1、第四講 電泳(din yn)共六十七頁(yè)主要(zhyo)內(nèi)容基本概念凝膠電泳篩分(shi fn)等點(diǎn)聚焦2DE印漬分析共六十七頁(yè)荷電粒子(lz)在電場(chǎng)中受力荷電粒子(lz)在溶液中勻速運(yùn)動(dòng)受到溶液阻力動(dòng)力和阻力相等，因此有如下關(guān)系共六十七頁(yè)電場(chǎng)靜電力介質(zhì)阻力運(yùn)動(dòng)方向共六十七頁(yè) 不同荷電粒子在溶液介質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)阻力不同。例如對(duì)于(duy)球形荷電粒子電阻力系數(shù)為：共六十七頁(yè)核酸和蛋白(dnbi)等生物大分子分子量差別大，但是淌度區(qū)別不大！共六十七頁(yè)電泳淌度的定義單位(dnwi)場(chǎng)強(qiáng)下電泳速度球形荷電粒子(lz)的電泳淌度可表示為共六十七頁(yè)淌度和電導(dǎo)(din do)的關(guān)系電阻率與電導(dǎo)率共六十七頁(yè)電泳

2、給定介質(zhì)和電場(chǎng)(din chng)條件下帶電粒子發(fā)生運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象；帶電粒子的電泳運(yùn)動(dòng)能力用電泳淌度（矢量）表征 電泳淌度的符號(hào)規(guī)定：運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)方向與電場(chǎng)強(qiáng)度相同為正；電泳運(yùn)動(dòng)方向與電場(chǎng)強(qiáng)度相反為負(fù)。共六十七頁(yè)SignalTimeKNaLi / cm2/s VLi + 4.0110-4Na +5.1910-4K +7.6110-4共六十七頁(yè)電泳技術(shù)的發(fā)展(fzhn)1908, Russian scientist Pence, Electrophoresis (1903, Russian, Tswett, Chromatography)1937, Sweden scientist Tiselius,

3、first practical use of electrophoresis, 5 species were separated from HAS; and won Nobel Prize in 1948, moving boundry electrophoresis （移動(dòng)(ydng)界面電泳）1959, Raymond and Weintraub, slab gel electrophoresis （平板凝膠電泳）1981, Jorgenson and Lukas, capillary electrophoresis1990，Manz, Lab on a chip, chip electr

4、ophoresis共六十七頁(yè)電泳技術(shù)的演化(ynhu)界面(jimin)移動(dòng)電泳 free solution in large tube 平板電泳gel support media on plate 毛細(xì)管電泳free solution in capillary 毛細(xì)管凝膠電泳 gel in capillary 自由流電泳 continuous sampling while electrophoresis共六十七頁(yè)凝膠電泳在抗對(duì)流和離子(lz)導(dǎo)電的具有一定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠介質(zhì)中進(jìn)行的電泳分離技術(shù)，主要用于帶電生物大分子的分離。凝膠介質(zhì)的作用(zuyng) 對(duì)大分子的尺度篩分作用介質(zhì)的抗對(duì)流作用

5、共六十七頁(yè)凝膠電泳篩分(shi fn)介質(zhì)瓊脂糖凝膠制膠簡(jiǎn)單(jindn)，分離度不高；加熱溶解，室溫下成膠聚丙烯酰胺需要從單體合成制備；分離度較高共六十七頁(yè)共六十七頁(yè)Ogston ModelRepatation（爬行(pxng)） Model共六十七頁(yè)聚丙烯酰胺Polyacrylamide,PA共六十七頁(yè)T單體和交聯(lián)劑的百分(bi fn)濃度C交聯(lián)劑的量a 丙烯酰胺量（g）b甲叉雙丙烯酰胺的量（g）m緩沖溶液的體積（ml）共六十七頁(yè)引發(fā)(yn f)劑、增速劑和聚合引發(fā)(yn f)劑：過(guò)硫酸胺、過(guò)硫酸鉀或核黃素增速劑：N,N,N,N-四甲基乙二胺聚合：自由基反應(yīng)（氧化、還原過(guò)程）。通常聚合過(guò)程

6、在40-60 min內(nèi)完成。在20-35 C時(shí)聚合，凝膠會(huì)比較透明而有彈性。共六十七頁(yè)共六十七頁(yè)共六十七頁(yè)典型應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分離(fnl)DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)等電聚焦電泳分離二維電泳蛋白分離（2DE PAGE）共六十七頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳分離(fnl)核酸核酸帶負(fù)電核線性分子，在電場(chǎng)的作用(zuyng)下向正極移動(dòng)。由于凝膠的篩分作用(zuyng)按分子的大小分開(kāi)，小的分子運(yùn)動(dòng)速度較快。分子量相同但構(gòu)型不同的DNA分子也可以分離。影響分離的主要因素有：分子量大小，凝膠濃度，電場(chǎng)強(qiáng)度，緩沖溶液等。60制膠（中有熒光染料，EB）；點(diǎn)樣孔在負(fù)極端電壓100 V以內(nèi)，時(shí)間通常半小時(shí)以上

