1)應保證核酸一級構(gòu)造的完好

31、性； (2)排除其它分子的污染，純度要高。 2.對于核酸純度的要求： (1)對于核酸樣品中不應存在對酶有抑制造用 的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； (2)其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子 污染應降低到最低程度； (3)排降其它核酸分子的污染，如提取DNA時， 應去除RNA，反之亦然。 3.3.本卷須知本卷須知 (1)(1)盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害要素對核酸的破壞以減少各種有害要素對核酸的破壞(2)(2)減少化學要素對核酸的降解，為防減少化學要素對核酸的降解，為防止過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的止過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的 破壞

32、，操作多在破壞，操作多在pH4pH41010條件下進展。條件下進展。(3)(3)減少物理要素對核酸的降解。物理減少物理要素對核酸的降解。物理要素主要是機械剪切力，其次是高溫。要素主要是機械剪切力，其次是高溫。機械剪切力主要來源于溶液的快速振蕩，機械剪切力主要來源于溶液的快速振蕩，攪拌等。常規(guī)操作溫度為攪拌等。常規(guī)操作溫度為0 044。(4)(4)防止生物要素對核酸的降解。細胞防止生物要素對核酸的降解。細胞內(nèi)外均存在核酸酶，尤其是內(nèi)外均存在核酸酶，尤其是RNARNA酶存在酶存在廣泛、穩(wěn)定，極易降解核酸。因此提取廣泛、穩(wěn)定，極易降解核酸。因此提取過程中，應留意采用核酸酶抑制劑和破過程中，應留意采用

33、核酸酶抑制劑和破壞方法。壞方法。 (三)DNA的提取、純化 真核細胞染色體DNA的制備(提取、純化) 根據(jù)不同的實驗要求，可有不同的DNA提取方法，如酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒纏繞法，異丙醇沉淀法等。但這些方法在根本原理及大致步驟上是根本一樣的。而且酚抽提法比較經(jīng)典常用，下面就以此方法為例進展引見。 酚抽提法 酚抽提法的根本原理：用SDS和蛋白酶K破壞和消化細胞用酚去除水相中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)經(jīng)過鹽和乙醇沉淀獲得DNA。 試劑：試劑： 1 1 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液PBSPBS 2 DNA 2 DNA抽提緩沖液：抽提緩沖液： 10mmol/L Tris.cl ( 10mmol/L Tr

34、is.cl (緩沖溶液的緩沖溶液的pHpH值，值，pH8.0)pH8.0)。 0.1mol/L EDTA( 0.1mol/L EDTA(金屬離子絡(luò)合劑，金屬離子絡(luò)合劑，可抑制可抑制DNADNA聚合酶活性聚合酶活性) )。 20g/ml 20g/ml 胰胰RNARNA酶酶( (破壞降解破壞降解RNA)RNA) 0.5% SDS( 0.5% SDS(外表活性劑，破壞細外表活性劑，破壞細胞胞) ) 。 蛋白酶蛋白酶K (K (消化細胞、破壞細胞消化細胞、破壞細胞) )320mg/ml蛋白酶蛋白酶K，消化細胞，破壞細胞，消化細胞，破壞細胞4酚用酚用0.5 mol/L TrisCl，pH 8.0飽和，飽

35、和，主要作用是沉淀蛋白質(zhì)等主要作用是沉淀蛋白質(zhì)等510 mol/L NH4Ac，其作用是沉淀，其作用是沉淀DNA6乙醇，其作用是沉淀乙醇，其作用是沉淀DNA7TETris和和EDTA混合液，是溶解保管混合液，是溶解保管DNA的最好溶液的最好溶液8透析液：透析液： 50 mmol/L TrisCl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA，pH 8.0 樣品前處置 (1)生物組織：新穎的生物組織，先用剪切刀去除組織中筋膜等結(jié)締組織，吸干血液。假設(shè)不能馬上進展DNA提取，可將生物組織儲存于液氮中或-70冰箱中。a.取13g左右的組織，用8層紗布包好，外層再包多層牛皮紙，浸入液氮中使組織結(jié)凍，取出

