1、一種新的乙肝診斷血清免疫學目的乙肝病毒大蛋白 美國ab大學乙型肝炎流行現(xiàn)狀乙型肝炎是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。全球60億人口中，約1/2人口生活在HBV高流行區(qū)，約20億人證明有HBV感染，34億人為HBV慢性感染，其中25%40% 最終將死于肝硬化和肝癌。全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡約75萬例 中國乙型肝炎流行現(xiàn)狀(一) HBeAg陰性活動期肝炎增多 (二) HBV變異株添加HBV的突變率較高， HBeAg陰性活動期肝炎臨床特點：(1) 轉為肝硬化和肝癌比例較大；(2) 與年齡相關：患者年齡較大；(3) 疾病自發(fā)或繼續(xù)減輕極少發(fā)生；(4) 何時停藥難以確定；(5) 治療后

2、復發(fā)率高。HBeAg陰性活動期肝炎HBeAg陰性乙肝與HBeAg陽性乙肝不同點：(1)慢性肝炎病情不減輕；(2)生化學和病毒學標志反復升高；(3) 可3040年無病癥；(4) 約45歲左右發(fā)生肝硬化；(5) 10年后約25%發(fā)生并發(fā)癥。 HBeAg陰性活動期肝炎HBeAg 陰性的慢性乙肝流行率升高緣由：(1) 繼續(xù)免疫壓力導致突變株選擇；(2)長期治療導致病毒變異；(3) 前C和C啟動子變異；(4) 檢測方法的靈敏度提高。 HBeAg陰性活動期肝炎HBeAg 陰性活動期肝炎臨床診斷現(xiàn)狀：(1) 傳統(tǒng)“兩對半目的不能反映此類患者HBV復制程度；(2) 缺乏指點合理治療的目的；(3) HBV DN

3、A檢測不易于各級醫(yī)療機構廣泛開展；(4) 臨床上急需可以反映HBV復制程度及指點治療的目的。 抗病毒治療效果監(jiān)測臨床上用于抗病毒治療的藥物干擾素核苷類似物 抗病毒治療效果監(jiān)測臨床上缺乏評價抗病毒治療效果的目的。以HBV DNA陰轉作為治療的終點不恰當，此時停藥病情易反復。 乙肝病毒實驗室檢測的缺陷 抗病毒治療效果評價血清學目的缺乏 臨床上評價抗乙肝病毒治療效果時存在一個很大的問題，即其評價目的主要是肝功能的改善與否、血清乙肝病毒DNA程度的變化以及肝組織的病理學改動等。誠然，這些目的對臨床醫(yī)生判別患者病情而言非常重要和適用，也是臨床醫(yī)生選用抗乙肝病毒藥物時的根據(jù)， 然而對于何時停用抗病毒藥物、

4、停用抗病毒藥物后乙肝病毒能否會重新復制活潑導致乙肝復發(fā)那么缺乏客觀而有效的目的。 乙型肝炎血清學診斷技術新突破乙肝病毒大蛋白HBV-LP前S區(qū) 酶免定量試劑盒 -直接定量檢測乙肝大蛋白 -不用分開檢測前S1和前S2HBV-LP診斷試劑新穎之處采用病毒樣顆粒制造針對構象構造的高活性抗體同時檢測前S1和前S2進展定量檢測，用于評價抗病毒治療效果和預后診斷HBeAg陰性活動期肝炎的獨一血清學目的評價治療效果及斷定治療終點獨一血清學目的大蛋白完全衰退意味患者預后良好乙肝病毒包膜蛋白研討進展1995-2004年 發(fā)現(xiàn)大蛋白前S區(qū)有復雜構象構造1996年 發(fā)現(xiàn)大蛋白具有反式激活病毒復制的作用2002年 發(fā)