7、借助有色染料掌握停止進(jìn)行電泳的時(shí)間；用熒光顯色和成像的方法記錄分離結(jié)果共六十七頁(yè)瓊脂糖凝膠濃度分離范圍（kb）0.35600.61200.90.8101.00.5-71.20.461.50.232.00.12膠的濃度與適宜(shy)的核酸堿基對(duì)范圍共六十七頁(yè)1 2 3 4 5 6點(diǎn)樣孔參考染料帶目標(biāo)組分電泳負(fù)極電泳正極泳道共六十七頁(yè)P(yáng)CR芯片(xn pin)DNA擴(kuò)增、檢測(cè) PCR混合液加入芯片反應(yīng)池吸取PCR擴(kuò)增液4保存設(shè)置程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增加入石蠟油預(yù)變性：95 300s95 30s55 45s 72 60s延伸：72 300s30個(gè)循環(huán)MCK-CK+PCR-Chip10l 反應(yīng)(fnyn

8、g)體系200 bp的 lambda DNA 共六十七頁(yè) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）除了(ch le)分離介質(zhì)不同，原理與瓊脂糖凝膠電泳相同根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi)。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電組分在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)進(jìn)行分離。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電組分在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。共六十七頁(yè)SDS蛋白篩分(shi fn)的原理SDS （十二烷基磺酸鈉）斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；強(qiáng)還原劑

9、使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，從而使蛋白變性。變性蛋白質(zhì)與SDS分子按比例結(jié)合(jih)，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，分子絡(luò)合物在凝膠中的遷移速度取決于分子大小。分子量在15-200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=k-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。共六十七頁(yè)SDS電泳的主要影響因素：溶液中SDS單體的濃度，當(dāng)其濃度大于1 mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.

10、4；如果單休濃度降到0.5 mmol/L以下時(shí)，兩者的結(jié)合比僅為1: 0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別.樣品緩沖液的離子強(qiáng)度較低，通常(tngchng)是10100 mmol/L二硫鍵是否完全被還原有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)赟DS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類(lèi)蛋白質(zhì)，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測(cè)定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。共六十七頁(yè) 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白

11、 MW=66,200 兔肌動(dòng)蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶(y dn bi mi)抑制劑 MW=20,100 雞蛋清溶菌酶 MW=14,400 開(kāi)封后溶于200l蒸餾水，置-20保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。共六十七頁(yè)蛋白質(zhì)樣品(yngpn)在 100C 時(shí)用 SDS 和 DTT 處理 3-5 min 后解聚成亞基并形成膠束（短軸約為18）共六十七頁(yè)凝膠濃度與分子量測(cè)定(cdng)的關(guān)系凝膠濃度T%(C=2.6%)分子量范圍(kDa)凝膠濃度T%(C=5%)分子量范圍(kDa)525-200560-1701010-701020-1001

12、5501510-502040205-40共六十七頁(yè)連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳 連續(xù)電泳：相同(xin tn)孔徑的凝膠和相同(xin tn)緩沖體系的樣品緩沖液、凝膠緩沖液和電極緩沖液及pH值恒定。 不連續(xù)電泳：不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳。樣品在分離膠和濃縮膠的界面上先濃縮成一窄帶。由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續(xù)電泳的分辨率大大高于連續(xù)電泳。共六十七頁(yè)共六十七頁(yè)等電聚焦(jjio)分離Isoelectrofocusing,IEF）等電聚焦技術(shù)是60年代發(fā)展起來(lái)的一種蛋白質(zhì)分離分析手段根據(jù)蛋白質(zhì)或其它兩性分子等電點(diǎn)不同，在一個(gè)(y )穩(wěn)定的、連續(xù)變化的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離。不同蛋

13、白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)，根據(jù)各自不同的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個(gè)很窄的區(qū)域，成為一個(gè)窄而穩(wěn)定的帶，從而起到濃縮和分離作用。共六十七頁(yè)等電聚焦(jjio)的分辨率 等電聚焦分離的程度取決于pH梯度和電場(chǎng)強(qiáng)度。用測(cè)定兩個(gè)鄰近帶的pI差即(pI)來(lái)表示分辨率。 D為蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，E為場(chǎng)強(qiáng)，dpH/dx為pH梯度，d/dpH為蛋白質(zhì)的遷移率的斜率。只有通過(guò)提高場(chǎng)強(qiáng)和使用(shyng)窄pH范圍來(lái)提高分辨率。共六十七頁(yè)固相pH梯度(t d)等電聚焦Immoblized pH gradients（IPG） IEF固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來(lái)的一種新型等電聚焦技術(shù)。利用一系列具有弱酸或弱堿性質(zhì)