36、后用木錘將其敲碎。b.將敲碎的組織放入搪瓷研缽中，參與少許液氮，用研杵碾磨。需反復添加液氮。C.C.在離心管中參與在離心管中參與10ml DNA10ml DNA抽提液，用玻璃抽提液，用玻璃棒邊攪動邊參與組織粉末，然后棒邊攪動邊參與組織粉末，然后3737保溫保溫1 1小小時。時。( (先加抽提液，后加組織粉末，有利于充先加抽提液，后加組織粉末，有利于充分溶解，用玻璃棒而不用金屬棒，減小損傷分溶解，用玻璃棒而不用金屬棒，減小損傷DNADNA的機率，的機率，3737保溫保溫1 1小時，一方面有利于小時，一方面有利于SDSSDS破壞細胞，更主要是為了使溶液平衡溫度破壞細胞，更主要是為了使溶液平衡溫度到

37、達到達3737，為下一步反響預備適宜條件，為下一步反響預備適宜條件) )。 (2)(2)培育的細胞培育的細胞 a. a.搜集細胞，懸浮培育搜集細胞，懸浮培育( (生長生長) )的細的細胞；可以直接經(jīng)胞；可以直接經(jīng)1500g1500g離心離心(4,10(4,10分分鐘鐘) )，以搜集細胞；貼壁生長的細胞，以搜集細胞；貼壁生長的細胞，用胰酶消化后再離心搜集。細胞數(shù)應用胰酶消化后再離心搜集。細胞數(shù)應在在5 5107107左右。左右。 b. b.漂洗細胞，將離心沉淀的細胞用漂洗細胞，將離心沉淀的細胞用冰預冷的冰預冷的PBSPBS液或生理鹽水，漂洗液或生理鹽水，漂洗1 1次次再離心，棄上清搜集細胞。可反

38、復漂再離心，棄上清搜集細胞?？煞磸推聪?-21-2次次( (目的去除培育液成分和細胞目的去除培育液成分和細胞分泌的蛋白分泌的蛋白) ) c. c.保溫，再用保溫，再用10ml DNA10ml DNA抽提液將細抽提液將細胞沉淀懸浮，并在胞沉淀懸浮，并在3737保溫保溫1 1小時。小時。 (1)消化 向上述預處置好的樣品溶液中(樣品溶解在DNA抽提液并保溫1小時)，參與20mg/ml的蛋白酶K，至終濃度為100g/ml，邊加邊用玻璃棒悄然攪拌，使溶液至粘稠狀(細胞破裂，蛋白、核酸釋放)。將反響液在50水浴上，保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時悄然搖勻反響液。 DNADNA提取步驟提

39、取步驟(2)(2)加酚混勻加酚混勻 將反響液冷卻至室溫，參與等將反響液冷卻至室溫，參與等容積已飽和的酚溶液，悄然地上下轉(zhuǎn)動離心容積已飽和的酚溶液，悄然地上下轉(zhuǎn)動離心管，混勻兩相，反復該動作管，混勻兩相，反復該動作10min10min，直至水相，直至水相與酚相混勻并成乳狀液。假設(shè)沒有到達這種與酚相混勻并成乳狀液。假設(shè)沒有到達這種效果，可用多角度振蕩器溫暖地混勻效果，可用多角度振蕩器溫暖地混勻1 1小時小時(3)(3)離心離心 室溫室溫5000g5000g，離心，離心15min15min，使兩相分，使兩相分開開( (水相在上層，酚相在下層水相在上層，酚相在下層) )，(DNA(DNA在水相，在水相

40、，因水溶性，帶負電荷因水溶性，帶負電荷) )。(4)(4)取上層水相用酚反復抽提兩次，取上層水取上層水相用酚反復抽提兩次，取上層水相時，運用大口徑相時，運用大口徑(0.3cm)(0.3cm)吸管，因水相粘稠吸管，因水相粘稠 (5)(5)又分兩種情況又分兩種情況 a. a.透析處置：為提取大分子量透析處置：為提取大分子量DNA(200KbDNA(200Kb以以上上) )，在第，在第3 3次酚抽提后，將次酚抽提后，將DNADNA溶液裝入透析溶液裝入透析袋中，并放入袋中，并放入44透析液中。每次透析液透析液中。每次透析液1 1升，升，換換4 4次透析液，直至透析物次透析液，直至透析物OD270OD2

