1、第五章 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 ( transcription ) 生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程轉(zhuǎn)錄RNADNA 第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄概述一、轉(zhuǎn)錄生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程叫做轉(zhuǎn)錄(transcription) ?；虮磉_(dá)(gene expression):基因所貯存的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生具有生物功能的多肽和蛋白質(zhì)的過(guò)程 階段特異性（時(shí)間特異性）組織特異性（空間特異性） 轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的步。轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(Regulatory protein)決定了一個(gè)基因能否被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。生物體基因表達(dá)調(diào)控的第一步也就是決定是否要讓該基因轉(zhuǎn)錄。對(duì)于大多數(shù)基因來(lái)說(shuō)，這是最重要的調(diào)控機(jī)

2、制，在有些情況下甚至是唯一的調(diào)控機(jī)制。RNA分為3種:（1）信使RNA分子(mRNA)，含有一條或多條多肽鏈的氨基酸順序的信息。（2）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA),可以閱讀mRNA中的信息,并在蛋白質(zhì)合成中攜帶和轉(zhuǎn)移特定的氨基酸到生長(zhǎng)中的多肽鏈上。（3）核糖體RNA(rRNA),它與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所核糖體。二、轉(zhuǎn)錄單位(Transcription unit)DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因(structural gene)。DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(template strand)，也稱作反義鏈（antisense strand

3、）或負(fù)鏈。相對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈(coding strand)，也稱為有義鏈(sense strand）或正鏈。 5GCAGTACATGTC 33 c g t c a t g t a c a g 55GCAGUACAUGUC 3NAla Val His Val C編碼鏈模板鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯RNA合成由RNA聚合酶(RNA polymerase)催化。當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合到稱為啟動(dòng)子(Promoter)的DNA特異轉(zhuǎn)錄起始區(qū)時(shí)，轉(zhuǎn)錄就開(kāi)始了。啟動(dòng)子通常在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近，即位于RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一個(gè)堿基對(duì)附近。RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Start point)開(kāi)始沿模板邊移動(dòng)邊合成RNA，直至終止

4、序列。從啟動(dòng)子延伸到終止子(Terminator)所跨越的部分稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位 位于起始位點(diǎn)之前的序列稱為轉(zhuǎn)錄單位的上游(Upstream)，起始位點(diǎn)之后(在轉(zhuǎn)錄序列之內(nèi))的序列被稱為下游(Downstream)。按照書(shū)寫(xiě)規(guī)范，轉(zhuǎn)錄是從左(上游)向右(下游)進(jìn)行的，與mRNA 的通常書(shū)寫(xiě)形式：5-3方向一致。堿基的位置以起始位點(diǎn)為準(zhǔn)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)被定為+1，位于其下游的堿基序數(shù)按順序值遞增。起始位點(diǎn)前的一個(gè)堿基的位置被定義為-1，越靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，堿基負(fù)值也越大。 轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物被稱為初始轉(zhuǎn)錄本(primary transcript) 。它包含一條從啟動(dòng)子延伸到終止子含有5端及3端的RN

5、A。 初始轉(zhuǎn)錄本通常不穩(wěn)定:在原核生物中，它或被迅速降解(對(duì)于mRNA)，或被剪接成為成熟產(chǎn)物(對(duì)于rRNA和tRNA)。在真核生物中，它或被末端修飾(主要對(duì)于mRNA)，或被剪接成為成熟產(chǎn)物(對(duì)于所有RNA) 三、不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription) DNA分子的雙鏈均有轉(zhuǎn)錄功能,但對(duì)于一個(gè)特定的DNA區(qū)域或?qū)σ粋€(gè)特定的mRNA,只能有一條鏈為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這種現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性,即在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段,一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄 RNA合成過(guò)程，天然雙鏈DNA為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄，但體外條件下，一般DNA的2條鏈都可以作為模板鏈轉(zhuǎn)錄RNA，稱為對(duì)稱轉(zhuǎn)錄

6、 5335模板鏈編碼鏈（coding strand）結(jié)構(gòu)基因（ structural gene ）編碼鏈模板鏈（template strand） DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一條鏈可轉(zhuǎn)錄，另一條鏈不轉(zhuǎn)錄，但模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。四、轉(zhuǎn)錄的一般特點(diǎn)1、底物:4種核糖核苷三磷酸,ATP,GTP, CTP, UTP2、轉(zhuǎn)錄方向:與DNA復(fù)制方向相同,即從53末端3、模板:以一條DNA鏈為模板,按堿基互補(bǔ)規(guī)律,在轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄4、不需要引物:RNA聚合酶能起始一條新鏈的合成,起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸,而且將在RNA鏈的5末端保持這一三磷酸基團(tuán)。 5、轉(zhuǎn)錄具有階段特異性(時(shí)間特異性)和組織特異性

