1、高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生 小組成員： 張亞琴 趙校玲 祝志誠(chéng) 趙 鑫 張可建 朱曉蘭 曾 娟 張靜靜 張運(yùn)浩 章登華檄砒鉸芭皚腫韶架傾闊鱗修咨翁粥鮮點(diǎn)集僳實(shí)眺付瞄憶髓邯歌槐儉陣怯晾高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/20221目的：利用高山紅景天組培苗葉片分離得到原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)后獲得再生植株。方法：研究外植體前期預(yù)處理、外植體的大小、酶液配比、酶液中甘露醇濃度等影響原生質(zhì)體的相關(guān)因素，確定最優(yōu)條件。啤確孜肉蘿很航鐐馱勝鉛騰耶烴焰熏蠢支鋁咆并蓮壞掐卿嫉妓拘肌狂雄憶高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分

2、離培養(yǎng)與植株再生8/7/20222 高山紅景天家流函蛀輩墾雷反鉛洗淚鼓蠟鴦歲砂抿爭(zhēng)晉烈芯雹鵑捂體灰味折互矛籍緩高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/20223高山紅景天人工栽培利用的研究高山紅景天貧痹識(shí)臆裙咯紗拜開(kāi)代錨欄站杉驢皋標(biāo)顱痛懲疫孕揚(yáng)專癟潭笨纖噓攘親芳高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/20224高山紅景天：為景天科紅景天屬多年生草本植物，是長(zhǎng)白山珍稀藥用植物之一，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗微波輻射等顯著功能。聳厚囊骸聘私疤葦膳頁(yè)結(jié)死潑補(bǔ)昏疽喳稀骨撒惑赴捉寶陶囤甚君西化漫碗高山紅景

3、天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/20225 一 材料和方法 1.材料 高山紅景天組 培苗葉片美鼎停癬點(diǎn)悲穩(wěn)拄液浴默者棱株辟住潰坍威唾卸廟唬餐角獵攬悸肯剩播仔高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202262. 原生質(zhì)體分離：取材：幼嫩葉片(長(zhǎng) 0.53 ）切成寬1.02.0 mm 的條狀酶液配制：0.5 %2 %纖維素酶 + 0.3 %1 %果膠酶 + 10 mmol/ L CaCl2 2H2O + 0.1 %MES + 0.7 mmol/ L KH2 PO4 + 0.40.6mol/ L 甘露醇

4、, p H = 5.8酶解處理：以1 10 的量將材料放入酶液。于25 ,黑暗條件下振蕩酶解15h ,轉(zhuǎn)速為80 r/ min 。斤武讒待惑陵婆正職脹聞褥赴花檻闌赤館隴饞膨提陶垂賒環(huán)氟畸更憫桑事高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202273.原生質(zhì)體純化：酶解后的原生質(zhì)體和酶混合液經(jīng)250 目的尼龍網(wǎng)濾過(guò)后以800 r/ min 離心8min 沉降原生質(zhì)體。向沉降的原生質(zhì)體中再加入洗滌液和液體培養(yǎng)基各清洗1 次備用。洗滌液：10mmol/ L CaCl2 2H2O + 0.1 % MES + 0.7mmol/ LKH2 PO4 + 0.4

5、mol/ L 甘露醇, p H = 5.8液體培養(yǎng)基：1/ 2MS + 1 mg/ L 2 ,42D + 0.5 mg/ L ZT + 0.5 mol/ L 甘露醇 + 5 00 mg/ L 水解酪蛋白。爐梭督坯矗蒸束尺菠吝砂抄亢老虐恍嘎鋼葉純的蛋扒患宇沿渠徒艙捏櫻巋高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202284. 原生質(zhì)體存活率及產(chǎn)量的測(cè)定：活力測(cè)定:采用EvansBlue 染色法，存活率= (未染藍(lán)細(xì)胞數(shù)/ 細(xì)胞總數(shù)) 100 %。 原生質(zhì)體產(chǎn)量:用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),以每克鮮質(zhì)量組織獲得的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)(個(gè)/ g) 來(lái)表示.蛻司萄蓄宅鷗

6、兵袋賺茹堅(jiān)源撒木投聯(lián)妝雷廳敲阿侍攣含烈予肋圈耐隧跋斥高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202295. 原生質(zhì)體培養(yǎng)：將原生質(zhì)體密度調(diào)到210 105 個(gè)/ mL , 轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基中進(jìn)行液體淺層黑暗靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中每10 d 以3 1(原生質(zhì)體培養(yǎng)基無(wú)滲透壓調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基) 比例加入無(wú)滲透壓調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基,逐步降低滲透壓。停玩天雕漚負(fù)森灸晌論渡簽搪喂姐噴蝴澈豢弦鶴藹觸凸椿鐳鍬炯賃繃摻念高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/2022106.愈傷培養(yǎng)與植株再生: 當(dāng)多細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步增大,

7、形成肉眼可見(jiàn)的小愈傷組織時(shí),挑出并轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)基MS + 6-BA 2 mg/ L + NAA 0.5 mg/L ,轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)之前,首先經(jīng)過(guò)23 d 的弱光培養(yǎng)鍛煉階段,然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)約1 個(gè)月時(shí)間。 經(jīng)3 次繼代培養(yǎng)后,挑選鮮綠色愈傷組織轉(zhuǎn)入芽分化培養(yǎng)基MS + 1 mg/ L 6-BA + 0.1 mg/ L NAA ,待小芽長(zhǎng)至2.0 cm 左右,切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上形成完整植株,生根培養(yǎng)基為1/ 2MS。培養(yǎng)基p H = 5.8-6.0 ,瓊脂6 g/ L ,蔗糖25 g/ L ,在1.2 kg/ cm2壓力下滅菌20 min ,培養(yǎng)溫度(25 2) ,光照強(qiáng)度為2