41、70小于小于0.050.05，才，才算透析終了。算透析終了。b.b.沉淀處置，對于沉淀處置，對于100100150Kb150Kb大小的大小的DNADNA提取，提取，在第三次酚抽提后，將上層水相移入一個新的在第三次酚抽提后，將上層水相移入一個新的離心管中，參與離心管中，參與0.20.2倍容積的倍容積的10mol/L10mol/L乙酸銨和乙酸銨和2 2倍容積倍容積95%95%乙醇。室溫下悄然搖動，立刻就可乙醇。室溫下悄然搖動，立刻就可看到乳白色絲狀沉淀出現(xiàn)，用一個前端為鉤狀看到乳白色絲狀沉淀出現(xiàn)，用一個前端為鉤狀的玻璃棒的玻璃棒( (挑挑) )出出DNADNA纖維，立刻放入纖維，立刻放入70%70

42、%乙醇中乙醇中漂洗漂洗2 2次。室溫次。室溫5000g5000g，離心，離心5min5min，棄上清。室，棄上清。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。但留意不要使溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。但留意不要使DNADNA沉淀完沉淀完全枯燥。然后加全枯燥。然后加TE(pH8.0)TE(pH8.0)溶解溶解DNA 12DNA 1224h 24h 。(6)(6)測定樣品在測定樣品在260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值，值，計算計算DNADNA含量和含量和A260/A280A260/A280比值。比值。 260nm 260nm處，是核酸的最大吸收波長，處，是核酸的最大吸收波長，在在280nm280nm處是蛋白質(zhì)

43、最大吸收波長。處是蛋白質(zhì)最大吸收波長。 在在260nm260nm紫外線下，紫外線下，1OD1OD的光密度值相的光密度值相當于雙鏈當于雙鏈DNADNA濃度為濃度為50g/ml50g/ml；單鏈；單鏈DNADNA或或RNARNA為為40g/ml40g/ml。因此根據(jù)核酸的。因此根據(jù)核酸的ODOD值，計算核酸樣品的濃度或含量。值，計算核酸樣品的濃度或含量。n根據(jù)根據(jù)A260/A280A260/A280比值，可判別所提取核酸比值，可判別所提取核酸(DNA)(DNA)的的純度。純度。DNADNA純度比較理想的比值是純度比較理想的比值是1.81.8，RNARNA比值是比值是2.02.0。假設(shè)。假設(shè)DNAD

44、NA比值高于比值高于1.81.8，闡明有，闡明有RNARNA的污染，的污染，低于低于1.81.8或或1.751.75，那么以為是蛋白質(zhì)或酚污染。，那么以為是蛋白質(zhì)或酚污染。RNARNA比值小于比值小于2.02.0，那么以為也是蛋白質(zhì)或酚的污，那么以為也是蛋白質(zhì)或酚的污染。染。nDNADNA樣品純度不符合要求樣品純度不符合要求( (尤其是尤其是A260/A280A260/A280比值比值小于小于1.81.8時時) )n 可用酚或酚可用酚或酚/ /氯仿和氯仿抽提氯仿和氯仿抽提2-32-3次，次，n 用乙醚除去殘留氯仿，再揮掉乙醚。用乙醚除去殘留氯仿，再揮掉乙醚。n 最后用鹽和乙醇沉淀，用最后用鹽和

45、乙醇沉淀，用TETE溶解。溶解。 本方法需求闡明的幾點：(1) 5107細胞提取產(chǎn)量為200g左右。(2)對于上層水相比較粘稠，汲取上層水相時，會牽動兩相之間的蛋白質(zhì)沉淀層。此時可用吸管插到管底汲取酚相(采用負壓)，至蛋白質(zhì)層時，停頓。并離心(5000g,20分鐘)，沉淀蛋白質(zhì)，汲取上清液。(3)由于0.5% SDS的存在，可抑制部分胰RNA酶活性，故應加大該酶用量，普通為20 g/ml(4)所用酚，應重蒸酚，并用水飽和。四四RNA的分別與純化的分別與純化1. 1. 發(fā)明一個無發(fā)明一個無RNARNA酶酶(RNase)(RNase)的環(huán)境的環(huán)境RNARNA酶在環(huán)境中無處不在：空氣中灰塵、微酶在環(huán)