5、現(xiàn)導致肝細胞病變及凋亡的主要緣由是大蛋白2004年 實驗室勝利構建針對構象型抗原的單克隆抗體2005年 國內(nèi)公司勝利研制乙肝外表抗原大蛋白酶聯(lián)免疫定量試劑盒Hepatitis B乙型肝炎HBV模型HBV包膜蛋白HBV的外表抗原的組成HBV病毒構呵斥分 HBV-LP與病毒復制親密相關HBV Dane 管形 球型 血流中的分布 L-HBs 大蛋白存在 存在 不含僅病毒復制期存在M-HBs中蛋白存在 存在 1%含量 非復制期少量存在S-HBs小蛋白存在 存在 存在 存在根據(jù)檢測血液中大蛋白的有無，判別病毒攜帶者體內(nèi)的HBV病毒能否在進展復制。乙肝病毒包膜蛋白 preS特性: 暴露在病毒顆粒外表高免疫

6、原性 參與了病毒與細胞受體的相互作用 誘導抗感染的維護性抗體的產(chǎn)生 Neurath AR, Kent SB, Strick N, Parker K. Delineation of contiguous determinants essential for biological functions of the pre-S sequence of the hepatitis B virus envelope protein: its antigenicity, immunogenicity and cell-receptor recognition. Ann Inst Pasteur Virol

7、. 1988 Jan-Mar;(1):13-38. 乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研討Prange R, Streeck RE. Novel transmembrane topology of the hepatitis B virus envelope proteins. EMBO J 1995; 14: 247- 256Lambert C.et al. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral lare envelope proteins J.General Virology 2004 85

8、,1221-1225.乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研討HBV病毒顆粒外表的PreS曾經(jīng)被證明具有獨立的構造域和天然構象很多研討努力于表達并觀測PreS的構造，但是極少勝利。其緣由是單獨表達的PreS很容易被蛋白酶所降解。(A)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER膜上乙肝大蛋白的拓撲構造模型 。 (B)病毒體包膜上的乙肝大蛋白的拓撲構造模型。Volker Bruss, Xuanyong Lu1, Reiner Thomssen and Wolfram H.Gerlich.Post-translational alterations in transmembrane topology of the hepatitis B

9、 virus large envelope protein. The EMBO Journal vol.13 no.10 pp.2273-2279, 1994乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研討HBV L包膜蛋白大蛋白的構造域和穿膜拓撲構造 A. 大蛋白的構成組分，含preS1、preS2及S構造 B. 大蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER膜上的拓撲構造Carsten Lambert, Sylvia Mann and Reinhild Prange. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral large envel

10、ope proteins. Journal of General Virology (2004), 85, 12211225乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研討 AA99169構成一個環(huán)狀構造，這一序列橫跨前S1和前S2，是其主要免疫表位。乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研討Volker Bruss Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid Virus Research 106 (2004) 199209 29 September 2004AA99169L蛋白i-pre-S方式的功能方式圖。黑點表示L蛋白pre-S構造 略去S和M蛋白分泌的

11、病毒體外表的e-pre-S構造很能夠具有結合病毒受體的功能。目前的數(shù)據(jù)顯示L蛋白的i-pre-S構造是一種蛋白矩陣，在病毒體的構成過程中擔任與核殼體相接觸，包裝外膜。VOLKER BRUSS* AND KERSTIN VIELUF. Functions of the Internal Pre-S Domain of the Large Surface Protein in Hepatitis B Virus Particle Morphogenesis. JOURNAL OF VIROLOGY, Nov. 1995, p. 66526657 Vol. 69, No. 11肝炎病毒物種特異性的感

12、染取決于病毒進入的程度，并由病毒L蛋白上的pre-S構造決議。 Arg 103和Ser 124之間的序列在不同的HBV之間是高度保守的。Arg 103和Ser 124之間的 pre-S序列對于HBV的構成具有重要功能。橫跨前和前之間乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研討VOLKER BRUSS. A Short Linear Sequence in the Pre-S Domain of the Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Required for Virion Formation. JOURNAL OF VIROLOGY, Dec. 1997