7、(空間特異性) 第二節(jié)RNA合成的酶學(xué)RNA合成主要包括四個(gè)步驟（1）RNA聚合酶結(jié)合于DNA上的特定位點(diǎn)（2）起始（3）鏈的延長(zhǎng)（4）鏈的終止和釋放 一、E.coli RNA聚合酶E.coli RNA聚合酶由5個(gè)亞基組成（5個(gè)多肽鏈），即2四個(gè)亞基的分子量分別為36.5KDa、150 KDa、160KDa和82 KDa，整個(gè)酶分子的分子量為465KDa 分別是基因rpoA、rpoB、rpoC和rpoD的產(chǎn)物與RNA聚合酶相結(jié)合的一個(gè)很小的蛋白質(zhì)(MW10KDa)，叫做亞基，其功能尚不清楚，有人認(rèn)為亞基對(duì)于RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能沒(méi)有太大的影響。 36512 決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄 150618

8、催化功能 155613 結(jié)合DNA模板 70263 辨認(rèn)起始點(diǎn)亞 基 分 子 量 功 能 原核生物的 RNA聚合酶這樣的酶稱為全酶，RNA聚合酶是指全酶。從全酶中去除亞基后的其余部分（2）稱為核心酶 亞基的最主要功能是識(shí)別啟動(dòng)子，細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈的哪條鏈被轉(zhuǎn)錄，即轉(zhuǎn)錄的方向、轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的選擇都與亞基有關(guān) 不同的亞基識(shí)別不同類型的啟動(dòng)子，可借以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，而核心酶相同，即哪條鏈被轉(zhuǎn)錄，起始點(diǎn)在什么地方靠亞基識(shí)別，與核心酶無(wú)關(guān) 核心酶 core enzyme全酶 holoenzyme亞基參與底物的結(jié)合（包括前體核苷三磷酸以及已經(jīng)形成的RNA鏈），催化磷酸二酯的形成 在E.coli 細(xì)胞里，某些藥物

9、如利福霉素類藥物（抑制RNA合成的起始）和鏈霉溶菌素（抑制RNA鏈的延伸）能有效抑制RNA合成，試驗(yàn)證明，這2種藥物均作用于亞基；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)亞基與前體核苷三磷酸有很強(qiáng)的親和力 亞基參與反義鏈結(jié)合。在離體轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)中，肝素(heparin)能抑制轉(zhuǎn)錄作用，人們發(fā)現(xiàn)肝素是與亞基緊密結(jié)合的。亞基是堿性最強(qiáng)的亞基，而肝素是一種酸性的粘多糖，正好與核酸競(jìng)爭(zhēng)亞基，從而妨礙亞基與反義鏈的結(jié)合。亞基可能參與全酶和啟動(dòng)子的牢固結(jié)合.這一牢固結(jié)合需要DNA雙螺旋的局部解鏈;當(dāng)RNA聚合酶核心酶沿著模板移動(dòng)、進(jìn)行RNA鏈的延伸時(shí),需要不斷地在前面解開(kāi)雙螺旋,在后面恢復(fù)雙螺旋,這些作用可能與兩個(gè)亞基的功能有關(guān) RNA聚

10、合酶僅僅是復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的核心部分。除了RNA聚合酶之外，還需要其他一些輔助的蛋白質(zhì)因子。如在轉(zhuǎn)錄終止時(shí)發(fā)生作用的釋放因子(因子)和抗終止因子等。參與起始作用的因子習(xí)慣上算作RNA聚合酶的成分，其實(shí)也是一種輔助因子 二、真核生物的 RNA聚合酶真核細(xì)胞中有三種RNA聚合酶，即RNA聚合酶、RNA聚合酶、RNA聚合酶 這些名稱最早是依據(jù)它們從DEAE纖維素柱上洗脫的先后順序而定出來(lái)的。后來(lái)發(fā)現(xiàn)不同生物的三種RNA聚合酶的洗脫順序并不相同，因而改用三種不同的RNA聚合酶對(duì)于-鵝膏蕈堿(-amanitine)的敏感性不同來(lái)進(jìn)行區(qū)別。RNA聚合酶I基本不受-鵝膏蕈堿的抑制，在大于103 mol/L時(shí)才

11、表現(xiàn)出輕微的抑制作用；RNA聚合酶對(duì)于-鵝膏蕈堿最為敏感，在10-910-8mol/L濃度下就會(huì)被抑制；RNA聚合酶的敏感性介于RNA聚合酶和之間，在10-510-4 mol/L時(shí)表現(xiàn)抑制作用。 真核生物的RNA聚合酶 種類 對(duì)鵝膏蕈堿 的反應(yīng) rRNAsnRNAmRNA 5S-rRNA tRNA耐受極敏感中度敏感轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA聚合酶主要存在于核仁中,其功能是合成5.8 S rRNA、18S rRNA和28S rRNARNA聚合酶存在于核質(zhì)中,其功能是合成mRNA以及snRNARNA聚合酶也存在于核質(zhì)中,其功能是合成tRNA和5S rRNA以及轉(zhuǎn)錄Alu序列 在細(xì)胞質(zhì)中也能發(fā)現(xiàn)一些RNA聚合酶