46、境中無處不在：空氣中灰塵、微生物，人體汗液、唾液，以及各種器皿和生物，人體汗液、唾液，以及各種器皿和試劑等，均存在試劑等，均存在RNase RNase 。RNaseRNase非常穩(wěn)定，耐熱、耐酸，耐堿。蛋白非常穩(wěn)定，耐熱、耐酸，耐堿。蛋白量變性劑可使之暫時失活。量變性劑可使之暫時失活。 RNaseRNase活性不需求輔助因子，因此活性不需求輔助因子，因此EDTAEDTA對此對此酶無抑制造用。酶無抑制造用。 (1)去除外源性RNase的污染空氣中的細菌、霉菌等微生物都含有RNase，所以整個操作過程應在比較清潔的環(huán)境中進展。因此有必要對操作場所的空氣進展消毒。操作者操作應戴口罩和手套、帶帽子。玻

47、璃器皿常規(guī)洗凈后，運用0.1%DEPC(二乙基焦碳酸鹽)浸泡處置(37，2h)，再用滅菌去離子水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250烘烤4h以上或200干烤過夜。塑料器材最好運用滅菌的一次性塑料用塑料器材最好運用滅菌的一次性塑料用品。品。EppendorfEppendorf管，微量加樣吸頭最好是新管，微量加樣吸頭最好是新的，運用前進展高壓消毒。的，運用前進展高壓消毒。一切溶液應加一切溶液應加DEPCDEPC至至0.05-0.1%0.05-0.1%，室溫過，室溫過夜，然后高壓消毒。以去除殘留的夜，然后高壓消毒。以去除殘留的DEPCDEPC。RNARNA提取所用的酚，應單獨配制和運用。提取所

48、用的酚，應單獨配制和運用。配制飽和酚鹽溶液時，運用的水應預先以配制飽和酚鹽溶液時，運用的水應預先以DEPCDEPC處置且高壓消毒，酚飽和以后，參與處置且高壓消毒，酚飽和以后，參與8-8-羥基喹啉至羥基喹啉至0.1%0.1%。8-8-羥喹啉不但抗氧化，羥喹啉不但抗氧化，而且有一定的而且有一定的RNARNA酶抑制造用。酶抑制造用。 DEPCDEPC的分子式為的分子式為C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5二乙二乙基焦碳酸鹽。是一種粘性液體，對核酸酶有很強基焦碳酸鹽。是一種粘性液體，對核酸酶有很強的抑制造用。的抑制造用。作用機制是經(jīng)過與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)

49、合，使作用機制是經(jīng)過與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白量變性。蛋白量變性。DEPCDEPC又能與又能與RNARNA或單鏈或單鏈DNADNA反響，破壞單鏈核酸反響，破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤，但它破壞單鏈核酸的濃度要比中大部分腺嘌呤，但它破壞單鏈核酸的濃度要比使蛋白量變性的濃度大使蛋白量變性的濃度大100-1000100-1000倍。倍。運用運用DEPCDEPC的一個原那么是，在到達運用目的后，的一個原那么是，在到達運用目的后，普通要高溫處置以便破壞除掉普通要高溫處置以便破壞除掉DEPCDEPC，使，使DEPCDEPC不與不與RNARNA接觸。接觸。 pDEPCDEPC可與可與TrisTris發(fā)生反

50、響，分解成發(fā)生反響，分解成CO2CO2和和乙醇，使乙醇，使pHpH值下降所以要去除值下降所以要去除p配制配制TrisTris溶液時，先將所用水用溶液時，先將所用水用DEPCDEPC處處置高壓消毒置高壓消毒p配完配完TrisTris溶液后，再經(jīng)高壓消毒。溶液后，再經(jīng)高壓消毒。pDEPCDEPC與肝素結(jié)合運用，加強運用效果。與肝素結(jié)合運用，加強運用效果。pDEPCDEPC應在應在44或液氮中保管，以防降解。或液氮中保管，以防降解。 (2)抑制內(nèi)源性RNase的活性。細胞裂碎的同時，RNase釋放出來。原那么上應盡早去除細胞內(nèi)蛋白，參與RNase抑制劑，力爭在提取的起始階段對RNase活力進展有效地