13、, p. 93509357 Vol. 71, No. 12TAKASHI ISHIKAWA AND DON GANEM. The pre-S domain of the large viral envelope protein determines host range in avian hepatitis B viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, pp. 6259-6263, July 1995 Determination of the Minimal Distance between the Matrix and Transmembra

14、ne Domains of the Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Journal of Virology, June 2005, p. 7918-7921, Vol. 79, No.120022-538X構成特殊的矩陣構造跨膜區(qū)，維持它們正常構造的最短間隔是個乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研討 Pre-S的反式激活作用乙肝病毒大分子外表抗原大蛋白是一種轉錄活化因子The hepatitis B virus large surface protein (LHBs) is a transcriptional activator. Virology

15、. 1996 Nov 1;225(1):235-9. Bruns M,Miska S,Chassot S,Will H. Enhancement of hepatitis B Virus infection by noninfections subviral particles.J Virol ,1998;76 ;1462-8. 乙肝鴨模型證明由大蛋白組裝成的亞病毒顆?？梢苑词郊せ畈《纠^續(xù)復制這個研討具有臨床意義,對于大蛋白陽性而DNA陰性患者容易停藥反跳具有參考意義.亞病毒顆粒上pre-S的反式激活作用原 文： Ultrastructural Analysis of Hepatitis B

16、Virus in HepG2-TransfectedCells With Special Emphasis on Subviral Filament Morphogenesis作 者： PHILIPPE ROINGEARD AND CAMILLE SUREAU作者單位： Laboratoire de Biologie Cellulaire, EP CNRS 117, Faculte de Medecine de Tours, 2 bis Boulevard Tonnelle,F-37032 Tours Cedex France. 發(fā)表刊物： HEPATOLOGY Vol. 28, No. 4,

17、 1998 在乙肝病毒感染的HepG2細胞中對亞病毒纖維體的形狀發(fā)生進展的超微構造分析大蛋白與肝細胞病變研討大蛋白的過量表達,管狀顆粒在細胞內(nèi)堆積,導致體外培育的細胞5天內(nèi)死亡Chisari等和Fernandes等曾經(jīng)證明，在轉基因小鼠中過量表達大的外表蛋白會使肝細胞凋亡并且產(chǎn)生慢性肝炎。然而，在他們模型中的這種損傷相對比較溫暖，沒有小鼠死于肝功能衰竭 .轉基因小鼠的肝細胞帶有這種蛋白L的積累滯留，那么會開展為細胞的損傷作用，它會誘導肝的再生，在這個模型中最終導致肝癌 大蛋白導致肝細胞病變研討大蛋白是導致FCH中肝細胞損傷,纖維化的主要緣由FCH與肝細胞內(nèi)大蛋白過量表達蛋白L的滯留也被發(fā)現(xiàn)和一

18、種獨特的綜合癥，即纖維淤膽性肝炎FCH相聯(lián)絡，它的特征為肝細胞的空氣球化和有著顯著的膽汁阻塞，但是它普通只需很少的炎癥發(fā)生，它發(fā)生于免疫抑制的乙肝攜帶者。來自于發(fā)生了FCH的病人的肝臟樣品，經(jīng)過電鏡察看發(fā)如今細胞內(nèi)膜系統(tǒng)中有著同樣的乙肝亞病毒包膜纖維體的積累。2002年國際肝病雜志實驗證明，表達的乙肝大外表蛋白致使培育的肝細胞在一些天內(nèi)死亡。乙肝大的外表蛋白會致使體外培育的細胞的液泡化和細胞凋亡。這些結果和FCH下的肝臟病理情況相當?shù)仡愃疲?國內(nèi)pre-S研討部分文獻一： Establishment and preliminery use of hepatitis B Virus Pre S1

19、/2 antigen assay World Journery of Gastroenterology 99年軍事醫(yī)學科學院所文獻二 xpression and purification of the complete preS region of hepatitis B Virus World Journal of Gastroenterology 2005年中科院上海生化和細胞所抗原表位目前生物科學領域，對天然表位的研討借助現(xiàn)代科學技術的提高，對表位曾經(jīng)有比較深化的認識。表位的構成方式至少有兩種：由某些氨基酸殘基按一定順序延續(xù)陳列組成的線狀序列，稱為順序sequential表位或線性(li