12、，它是從細(xì)胞核中滲漏出來(lái)的。 三種主要的RNA聚合酶的分子量都在500 KDa左右(14S15S)，每種酶分子含有兩個(gè)大亞基和48個(gè)小亞基，每個(gè)小亞基的分子量為10 KDa90KDa 像原核生物一樣，不同種類的基因需要不同的蛋白質(zhì)輔助因子協(xié)助RNA聚合酶進(jìn)行工作 。細(xì)菌RNA聚合酶的核心酶可以獨(dú)立合成RNA，它由亞基的兩個(gè)拷貝和、各一個(gè)拷貝組成；該酶與真核生物的聚合酶有密切聯(lián)系： 大亞基和與Pol 的大亞基RPB1及RPB2同源；亞基與RPB11及RPB13同源；亞基與RPB6同源。原則上，細(xì)菌的核心酶能夠在DNA分子的任何一點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞內(nèi)，聚合酶只在啟動(dòng)子處起始轉(zhuǎn)錄由于起始因子的加入

13、。此為全酶。大腸桿菌最常見(jiàn)的因子為70。70 識(shí)別的啟動(dòng)子有以下共同特征：兩段6個(gè)核苷酸長(zhǎng)的保守序列，其中心分別位于起始位點(diǎn)上游約10bp和35bp處，被1719個(gè)核苷酸的非特異序列隔開(kāi)。第三節(jié)啟動(dòng)子和終止子一、原核生物的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄起始所必需的一段DNA序列，一般位于結(jié)構(gòu)基因的上游，是DNA分子與RNA聚合酶特異結(jié)合而起始轉(zhuǎn)錄的部位。啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。原核生物啟動(dòng)子有4 個(gè)保守特征：起始位點(diǎn)、-10 區(qū)、-35 區(qū)以及-10 和-35 區(qū)之間的間隔距離。 保守序列 （一致性序列）開(kāi)始轉(zhuǎn)錄T T G A C AA A C T G T-35 區(qū)(Pribnow box)T A T

14、 A A T A T A T T A -10 區(qū)1-30-5 010-10-40-205 3 3 5 1、起始位點(diǎn)通常都是嘌呤堿基 (90%)原核典型的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)、-10 區(qū)、-35 區(qū) 2、Pribnow框Pribnow框 在原核生物啟動(dòng)子-10區(qū)域的一段核苷酸序列中，大多包含TATAAT序列或是稍有不同的變化形式，是RNA聚合酶牢固結(jié)合的位點(diǎn)，此段序列稱為Pribnow框。由于其中心在-10位點(diǎn)附近，所以又稱為-10序列。不同的啟動(dòng)子，其位置略有不同，一般都在-4到-13的范圍之內(nèi)。一致序列 ：T80A95T45A60A50T96其中帶有底線的T稱為保守T,它存在于目前已知的幾乎所

15、有啟動(dòng)子中,一般位于-6到-9位點(diǎn)。頭兩個(gè)核苷酸是TA的也占3/4以上。 Pribnow框是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)（簡(jiǎn)稱結(jié)合位點(diǎn) ）由于RNA聚合酶的誘導(dǎo)作用，在富含AT的Pribnow框內(nèi)的DNA雙螺旋首先“熔解”。 DNA雙螺旋在起始點(diǎn)周?chē)蠹s14 bp的距離內(nèi)分開(kāi)以形成轉(zhuǎn)錄泡，即與RNA聚合酶形成開(kāi)放式啟動(dòng)子復(fù)合體，使RNA聚合酶定向移動(dòng)而行使其轉(zhuǎn)錄功能。3、Sextama框 對(duì)于大多數(shù)啟動(dòng)子，在RNA聚合酶覆蓋的部分還有一個(gè)重要的區(qū)域，叫做Sextama框,其位置在-35附近,因此又叫 -35序列。-35序列是RNA聚合酶初始結(jié)合位點(diǎn)，RNA聚合酶依靠其亞基(因子)識(shí)別該位點(diǎn),因此

16、又稱為RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn) 一致序列為： T82T84G78A65C54A45 RNA聚合酶先結(jié)合于-35序列，然后才結(jié)合于-10序列 有實(shí)驗(yàn)表明，亞基識(shí)別-35序列并與之結(jié)合。由于RNA聚合酶分子很長(zhǎng)，大約能覆蓋70bp的DNA序列。因此酶分子上的一個(gè)適合部位就能達(dá)到-10 序列區(qū)域。酶分子一旦與-10序列結(jié)合以后， 亞基就立即從識(shí)別位點(diǎn)上解離下來(lái) 。 -35序列的重要性還在于，這一序列的核苷酸結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度。RNA聚合酶很容易識(shí)別強(qiáng)啟動(dòng)子,而對(duì)弱啟動(dòng)子的識(shí)別較差。Pribnow框和Sextama的堿基序列通過(guò)影響開(kāi)放性啟動(dòng)子復(fù)合物的形成速度而控制轉(zhuǎn)錄。這兩個(gè)序列是決定啟