14、的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并參與丙烯酰胺的共價(jià)聚合，從而形成固定的、不隨環(huán)境電場(chǎng)等條件變化的pH梯度。此法與傳統(tǒng)兩性電解質(zhì)等電聚焦相比，具有分辨率更高、上樣量更大等優(yōu)點(diǎn)。分辨率可達(dá)0.001pH, 是目前分辨率最高的電泳方法?？捎糜诘鞍踪|(zhì)和多肽的分析(fnx)、制備。共六十七頁(yè)固相pH梯度丙烯酰胺凝膠基質(zhì)(j zh)中的緩沖基團(tuán)共六十七頁(yè)pH 梯度范圍(fnwi)的選擇使用寬pH范圍的膠條（pH 3-10）可以在同一塊凝膠上看到樣品中絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)?？蛇x用非線性梯度的膠條，這種膠條將兩端(lin dun)的pH梯度壓得很窄，卻可以使中間區(qū)域的蛋白質(zhì)得到較好的分離。將有重疊區(qū)域的窄pH梯度的

15、膠條聯(lián)合使用，也同樣可以得到整個(gè)pH 3-10范圍的結(jié)果，且可以檢測(cè)出樣品中更多的（相對(duì)于非線性膠）蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。共六十七頁(yè)用于IEF分離(fnl)的固定pH梯度膠條Cathode+_Strip holderRehydration bufferIPG stripParafin oilCoveranode共六十七頁(yè)其它(qt)IEF電泳分離方式共六十七頁(yè)IEF還可以(ky)這樣作！共六十七頁(yè)等電聚焦(jjio)過(guò)程示意圖共六十七頁(yè)2DE 雙向電泳-可分離(fnl)數(shù)千個(gè)蛋白第一(dy)維：IEF，依據(jù)等電點(diǎn)進(jìn)行分離第二維：SDS，依據(jù)分子量進(jìn)行分離IEFBig smallSDSpH 3 10共六十

16、七頁(yè)2DE 的基本(jbn)步驟樣品(yngpn)制備IEFSDS buffer 平衡SDS凝膠染色掃描成像共六十七頁(yè)IEF分離后IPG膠條在SDS溶液(rngy)中平衡溶解蛋白并還原二硫鍵 (urea,SDS,Tris-HCl,glycerol; and DTT)游離(yul)的-SH 基團(tuán)的烷基化保護(hù) (urea,SDS,Tris-HCl,glycerol; and iodoacetamide)原生蛋白，native protein變性蛋白，denatured protein共六十七頁(yè)聚丙烯酰胺膠 IPG 膠條IPG膠條和丙烯酰胺凝膠之間不能有氣泡！可借助(jizh)瓊脂糖進(jìn)行結(jié)合。SDS

17、中的電場(chǎng)(din chng)方向？共六十七頁(yè)2DE 原理(yunl)2DE 分離染色(rns)掃描圖共六十七頁(yè)中國(guó)(zhn u)人健康肝臟2DE蛋白質(zhì)表達(dá)譜4.598k100kMWpH5481個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)共六十七頁(yè)凝膠中蛋白質(zhì)的檢測(cè)(jin c)如果要檢測(cè)低豐度的蛋白質(zhì)（例如，細(xì)胞內(nèi)低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)，或是蛋白純化(chn hu)過(guò)程中的雜質(zhì)檢測(cè)），就需要加大蛋白質(zhì)的上樣量（0.1-1mg/ml），同時(shí)采用高靈敏度的染色，比如銀染或是熒光染色。如果是要制備足夠的樣品作為抗原或用來(lái)測(cè)序，也需要加大蛋白質(zhì)上樣量，同時(shí)要選用的染色方法不會(huì)將蛋白質(zhì)固定在凝膠中。若需進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的比較，需選用檢測(cè)線性范圍大

18、的染料。 共六十七頁(yè)理想的染色(rns)方法應(yīng)具備如下特點(diǎn)：靈敏度高線性范圍(fnwi)寬方便費(fèi)用少與成像設(shè)備匹配考馬斯亮蘭染色 銀染 熒光染色目前還沒(méi)有通用的染色方法!共六十七頁(yè)選用蛋白染料(rnlio)時(shí)應(yīng)考慮：染料必須與蛋白質(zhì)亞基大分子結(jié)合形成不溶性有色復(fù)合物，但如該蛋白質(zhì)點(diǎn)需進(jìn)行后續(xù)鑒定則應(yīng)考慮該復(fù)合物不結(jié)合到凝膠中和凝膠支持(zhch)膜上。 吸附在凝膠上的染料必須容易溶解在對(duì)大分子無(wú)影響的溶劑中，以利于凝膠背景的脫色 選用高吸光系數(shù)的染料以提高檢測(cè)靈敏度 選用能與大分子反應(yīng)專(zhuān)一性結(jié)合的染料,以提高檢測(cè)的專(zhuān)一性共六十七頁(yè)考馬斯亮蘭染色(rns)Coomassie Brilliant