20、near)表位。順序表位是蛋白分子的一級構造，比較穩(wěn)定，不受蛋白質(zhì)加熱變性和空間構形改動的影響。由分子內(nèi)不延續(xù)的23個氨基酸殘基折疊陳列所構成的三維構造構成，稱為構象(conformational)表位；有時候，呈螺旋式陳列的延續(xù)肽鏈序列也可起到構象表位的作用。多肽無法模擬構象表位商品化的前S1 定性檢測試劑上市，其單抗是用AA21-47化學合成的多肽而制造的。而運用該多肽免疫制造的抗體在科研中就曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，只能檢測到微弱的抗-pre-S1抗體的產(chǎn)生多肽無法模擬構象表位Schodel等人曾以100ug的pre-S1(21-47)合成多肽免疫Balb/c小鼠，誘導生成的抗pre-s1抗體的滴度只需

21、160，上海生化所改良運用pre-S1-BSA偶聯(lián)復合物免疫Balb/c小鼠，也只能檢測到微弱的抗Pre-S1的活力， 目前臨床運用乙肝前S1以及前S2試劑大部分研討主要集中在前S1區(qū)、前S2區(qū)。研討闡明前S1區(qū)、前S2區(qū)蛋白及其抗體都與HBV-DNA、HBeAg、肝臟損害、乙肝的轉歸等都有極其親密的關系。臨床運用：前S1試劑、前S2試劑診斷的結果與HBV-DNA、HBeAg 三者之間有一定的關系，但符合率卻只需0%，甚至更低。楊海林等 完好病毒顆粒Dane顆粒標志物PreS1蛋白藥盒的研制 上海醫(yī)學檢驗雜志1995 vol.10:204-206楊海林等 抗乙肝炎病毒外表抗原PreS12047

22、多肽的制備、性質(zhì)和運用。生物化學與生物物理學報 1994 vol 26 145-151運用針對化學合成多肽的單克隆抗體，無法定量監(jiān)測，無法用于療效察看臨床運用年，靈敏度不理想，目前臨床運用乙肝前S1以及前S2試劑乙肝大蛋白定量診斷試劑運用構造生物學、蛋白晶體學的研討，研發(fā)出針對乙肝病毒前S區(qū)的構象型單抗，大大提高了乙肝病毒感染者中前S區(qū)抗原即LP大蛋白的檢出率，臨床運用闡明大蛋白的檢出率與血液中病毒DNA的符合率高度符合90%。比原來的前S1試劑效果大大提高，可作為病毒復制的一個目的。乙肝大蛋白re-S抗原蛋白晶體構造HBV-lp晶體構造空間模型針對大蛋白構象表位單抗研制簡要過程本方法是我們曾

23、經(jīng)懇求的專利的一部分獲得體外重組的PRE-S抗原獲得多抗，親和層析從強陽性標本中獲得病毒樣顆粒病毒樣顆粒制造抗體大蛋白試劑臨床研討1、HBV DNA陽性標本中HBVLP的陽性符合率考 核 單 位HBV DNA（）HBVLP（）例（次）數(shù)例（次）數(shù)比例（）北京地壇醫(yī)院126825494.78北京地壇醫(yī)院2（治療系列）115214998.03解放軍傳染病研究所17013579.41遼寧沈陽傳染病醫(yī)院14313493.71浙江省湖州中心醫(yī)院（治療系列）213312896.24合 計84878392.33注：1 阿德福韋抗病毒治療患者43例，共檢出HBV DNA陽性152次； 2 拉米夫定抗病毒治療患