17、動(dòng)子強(qiáng)度的重要因素，細(xì)胞可以由此來(lái)調(diào)節(jié)單位時(shí)間內(nèi)所轉(zhuǎn)錄的mRNA分子數(shù)，從而控制蛋白質(zhì)的合成速度。啟動(dòng)子的強(qiáng)度指一個(gè)啟動(dòng)子在一定的時(shí)間內(nèi)可以起始轉(zhuǎn)錄物的多少；具有與共有序列近似序列的啟動(dòng)子“更強(qiáng)”。啟動(dòng)子的強(qiáng)度受以下因素影響：?jiǎn)?dòng)子最初與聚合酶的結(jié)合程度、對(duì)異構(gòu)化作用的支持效率，以及此后聚合酶逃離的難易程度。4、-10 和-35 區(qū)之間間隔距離 在90%啟動(dòng)子中，-35 和-10 區(qū)之間的分隔距離在16 到19bp 之間。個(gè)別例外的可以小于15 或者大于20bp。盡管間隔區(qū)的真實(shí)序列并不重要，但其距離大小保持兩個(gè)位點(diǎn)恰當(dāng)分隔，從而在適合RNA 聚合酶的幾何結(jié)構(gòu)方面是很重要。幾種啟動(dòng)子的Sext

18、ama框、Pribnow框以及二者之間的距離 二、真核生物的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu) 真核生物有三種RNA聚合酶，每一種都有自己的啟動(dòng)子類型：RNA聚合酶只轉(zhuǎn)錄rRNA（合成5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA）,只有一種啟動(dòng)子類型。RNA聚合酶負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)編碼基因（合成mRNA和snRNA ） ，其啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)最復(fù)雜。RNA聚合酶負(fù)責(zé)合成tRNA和5S rRNA，其啟動(dòng)子常位于轉(zhuǎn)錄的DNA序列之內(nèi)，稱為下游啟動(dòng)子。1、RNA聚合酶的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu) 1）帽子位點(diǎn)(CAP site)，即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。堿基大多為A(指的是非模板鏈)，兩側(cè)各有若干個(gè)嘧啶核苷酸。2）TATA框，又叫Hogness框或Go

19、ldberg-Hogness框。其一致序列是： 基本上都由AT堿基對(duì)所組成,只在很少的啟動(dòng)子中有GG堿基對(duì)的存在。一般位于-25附近。 1、RNA聚合酶的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)3）CAAT框 一致序列是：一般位于-75區(qū)域附近。4）增強(qiáng)子（enhancer)，又稱為遠(yuǎn)上游序列，一般都在-100以上，是啟動(dòng)子的上游或下游對(duì)轉(zhuǎn)錄有促進(jìn)作用的一段DNA 序列。 增強(qiáng)子 的特點(diǎn)a對(duì)依賴于TATA框的轉(zhuǎn)錄和不依賴于TATA框的轉(zhuǎn)錄都有增強(qiáng)效應(yīng)。但對(duì)前者的增強(qiáng)效應(yīng)高。b距離效應(yīng)：離72bp重復(fù)序列近的容易起始轉(zhuǎn)錄。c極性效應(yīng)：轉(zhuǎn)錄方向離開(kāi)72bP重復(fù)序列的起始序列優(yōu)先轉(zhuǎn)錄，而朝向72bp重復(fù)序列的則效率差?？赡苁沁@一

20、重復(fù)序列中含有引起轉(zhuǎn)錄中止的序列。d具有組織細(xì)胞特異性。真核生物的核心啟動(dòng)子(core promoter)是指在體外檢測(cè)時(shí)，Pol 精確地起始轉(zhuǎn)錄所需要的最少一組序列元件；代表性的核心啟動(dòng)子約有40個(gè)核苷酸，向轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游或下游延伸。核心啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的4個(gè)元件：TFB識(shí)別元件(TFB recognition element, BRE)、TATA元件(盒)、起始密碼子(initiator, Inr)和下游啟動(dòng)子元件(downstream promoter element, DPE)。一個(gè)啟動(dòng)子含有其中的2或3個(gè)元件。在核心啟動(dòng)子之外（上游）存在一些在體內(nèi)進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄所需的其他序列元件，共同組

21、成調(diào)節(jié)序列(regulatory sequence)，包括：?jiǎn)?dòng)子最近元件(promoter proximal element)，上游激活物序列(upstream activator sequence, UAS)，增強(qiáng)子(enhancer)，以及一列的沉默子(silencer)、邊界元件(boundary element)和絕緣子(insulator)組成的抑制元件。所有這些DNA元件都與調(diào)節(jié)蛋白（激活或抑制因子）結(jié)合，促進(jìn)或阻礙從核心啟動(dòng)子開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄。2、RNA聚合酶的下游啟動(dòng)子 5S RNA基因的啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游5083之間。 缺失50以前的序列和缺失83以后的序列都能