51、抑制。不同組織細胞中內(nèi)源性RNase的數(shù)量不同，胰腺、脾組織細胞中RNase的含量極為豐富，在對這些組織提取RNA時，更要運用強有力的RNase抑制劑。 抑制劑可分為以下幾類：抑制劑可分為以下幾類： 低特異性低特異性RNaseRNase抑制劑，如皂抑制劑，如皂土、復合硅酸鹽、肝素、多胺等，土、復合硅酸鹽、肝素、多胺等，因作用較弱，現(xiàn)已不大運用。因作用較弱，現(xiàn)已不大運用。去除蛋白質(zhì)物質(zhì)去除蛋白質(zhì)物質(zhì) 蛋白量變性劑，蛋白蛋白量變性劑，蛋白K K、陰離、陰離子去污劑，常與子去污劑，常與RNARNA酶抑制劑結(jié)酶抑制劑結(jié)合運用，以加強對合運用，以加強對RNaseRNase的抑制的抑制造用。凡能破壞蛋白質(zhì)

52、的物質(zhì)，造用。凡能破壞蛋白質(zhì)的物質(zhì)，對對RNaseRNase均有一定作用，由于酶均有一定作用，由于酶本身就是蛋白質(zhì)。本身就是蛋白質(zhì)。 a.a.酚、氯仿酚、氯仿 這類有機溶劑不但能使核蛋白與核這類有機溶劑不但能使核蛋白與核酸解聚酸解聚( (但不能破壞核酸但不能破壞核酸) )，而且對蛋白質(zhì)有變性，而且對蛋白質(zhì)有變性作用。因此對酶作用。因此對酶(RNase)(RNase)有抑制造用。酚不能完有抑制造用。酚不能完全抑制全抑制RNaseRNase活性，但酚普通都參與了活性，但酚普通都參與了8 8羥基喹羥基喹啉啉( (一種抗氧化劑，一種指示劑一種抗氧化劑，一種指示劑) )，因此加強了對，因此加強了對RNa

53、seRNase的抑制效果。氯仿的抑制效果比較強，因的抑制效果。氯仿的抑制效果比較強，因此酚與氯仿常結(jié)合運用。此酚與氯仿常結(jié)合運用。 蛋白酶蛋白酶K K也能抑制也能抑制RNaseRNase活性。有一種情況挺活性。有一種情況挺特殊，即該酶在特殊，即該酶在1 12 2的的SDSSDS存在下，其活性反存在下，其活性反而會添加。而會添加。 b.去污劑 包括SDS(十二烷基硫酸鈉)，十二烷酰肌氨酸鈉，脫氧膽酸鈉等陰離子去污劑。這些陰離子去污劑可使核酸與蛋白質(zhì)解聚，并可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上帶正電荷的基團結(jié)合，在高濃度KCl存在下，構(gòu)成SDS蛋白質(zhì)復合物而沉淀。 c.解偶劑胍類鹽酸胍，異硫氰酸胍，作用非常強的一種蛋

54、白變性劑，可完全破壞蛋白質(zhì)二級構(gòu)造，從而使細胞構(gòu)造降解，核酸與核蛋白分別，所以又稱解偶劑。 RNase的特異抑制劑a. RNase阻抑蛋白(RNasin)，是一種酸性糖蛋白可與RNase以非共價鍵的方式結(jié)合，從而抑制RNase活性， RNasin最好不與蛋白量變性劑一同運用，因變性劑亦可破壞RNasin ，從而使其喪失作用。但可與二巰基乙醇一同運用，可加強RNasin的運用效果。b.氧釩核糖核苷復合物，這也是一種RNase特異性抑制劑，幾乎可完全抑制RNase的活性。 為到達完全、徹底抑制RNase活性的目的，常結(jié)合運用，而且有些抑制劑(去除蛋白質(zhì)物質(zhì))普通有4種作用；破壞細胞膜，使核酸與蛋白

55、質(zhì)分別，沉淀蛋白質(zhì)、抑制RNase活性。因此幾乎包括了RNA提取、分別、純化的一切目的。 2.RNA的分別、提取方法步驟： (1)發(fā)明一個無RNase環(huán)境； (2)組織或細胞的勻漿，同時得參與RNase抑制劑 (3)裂解細胞； (4)去除蛋白、DNA等大分子物質(zhì)； (5)沉淀RNA； (6)漂洗； (7)溶解RNA。 酚：使核酸與核蛋白分別、變性沉淀蛋酚：使核酸與核蛋白分別、變性沉淀蛋 白質(zhì)，抑制白質(zhì)，抑制RNaseRNase活性。活性。異硫氰酸胍：破壞裂解細胞，使核酸與核蛋白分別，異硫氰酸胍：破壞裂解細胞，使核酸與核蛋白分別，變性沉淀蛋白質(zhì)，同是具有很強的變性沉淀蛋白質(zhì)，同是具有很強的RNa