24、者51例，共檢出HBV DNA陽性133次。2、不同HBV DNA拷貝數(shù)中HBVLP陽性率以及OD值比較大蛋白試劑臨床研討組別HBV DNA大蛋白試劑結果HBVDNA拷貝數(shù)例數(shù)陽性例數(shù)陽性率（）大蛋白 OD1104(陰性)842321.380.2660.0442104432967.440.4160.0813105634673.020.5040.2054106242187.500.8980.1805107171694.121.2750.31961082323100.001.4280.238注：解放軍傳染病研討所，HBV DNA拷貝數(shù)對數(shù)值與HBVLP OD值的相關系數(shù)r=0.945大蛋白試劑臨床

25、研討組別HBV DNA大蛋白試劑結果HBVDNA拷貝數(shù)例(次)數(shù)陽性例(次)數(shù)陽性率（）陽性含量均值（ng）1103544888.8917.602104383797.3724.693105585696.5530.444106656396.9255.465106808010086.61合計/29528195.25/注：北京地壇醫(yī)院與沈陽傳染病醫(yī)院匯總，其中北京地壇醫(yī)院為阿德福韋抗病毒治療患者標本。HBV DNA拷貝數(shù)對數(shù)值與HBVLP含量ng的相關系數(shù)3、不同HBV DNA拷貝數(shù)中HBVLP陽性率以及含量比較r=0.935大蛋白試劑臨床研討4、HBVLP試劑與乙肝前S1試劑比較大蛋白試劑臨床研討

26、考 核 單 位HBVDNA（）HBVLP（）乙肝前S1（）例數(shù)例數(shù)比例（）例數(shù)比例（）北京地壇醫(yī)院26825494.7817665.67解放軍傳染病研究所17013579.419757.06合 計43838988.8127362.33大蛋白試劑臨床研討考 核 單 位HBVDNA（）HBVLP（）HBeAg（）北京地壇醫(yī)院沈陽傳染病醫(yī)院例數(shù)例數(shù)比例（）例數(shù)比例（）39136894.1217745.275、HBV DNA、HBeAg與HBVLP三者在乙肝患者中的比較5、HBV DNA、HBeAg與HBVLP三者在乙肝患者中的比較大蛋白試劑臨床研討HBV DNA（）HBeAg()HBeAg()合計1

27、77 #214 *391HBVLP（）172（97.18%）196（91.59%）368（94.12%）注： # 其中北京地壇醫(yī)院109份；沈陽傳染病醫(yī)院68份 * 其中北京地壇醫(yī)院159份；沈陽傳染病醫(yī)院55份6、不同HBV方式的患者中HBVLP與HBV DNA的比較大蛋白試劑臨床研討HBV M 模 式 例數(shù) HBV DNA（） 例數(shù) 陽性率(%)HBVLP（）例數(shù) 陽性率(%)HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)21820292.6720694.50HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)20716780.6815876.33HBsAg(+)HBeAg(+)231982

28、.611878.26HBsAg(+)HBcAb(+)371335.141643.24合計48540182.6839882.06大蛋白試劑臨床研討7、HBVLP試劑盒抗干擾才干的考評考核單位干擾血清HBVLP結果所患疾病例數(shù)陽性例數(shù)陽性率（）北京地壇醫(yī)院甲肝800丙肝800戊肝800兩種肝炎混合感染 * 600沈陽傳染病醫(yī)院丙肝2000合計/5000注：* 含甲肝乙肝混合感染、丙肝乙肝混合感染以及戊肝乙肝混合感染各2份8、HBVLP試劑盒的特異性考評大蛋白試劑臨床研討考核單位考評標本HBVLP結果標本來源例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)特異性（）河北省血液中心正常獻血員21183211599.86解放軍傳染病研究所體檢健康者1000100100北京地壇醫(yī)院體檢健康者57057100合 計/22753227299.87大蛋白試劑臨床研討9、HBVLP用于抗病毒治療的監(jiān)測北京地壇醫(yī)院進展了阿德福韋治療患者的過程監(jiān)測浙江湖州中心醫(yī)院進展了拉米夫定治療患者的過程監(jiān)測北京大學生物系進展了干擾素治療患者的過程監(jiān)測北京地壇醫(yī)院阿德福韋治療