22、正常轉(zhuǎn)錄，但5083這段序列缺失，無(wú)轉(zhuǎn)錄活性；而加上此段序列，又能正常轉(zhuǎn)錄。 把這段DNA序列插入任何DNA中，RNA聚合酶都能識(shí)別并起始轉(zhuǎn)錄。這段序列就是5S RNA基因的啟動(dòng)子，這樣的位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游的啟動(dòng)子又稱為內(nèi)部啟動(dòng)子。3、RNA聚合酶的啟動(dòng)子 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄rRNA，大多數(shù)真核生物rRNA基因啟動(dòng)子可以分為兩個(gè)部分：核心元件，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)周?chē)?40+5），又稱近啟動(dòng)子，其功能決定轉(zhuǎn)錄起始的精確位置；-165-40稱為遠(yuǎn)啟動(dòng)子（上游控制元件），其功能是影響轉(zhuǎn)錄的頻率。 每種生物都有特定的轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶結(jié)合，因此，RNA聚合酶的啟動(dòng)子具有明顯的種族特異性。 第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄

23、過(guò)程RNA轉(zhuǎn)錄的過(guò)程包括：RNA聚合酶與模板DNA 的結(jié)合RNA合成的啟動(dòng)：?jiǎn)?dòng)子與聚合酶結(jié)合，啟動(dòng)子聚合酶復(fù)合體一旦形成，就發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，起始過(guò)程繼續(xù)；DNA堿基對(duì)斷裂，形成“泡”；總是從5端向3端方向進(jìn)行。RNA鏈的延長(zhǎng)：一旦RNA聚合酶以及形成一小段RNA(10個(gè)堿基左右)，轉(zhuǎn)錄便進(jìn)入延伸階段。RNA鏈合成的終止：在某些細(xì)胞存在著特定的、已研究清楚的引發(fā)終止的序列。一 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問(wèn)題： 1 、RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在 轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域 2 、DNA雙鏈解開(kāi)，使其中的一條 鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板（一） 原核生物的轉(zhuǎn)錄起始2、DNA雙鏈解開(kāi),形成轉(zhuǎn)錄空泡1、RNA聚合酶全酶

24、(2 ) 與模板結(jié)合 3、在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng) 5 -pppGpN OH + ppiRNApol - DNA - pppGpN- OH pppGNTPpppGpN - OHppi起始復(fù)合物:5-pppG -OH + NTP1、在原核生物中，當(dāng)亞基與核心酶形成全酶后，全酶與非特異性DNA序列的結(jié)合力顯著下降(結(jié)合常數(shù)下降)，半衰期極大地縮短，使得全酶有可能采取快速的嘗試錯(cuò)誤的方式(trial and error) 尋找啟動(dòng)子。當(dāng)亞基發(fā)現(xiàn)其識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，全酶就與35序列結(jié)合(初始結(jié)合)，形成一個(gè)封閉的啟動(dòng)子復(fù)合物。 2、可能由于RNA聚合酶全酶的分子很大，其一端可以到達(dá)10序列，然

25、后由于某種機(jī)制，整個(gè)酶分子向10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合(此時(shí)在操作子上必須沒(méi)有阻遏蛋自存在)，然后35序列及起始位點(diǎn)處發(fā)生局部解鏈，一般為1217bp。這時(shí)的全酶和啟動(dòng)子的復(fù)合物稱為開(kāi)放性啟動(dòng)子復(fù)合物 3、封閉性和開(kāi)放性啟動(dòng)子復(fù)合物均為二元復(fù)合物。因?yàn)橹挥腥负虳NA這兩種成分在開(kāi)放性啟動(dòng)子復(fù)合物中，RNA聚合酶上的起始位點(diǎn)和延長(zhǎng)位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸前體充滿，在亞基的催化下形成RNA的第一個(gè)磷酸二酯鍵。4、此時(shí)，由RNA聚合酶、DNA模扳和新生的RNA鏈組成的復(fù)合物稱為三元復(fù)合物。三元復(fù)合物形成之后，因子從全酶解離下來(lái)，致使三元復(fù)合物中核心酶與DNA的親和力下降到非特異性結(jié)合水平以下。 轉(zhuǎn)錄起始

26、過(guò)程新生的RNA鏈與模板形成的雜交雙鏈很短 用胰臟RNAase處理轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)時(shí),由于胰臟RNAase能切斷單鏈RNA而不能切斷RNADNA雜交分子,結(jié)果得到大約10個(gè)堿基的RNA片斷。這10個(gè)堿基中多少是受到DNA的保護(hù)的(形成氫鍵),多少是受到RNA聚合酶保護(hù)的(空間作用)，尚不清楚。有人推測(cè)只有兩個(gè)左右核苷酸能與DNA形成氫鍵而配對(duì)形成雜交狀態(tài)。而在DNA合成中的引物可長(zhǎng)達(dá)5060個(gè)核苷酸均與DNA形成氫鍵結(jié)合。為什么有這樣的區(qū)別，其原因還不清楚。 真核生物轉(zhuǎn)錄的起始機(jī)制還不很清楚。從啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)方面來(lái)說(shuō)，它包含了許多啟動(dòng)子成分，每一種成分都有相應(yīng)的蛋白質(zhì)因子與之結(jié)合，這些蛋白質(zhì)因子總稱為轉(zhuǎn)錄