19、Blue (CBB)R-250是聚丙烯酰胺凝膠中檢測(cè)蛋白質(zhì)最常用的染料,系羊毛染料，可以用來(lái)對(duì)凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。其中“R” 代表紅藍(lán)色?！癎”代表藍(lán)綠色、CBB R-250檢測(cè)的靈敏度約為40 ng。染色的絕對(duì)靈敏度和線性范圍(fnwi)與蛋白種類(lèi)相關(guān)。這種染色溶液會(huì)將絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)固定在凝膠上。共六十七頁(yè)膠體(jio t)考染步驟固定：12（w/v）三氯醋酸（TCA） 2h染色：200 ml染色液 （染色液：在490ml含2（w/v）的H3PO4中加50g(NH4)2SO4直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250（已溶于10mlH2O中），攪拌混合。）混合50 ml甲醇16-2

20、4h 漂洗： 1）0.1 mol/L Tris-H3PO4緩沖液（pH6.5）漂洗兩分鐘； 2）25（v/v）甲醇漂洗不超過(guò)1 min穩(wěn)定(wndng)：在20的(NH4)2SO4中穩(wěn)定蛋白質(zhì)染料復(fù)合物 現(xiàn)有染色方法中，該法所能染色的蛋白質(zhì)最多共六十七頁(yè)銀染色(rns)方法1、5%乙醇、5%乙酸固定過(guò)夜或40%乙醇、10%乙酸固定1個(gè)小時(shí)2、用水漂洗40分鐘，其間至少換水3次。3、*5%戊二醛固定1個(gè)小時(shí)。4、用水漂洗2-3小時(shí)，其間至少換水4次。5、在持續(xù)溫和振搖下，用銀氨溶液染色30分鐘。6、水洗3次，每次3-5分鐘7、用顯影液顯色。銀染的斑點(diǎn)一般在10分鐘內(nèi)出現(xiàn)，否則更換顯影液。如果背景

21、已開(kāi)始變?yōu)榈S色，則應(yīng)該終止反應(yīng)。8、加入5%乙酸終止反應(yīng)。9. 在水中漂洗凝膠至少1小時(shí)，換水三次。可以(ky)將凝膠保存于水中。共六十七頁(yè)pH 3-10, 18 cm strip, 12 % gel, 100 g protein, Ag stain控制(kngzh)樣-來(lái)自(li z)楊芃元，復(fù)旦大學(xué)病理樣共六十七頁(yè)熒光(ynggung)染色 與蛋白結(jié)合的熒光物質(zhì)或與蛋白質(zhì)結(jié)合后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)均可用于蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)(jin c)。 熒光探針?lè)椒ㄓ袃煞N形式：電泳前預(yù)標(biāo)記和電泳完成后再標(biāo)記。 共六十七頁(yè)利用熒光標(biāo)記(bioj)可取得亞ng級(jí)的檢出能力（價(jià)格?。┕擦唔?yè)差示凝膠電泳Differ

22、ential Gel Electrophoresis (DIGE) Protein extract 1Label with fluor 1Protein extract 2Label with fluor 2Separate by 2DEMix labeled extractsImage gelExcitation Wavelength 1Excitation wavelength 2Image analysis:Data quantification Image analysis: Overlay images Analysis of difference共六十七頁(yè)2DE蛋白分離中的問(wèn)題pH

23、 梯度的形成方法(fngf)低拷貝數(shù)蛋白的檢測(cè)限上樣量疏水性蛋白超高和低分子量蛋白共六十七頁(yè)印跡法（blotting）是指將電泳分離的樣品帶轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的選擇性探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品中某目標(biāo)組分的一種方法(fngf)。1975年，Southern建立了將凝膠電泳分離后的DNA譜帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱(chēng)為Southern印跡法。而后人們用類(lèi)似的方法對(duì)其它生物分子進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱(chēng)為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Eas

24、tern印跡法印漬分析(fnx)（blotting）共六十七頁(yè) 與凝膠電泳分離和選擇性作用相結(jié)合的核酸和蛋白表達(dá)(biod)分析，可分為四類(lèi)：Southern，DNA，目標(biāo)DNA分析Northern，RNA，表達(dá)分析Western，蛋白，SDS PAGEEastern，蛋白，2DE （IEF+SDS PAGE）NorthernDNAWesternProtein/1DEasternProtein/2DSouthernRNA共六十七頁(yè)Western 分析(fnx)檢測(cè) 在電場(chǎng)的作用(zuyng)下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體（硝酸纖維素膜），然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。共六十七頁(yè)Western B