56、seRNase抑制造用。抑制造用。這是一個關(guān)鍵的試劑，由于它是萬能的，所以實驗這是一個關(guān)鍵的試劑，由于它是萬能的，所以實驗步驟變得簡單。步驟變得簡單。TrizolTrizol試劑盒所提供的試劑：試劑盒所提供的試劑：本人需求配制的試劑本人需求配制的試劑氯仿：蛋白量變性作用，加強對氯仿：蛋白量變性作用，加強對RNaseRNase抑抑制造用。制造用。異丙醇：沉淀異丙醇：沉淀RNARNA。7575乙醇：漂洗、去除鹽、殘留有機溶乙醇：漂洗、去除鹽、殘留有機溶劑等雜質(zhì)。劑等雜質(zhì)。無無RNaseRNase水或水或0.5%SDS0.5%SDS溶液溶液( (后者較好后者較好)()(必必需用需用DEPCDEPC處

57、置處置) )。 勻漿化勻漿化 a. a.組織：取組織：取50-100mg50-100mg組織放在勻漿管中，加組織放在勻漿管中，加1ml 1ml TrizolTrizol試劑，然后進展勻漿，此時裂解細胞和試劑，然后進展勻漿，此時裂解細胞和RNaseRNase抑抑制同時進展。制同時進展。 b. b.貼壁生長細胞：倒掉培育液，然后直接向培育貼壁生長細胞：倒掉培育液，然后直接向培育瓶瓶( (皿皿) )中參與中參與TrizolTrizol試劑試劑( (按按10cm210cm2加加1ml Trizol1ml Trizol試劑試劑計算參與量計算參與量) )。 c. c.懸浮生長細胞：離心搜集細胞，然后參與懸

58、浮生長細胞：離心搜集細胞，然后參與TrizolTrizol試劑按試劑按5 51010106106或或1 1107107細菌參與細菌參與1ml1ml比例計比例計算參與量算參與量) )。操作步驟操作步驟兩相分別兩相分別 將勻漿化的樣品在將勻漿化的樣品在15153030環(huán)境中放置環(huán)境中放置5min5min，以便核酸蛋白復合物充分解聚。加以便核酸蛋白復合物充分解聚。加TrizolTrizol試劑之試劑之前，樣品一定要堅持低溫，防止前，樣品一定要堅持低溫，防止RNase RNase 發(fā)揚作用，發(fā)揚作用，在研磨過程中可加液氮然后按每在研磨過程中可加液氮然后按每1ml Trizol1ml Trizol試劑試

59、劑參與參與0.2ml0.2ml氯仿的比例參與氯仿。蓋緊試管蓋，用氯仿的比例參與氯仿。蓋緊試管蓋，用手猛烈振蕩手猛烈振蕩1515秒，之后在秒，之后在15153030條件保溫條件保溫2 23min3min。離心：。離心：12000g12000g離心離心15min15min，離心時溫度要控，離心時溫度要控制在制在2288。12000g12000g離心是一個關(guān)鍵步驟，也離心是一個關(guān)鍵步驟，也是該方法獨到之處，可將蛋白質(zhì)，是該方法獨到之處，可將蛋白質(zhì)，DNADNA等大分子沉等大分子沉淀淀) )。離心之后，就會構(gòu)成三相：下層是紅色的酚。離心之后，就會構(gòu)成三相：下層是紅色的酚和氯仿含有蛋白質(zhì)和和氯仿含有蛋白

60、質(zhì)和DNADNA；中間層是白色的；中間層是白色的DNADNA和蛋白質(zhì)沉淀；上層是水相，和蛋白質(zhì)沉淀；上層是水相，RNARNA就在此層，水相就在此層，水相大約占總體積的大約占總體積的6060 RNA沉淀 將水相轉(zhuǎn)移到一個新的試管中，并參與異丙醇混勻，參與量按每ml Trizol試劑加0.5ml異丙醇計。在1530條件下，保溫10min。然后在28條件下，12000g離心10min，此時就會在管底或底部邊上出現(xiàn)RNA沉淀，離心之前，RNA沉淀通常看不見，離心之后經(jīng)常可看見膠樣沉淀。 RNA漂洗 移去上清液，參與75乙醇至少1ml，渦旋振動幾次，然后以7500g離心5min(溫度28)，又可構(gòu)成RN