27、因子。在眾多的轉(zhuǎn)錄因子中，哪種是類基因轉(zhuǎn)錄所共同需要的？哪些是不同亞類的基因所特有的？在一個(gè)基因啟動(dòng)子的許多啟動(dòng)子成分上，是否全要結(jié)合有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子才能起始轉(zhuǎn)錄？這些因子結(jié)合的順序有何影響？是否還有轉(zhuǎn)錄起始的抑制因子？這些問(wèn)題都還沒(méi)有明確的結(jié)論。 RNA合成速度大約為每秒3050個(gè)核苷酸,但是,RNA鏈的延長(zhǎng),并不是以恒定速度進(jìn)行的，有時(shí)會(huì)降低速度或延宕(delay)。這是延長(zhǎng)階段的重要特點(diǎn) 鏈的延長(zhǎng)在通過(guò)一個(gè)富含GC對(duì)的模板以后約8至10個(gè)堿基,則會(huì)出現(xiàn)一次延宕。如果在突變體中,GCAT則減少延宕。如果在連續(xù)的GC對(duì)之間只有一個(gè)AT,把這個(gè)AT變?yōu)镚C，則會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的延宕作用。這種延宕作用

28、可能在RNA鏈的終止和釋放過(guò)程中起重要作用。二 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)1、 亞基脫落，RNA pol 聚合酶核心酶變構(gòu),與模板結(jié)合松弛,沿著DNA模板前移； 2、在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi二、轉(zhuǎn)錄的終止終止子:RNA鏈的終止與一段序列有關(guān)，其終止信號(hào)存在于已轉(zhuǎn)錄過(guò)的序列。這段終止信號(hào)序列叫終止子。終止子可以分為兩類：不依賴于蛋白質(zhì)輔助因子而能實(shí)現(xiàn)終止作用(2) 依賴蛋白質(zhì)輔因才能實(shí)現(xiàn)終止作用。這種蛋白質(zhì)輔因子稱為釋放因子，通常又稱因子。兩類終止子的共同序列特征：在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段回文序列回文序列的兩個(gè)重復(fù)部分(每個(gè)720b

29、p)由幾個(gè)堿基對(duì)的不重復(fù)節(jié)段隔開(kāi)回文序列的對(duì)稱軸一般距轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)1624bp。 兩類終止子的不同點(diǎn)是：不依賴因子的終止子的回文序列中富含GC堿基對(duì)，在回文序列的下游方向又常有68個(gè)AT堿基對(duì)(模板鏈上為A)依賴因子的終止子中回文序列的GC對(duì)含量較少。在回文序列下游方向的序列沒(méi)有固定特征，其AT對(duì)含量比前一種終止子低E.coli的色氮酸操縱元的轉(zhuǎn)錄終止子（不依賴因子）噬菌體的TA1終止子序列（依賴因子）因子如何行使功能？ 離體條件下,它有兩種活性：一種是促進(jìn)轉(zhuǎn) 錄終止的活性，另一種是NTPase活性， 后一種活性是實(shí)現(xiàn)前一種活性不可缺少的因子是通過(guò)識(shí)別DNA、RNA 或RNA 聚合酶起作用的嗎？

30、 因子有ATP 酶活性，但這種活性依賴于RNA，需要一個(gè)大于50個(gè)堿基的多聚核糖核酸的存在。提示與RNA結(jié)合。 “熱追蹤(Hot pursuit)”模型假設(shè)因子與新生RNA鏈的終止子上游某位點(diǎn)結(jié)合，然后因子沿mRNA 轉(zhuǎn)位。因子沿RNA 的移動(dòng)比聚合酶沿DNA的速度快。 因子沿著RNA 追趕聚合酶，當(dāng)聚合酶在依賴于因子的終止子處作短暫停頓時(shí)將其捕獲，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止。 2、抗終止及抗終止因子 在一些終止子上，終止事件可以被某些與RNA 聚合酶相互作用的特異輔助因子所阻止?！翱菇K止(Antitermination)”使酶越過(guò)終止子序列而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，此過(guò)程稱為通讀(Readthrough)?？菇K止是

31、在細(xì)菌噬菌體感染中被發(fā)現(xiàn)的,是細(xì)菌操縱子和噬菌體調(diào)控回路中的一個(gè)調(diào)控機(jī)制 圖5.11 抗終止作用決定RNA聚合酶在終止子位 點(diǎn)處終止還是通讀下去第五節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄后的加工一、概述在原核生物中，多基因的mRNA生成以后，絕大部分直接作為模扳去翻譯各個(gè)基因所編碼的蛋白質(zhì)，并以此手段協(xié)調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)量。原核生物的mRNA壽命很短，其半衰期通常為幾分鐘。這個(gè)現(xiàn)象看起來(lái)似乎是浪費(fèi)，而實(shí)際上這恰恰是原核生物內(nèi)的重要調(diào)控機(jī)制。如果一種酶或蛋白質(zhì)不再需要，只要簡(jiǎn)單地關(guān)閉其mRNA的合成就行了。在真核生物中，可能有特別的機(jī)制來(lái)延長(zhǎng)需要翻譯的mRNA的壽命，而縮短不再需要的mRNA的壽命。rRNA和tRNA則不