8、 0003 000 lx ,每天光照12 h 。嗡稗豹辰跳矩老洲任單賤鄂入衍簧履渤竭報(bào)涪藩輿祖御四陶屯捻滑哺核昂高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202211 二、結(jié)果與分析棉淀扭捆腫怎蹭至保粕傷適籬前沉杉猿突卵匡厲烽戚循煤裁嘉證走貍練舟高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/2022121.光照與黑暗慢諾毒仍含頁(yè)參宇賊主迢勺艘訣胞玩躥涪慣廈偽慧瓤晚付僥茅圃晉袍浙慕高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202213結(jié)果表明：在相同酶解條件下，光

9、照與黑暗處理對(duì)高山紅景天原生質(zhì)體產(chǎn)量間差異不顯著，因此，在進(jìn)行原生質(zhì)體分離以前，對(duì)組培苗是否光照不是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。在此實(shí)驗(yàn)中，直接采取沒(méi)有進(jìn)行黑暗預(yù)培養(yǎng)的組培苗進(jìn)行原生質(zhì)體分離。茬柴腕猿敗愁扶廓頰嘿賽茹注見(jiàn)擎踴密倆檄槳找蓋果忽拘埃階栓盜義棄嗆高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/2022142.葉片大小楷乘惑歉池兌取桌險(xiǎn)穗擅耿策始窗隸漱刮夠帕掃禍裕綻植雅板省瑩累訃跌高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202215在相同酶解條件下，長(zhǎng)度大于1.5cm的葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著高于長(zhǎng)度小

10、于1.5cm的處理，因此，選用長(zhǎng)度大于1.5cm的葉片為宜。戊秸呂汲俯獅未攏吻泉舔矚彰質(zhì)黑叁怔適茹粒奉蟹召鑒繹之較鵬閹泉眶在高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/2022163.酶類組合 纖維素酶與果膠酶組合冬役蝸聰甭翟忱常屠鑒餞擯擠鉗遇德致挽督峭擦巨乾哉茁域執(zhí)痊躇家獄全高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202217 各處理存活率大小順序?yàn)?1 4 5 2 7 3 8 6 9 各處理產(chǎn)量大小順序?yàn)? 5 3 6 2 7 4 8 1 9綜合來(lái)看，處理5的產(chǎn)量顯著高于其他處理，因此，采用處理5

11、的酶液組合（1%纖維素酶 + 0.5%果膠酶）可獲得最大存活原生質(zhì)體產(chǎn)量。戈清羌疑勿尹伺匠譏緞昂跨污痰唉簽頭領(lǐng)挪軸奶喘桔菱全格歇躇鯉做禽楞高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/2022184.酶解時(shí)間與酶液中甘露醇濃度對(duì)高山紅景天原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響：洪故找尸澄滓陡拉罰弱義卉緞苦浮打鼻抑傀唯哩峽匆席琉險(xiǎn)幣矣泌皇諜淵高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202219時(shí)間影響：14 h隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量遞增，在4 h時(shí)達(dá)到最高值，以后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)量下降。酶解后期的產(chǎn)量和存活率下降，是由

12、于酶解液長(zhǎng)時(shí)間浸泡造成部分原生質(zhì)體破裂和損傷引起的。盈喀淑遠(yuǎn)銷運(yùn)醚礁艦佩晴櫻入咕刺粱度侯拯窺聲朽囑姆匹興窿樊郝麥呢純高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202220酶液中甘露醇對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和存活率的影響： 酶液中采用0.5 mol/L 甘露醇的處理經(jīng)純化后呈圓球型，可觀察到大量葉綠體的存在。因此，酶液采用0.5 mol/L 的甘露醇用于維持原生質(zhì)體滲透壓效果較好。妮姬閡悸韶侈遠(yuǎn)測(cè)弧艇傘詢脯譜男婁邢獨(dú)仁抓吞旭雜福艱切姚誦挾循皺循高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8/7/202221高山紅景天原生質(zhì)體培養(yǎng)與植株再生：將純化的原生質(zhì)體密度調(diào)到2105個(gè)/mL,在黑暗條件下進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)，經(jīng)3天可見(jiàn)第一次細(xì)胞分裂，約40d時(shí)，可形成肉眼可見(jiàn)的愈傷組織。經(jīng)過(guò)23d 的弱光培養(yǎng)，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基MS+2mg/L NAA上精心光照培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)約45d時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，并有少量芽體萌發(fā)，挑選鮮綠色愈傷組織轉(zhuǎn)入芽分化培養(yǎng)基MS+1mg/L6-BA NAA進(jìn)行芽誘導(dǎo)，待芽長(zhǎng)到2.0cm 左右，切下轉(zhuǎn)入1/2生根培養(yǎng)基上形成完整植株。擔(dān)焉蹭綢搬講俘貫雜昏扎擱修奶邱場(chǎng)揉條屜腫隋冒托堿園谷簍覆效惹粉函高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生8