32、同，它們不是翻譯的模板，而是蛋白質(zhì)合成機(jī)器的組成成分。不管在原核生物中還是在真核生物中，它們都很穩(wěn)定，半衰期一般為幾個(gè)小時(shí)。 無(wú)論是rRNA還是tRNA，都不是最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其證據(jù)如下：(1)rRNA和tRNA分子的5端都是單磷酸，而所有原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5端部是三磷酸(2)rRNA和tRNA分子都比原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小，也就是比RNA的轉(zhuǎn)錄元小(3)所有的tRNA分子都含有原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所沒(méi)有的異常堿基，即除了A、G、C、U以外的堿基。因此，無(wú)論是rRNA，還是tRNA，都需要作轉(zhuǎn)錄后加工，刪除基因間序列以及基因內(nèi)的介入序列(內(nèi)元)二、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工1、真核生物mRNA 的5端帽子2、真核生物mR

33、NA 3端多聚腺苷酸化3、剪接1、真核生物mRNA 的5端帽子盡管真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄起始于一個(gè)嘌呤核苷三磷酸(pppA或pppG，A或G)，第一個(gè)核苷酸保留著其5三磷酸，使通常的磷酸二酯鍵從其3位向下一個(gè)核苷酸的5位之間生成。轉(zhuǎn)錄本的初始序列可描述為： 5pApNpNpNp 或5pGpNpNpNp但是,當(dāng)成熟的mRNA 在體外用能使其降解為單核苷酸的RNAase酶處理時(shí)，其5端并沒(méi)有像所希望的那樣生成核苷三磷酸pppA或pppG。相反，得到一個(gè)以5-5三磷酸二酯鍵相連的二核苷酸，且?guī)в屑谆?，而?末端的一個(gè)核苷酸總是N7甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷酸。這樣成熟的mRNA沒(méi)有自由的5端。mRNA5端的這種

34、結(jié)構(gòu)叫做帽子。圖5.13 真核生物mRNA 5端的不同帽子結(jié)構(gòu)真核生物mRNA 5端的不同帽子結(jié)構(gòu) （1）第一種甲基化,即N7甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷酸甲基化，發(fā)生在所有真核生物中，是在在端部鳥(niǎo)嘌呤的7位加上了一個(gè)甲基，僅僅擁有這樣單一甲基的帽子被稱為cap0，符號(hào)為M7GpppX。即使在單細(xì)胞真核生物中也發(fā)生這個(gè)甲基化反應(yīng)。負(fù)責(zé)催化這種修飾反應(yīng)的酶是鳥(niǎo)嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltranferase)。（2）下一步是在第二堿基(在沒(méi)有任何修飾之前轉(zhuǎn)錄本真正的第一個(gè)起始?jí)A基)的2-O位置。此反應(yīng)被另一個(gè)酶催化(2-O-甲基-轉(zhuǎn)移酶)，帶有上述兩個(gè)甲基的被稱為cap1，符號(hào)為M7GpppXm。除單細(xì)

35、胞生物之外，這是一種多數(shù)的帽子形式。（3）第二個(gè)堿基再次發(fā)生甲基化，這是高等真核生物中的少數(shù)情況。僅當(dāng)此堿基為腺嘌呤時(shí)這種甲基化才發(fā)生，被甲基化的是N6位。只有當(dāng)腺嘌呤的2-O位已經(jīng)甲基化時(shí)，負(fù)責(zé)此種甲基化的酶才能起修飾作用。（4）在一些種類中，甲基被加到戴帽mRNA的第三個(gè)堿基，這種反應(yīng)的底物是已經(jīng)帶有兩個(gè)甲基的cap1 mRNA。第三堿基的修飾通常是2-O位的甲基化，這創(chuàng)造了cap2 類型，符號(hào)為M7GpppXmpYm。所有戴帽mRNA 中，此類帽子只占1015%。在5端加鳥(niǎo)嘌呤是由鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶(Tranferase)催化實(shí)現(xiàn)的，此反應(yīng)緊隨轉(zhuǎn)錄的起始而發(fā)生: 在真核mRNA 群體中所有分子都

36、加帽,對(duì)于特定有機(jī)體，不同帽子類型的比例是其主要特征。對(duì)于一個(gè)特定mRNA 結(jié)構(gòu)而言，現(xiàn)在尚不知道是否可能有不止一種的帽子。在加帽過(guò)程中除了甲基化外，高等真核生物的mRNA 會(huì)低頻率地發(fā)生內(nèi)部甲基化。在每1000 個(gè)堿基中可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)N6甲基腺嘌呤，這樣在典型的高等真核mRNA（平均長(zhǎng)度18002000bp）中存在1-2個(gè)甲基腺嘌呤，其功能還不知道。2、3端多聚腺苷酸化mRNA 3端延伸的多聚A 經(jīng)常被描述為poly(A)尾巴；有這種特征的mRNA 稱為poly(A)+。poly(A)序列并非DNA編碼，在核內(nèi)它是在轉(zhuǎn)錄以后被加到RNA上的。加poly(A)的反應(yīng)由poly(A)聚合酶(Po

37、lymerase)所催化，它在mRNA的自由3-OH上加上200個(gè)腺嘌呤。核RNA與mRNA的poly(A)及poly(A)結(jié)合蛋白(PABP)相結(jié)合，許多真核生物內(nèi)部有相關(guān)類型的蛋白質(zhì)。一個(gè)PABP(Poly A binding protein)單體分子量約70kDa，與poly(A)尾的10-20 堿基相結(jié)合。所以在大多數(shù)真核生物的mRNA 3端會(huì)有一大群蛋白質(zhì)與之結(jié)合，這是一個(gè)普遍特征。加上poly(A)是mRNA 3端通過(guò)酶復(fù)合體產(chǎn)生和修飾過(guò)程中的一部分反應(yīng)。 幾乎所有的細(xì)胞mRNA 都擁有poly(A)，明顯的例外是編碼組蛋白的mRNA 不具有poly(A)。組蛋白mRNA 缺少po

38、ly(A)的意義尚不清楚，在功能上并不存在什么因素使poly(A)必需存在。真核生物RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多聚腺苷酸化與轉(zhuǎn)錄的終止。AAUAAA和GUGUGUG為切斷RNA的酶所識(shí)別的信號(hào)，切斷后RNA聚合酶可繼續(xù)轉(zhuǎn)錄直到終止子或者由別的機(jī)制促進(jìn)RNA聚合酶的釋放 3、剪接與沒(méi)有內(nèi)含子的原核基因一樣，真核“割裂”基因也整個(gè)轉(zhuǎn)錄為單一的一條RNA鏈。一個(gè)典型的真核基因，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包含了外顯子和內(nèi)含子。內(nèi)含子的數(shù)量和長(zhǎng)度都可以非常大，初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（前mRNA，pre-mRNA）實(shí)際也可以很長(zhǎng) 從pre-mRNA中除去內(nèi)含子的過(guò)程稱為RNA剪接(RNA splicing) 內(nèi)含子的數(shù)目和長(zhǎng)度不

39、同使基因間長(zhǎng)度差別很大。在一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物基因中約有7-8個(gè)外顯子，分布在16 kb 左右的范圍內(nèi)。外顯子較短(100200bp)，內(nèi)含子較長(zhǎng)(1 kb) 真核生物基因組內(nèi)存在更多需要加工剪接的情況，特別是真核生物基因的內(nèi)含子被轉(zhuǎn)錄后，需要在RNA水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的剪接。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接是RNA水平上加工內(nèi)容之一，是基因表達(dá)調(diào)控的方式之一對(duì)于剪接反應(yīng)本身來(lái)說(shuō)，一個(gè)最主要的問(wèn)題是如何保證它的準(zhǔn)確性。是什么確保了每個(gè)內(nèi)含子末端可以被準(zhǔn)確的識(shí)別，并把正確的序列從RNA 中剪接掉？從前體中切除內(nèi)含子的過(guò)程是否是按照特定的順序進(jìn)行？成熟RNA 是通過(guò)有效前體間的識(shí)別，還是通過(guò)改變剪接機(jī)制來(lái)調(diào)控基因表達(dá)的

40、？原核或真核生物的RNA剪接沒(méi)有單一的剪接機(jī)制，形式很多。根據(jù)基本的共同方式，內(nèi)含子的剪接可以分為三類。（1）第一類是自我剪接內(nèi)含子。由于這類內(nèi)含子的特殊結(jié)構(gòu)而能自發(fā)地進(jìn)行剪接，至少在體外不需要酶或蛋白質(zhì)參與。這一類又分為兩個(gè)亞類，即I型內(nèi)含子和型內(nèi)含子，它們各有特征性的二級(jí)結(jié)構(gòu)和短的共同序列，采取不同的兩種自我剪接方式。I型內(nèi)含子存在于多數(shù)真核線粒體、四膜蟲(chóng)、一些葉綠體和噬菌體RNA等。型內(nèi)含子主要在線粒體和葉綠體基因中。一些I型內(nèi)含子自身也能編碼蛋白質(zhì)。（2）第二類內(nèi)含子是蛋白質(zhì)(酶)參與剪接的內(nèi)含子，主要在tRNA前體中發(fā)現(xiàn)。剪接是在一系列酶催化下進(jìn)行的。（3）第三類內(nèi)含子是snRNP參與剪接的內(nèi)含子。這一類內(nèi)含子絕大部分存在于真核細(xì)胞核的蛋白質(zhì)基因中。其剪接方式與第一類型內(nèi)含子相似，都通過(guò)形成馬套索結(jié)構(gòu)的中間物和馬套索內(nèi)含子產(chǎn)物。區(qū)別在于型內(nèi)含子剪接不需要任何蛋白質(zhì)，而細(xì)胞核RNA前體的內(nèi)含子剪接要在snRNP參與下進(jìn)行。兩者比較后認(rèn)為，型自我剪接的內(nèi)含子是細(xì)胞核基因內(nèi)含子的前身，是失去自我剪接能力和增加對(duì)snRNP依賴性的進(jìn)化過(guò)程。三、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工E.coli共有三種rRNA,