1、細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料：Caco-2 細(xì)胞；培養(yǎng)基 DMEM（高糖，含 Gln,無丙酮酸，Gibco/Invitrogen, cat. no. 41965-039）；a）完全培養(yǎng)基 DMEM+10% FCS + 1% NEAA （Gibco/Invitrogen, cat. no. 11140-035；b）DMEM-雙抗培養(yǎng)基 DMEM+10% FCS+1% NEAA+1%雙抗 （Gibco/Invitrogen, cat. no. 15140-122）；0.25% 胰酶+EDTA；HBSS（Hanks balanced salt solution）（cat. no. H1387）配制 1L，

2、加入 HEPES（終濃度 25mM） 和NaHCO3 （終濃度0.35g/L），調(diào)整PH=7.4并過濾除菌（如果要模擬小腸酸環(huán)境或研究 質(zhì)子依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，則以PH=6.5的甲磺酸代替HEPES，終濃度10mM，調(diào)整PH=6.5）；DMSO （在藥物不溶于HBSS時(shí)使用，99.5%純度，作為共溶劑，使用時(shí)DMSO終濃度不 能超過1%）；14Cmannitol （supplied by NEN Life Science Products，具有放射性）或用 fluorescent compound lucifer yellow （需要的藥物濃度高于14Cmannitol）分析藥物含量的溶劑，如HP

3、LC溶劑；BSA，如檢測脂溶性化合物則需要BSA；配制藥物，用上述HBSS溶液按需要的濃度溶解藥物，使用前檢查配制后的溶液PH值，如PH改變，則調(diào)整相應(yīng)的至7.4或6.5。要點(diǎn)：有些藥物可能會(huì)破壞Caco-2細(xì)胞層的完整性，造成通透性升高，一般以14Cmannitol作 為marker，通常完整的Caco-2細(xì)胞層通透性為1.2 0.5X10-7 cm s-1，如果通透系數(shù)大于 5X10-7 cm s-1，則認(rèn)為單細(xì)胞層受到了藥物的影響，若通透系數(shù)大于1X10-6 cm s-1，則 認(rèn)為單細(xì)胞層遭到破壞；對(duì)于主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，首先使用低濃度藥物如10RM或更低的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以避免轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 飽和轉(zhuǎn)運(yùn)；

4、對(duì)于被動(dòng)運(yùn)輸mM數(shù)量級(jí)的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣，主動(dòng)運(yùn)輸飽和，此時(shí)的運(yùn) 輸主要是被動(dòng)運(yùn)輸。實(shí)驗(yàn)器材：細(xì)胞培養(yǎng)箱，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，37度保濕培養(yǎng)箱和搖床（3 mm orbital diameter; IKA-Schuttler MTS4）,37 度保溫板，跨膜電阻抗(TER)檢測儀，帶有 Millicell-ERS-voltmeter (Millipore)或 Evohm epithelial voltmeter 的 Endohm 組織電阻測量室(WPI), Corning Costar Transwell permeable supports(12-well plates, cat. no. 3401

5、)， 12-well cell culture clusters with lids(Corning Costar, cat. no. 3512)，分析儀器(scintillation counter, UV-plate reader, fluorescence plate reader or HPLC(-MS)細(xì)胞準(zhǔn)備提前四周進(jìn)行Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+1%NEAA+5mMGln，培養(yǎng)條件：37C, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞至少要在40代以上，對(duì)于新解凍 的細(xì)胞，要至少體外培養(yǎng)2代后使用）檢測細(xì)胞活性2.1.1轉(zhuǎn)移細(xì)胞至試管中，用沉降法去除

6、細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞碎片；2.1.2轉(zhuǎn)移含細(xì)胞的上清液至新試管中，PI染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞量，死細(xì)胞量5%；離心細(xì)胞400g，5min，去除上清；重懸細(xì)胞在DMEM-雙抗內(nèi)（細(xì)胞濃度0.6X106 cells ml-1）；在12孔板內(nèi)放入filters （直徑12毫米），滴加0.1ml培養(yǎng)基潤濕filters 2min，滴加0.5ml細(xì)胞懸液，每個(gè)filter的種植密度約為3 X105 cells ml-1；向基底側(cè)加入1.5ml DMEM-雙抗培養(yǎng)基；在37C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-16h （不可超過16h）；棄去頂側(cè)培養(yǎng)基，補(bǔ)加0.5ml DMEM-雙抗培養(yǎng)基，目的是去除未貼壁細(xì)胞，預(yù)防多細(xì)胞 層的形成；每兩天

7、，棄去基底側(cè)培養(yǎng)，仔細(xì)并緩慢的棄去頂側(cè)培養(yǎng)基，向頂側(cè)補(bǔ)加0.5ml新鮮培養(yǎng)液，再向基底側(cè)補(bǔ)加1.5ml新鮮培養(yǎng)液（注意避免槍頭接觸到細(xì)胞層）；10重復(fù)上述換液步驟，持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至21-29天（培養(yǎng)21天時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和水解酶），結(jié)果如下圖所示：Apical sideCell monolayerFilterBasolateral side10.1接種的單層細(xì)胞狀態(tài)檢測：使用鬼筆環(huán)肽檢測或使用細(xì)胞核染色觀察；實(shí)驗(yàn)步驟11實(shí)驗(yàn)前12-24h更換培養(yǎng)液（實(shí)驗(yàn)過程大約2h）；12準(zhǔn)備藥物溶液，預(yù)熱所有溶液至37r，在工作臺(tái)上放置保溫板；13準(zhǔn)備新的12孔板，加入1.5ml HBSS,輕輕倒

8、出單細(xì)胞層上的培養(yǎng)液，并轉(zhuǎn)移至含HBSS 的培養(yǎng)板內(nèi)，在頂側(cè)加入0.5ml HBSS，置于振蕩器上37r，15-20min （100 r.p.m.）；14 37r 使用 Endohm tissue resistance measurement chamber檢測 TER 值（根據(jù)操作手冊檢 測，注意TER值與溫度有關(guān)，溫度低，TER值會(huì)變高檢測TER，37r TER 165Q cm2 的孔不能用于實(shí)驗(yàn)）；15進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，頂側(cè)溶液體積0.4ml （不包括吸取的C0樣品體積），基底側(cè)1.2mla）從頂側(cè)向基底側(cè)的檢測（absorptive，Apical-to-basolateral， ab）準(zhǔn)備

9、含HBSS的新的孔板，緩慢倒出filter inserts內(nèi)的HBSS，并轉(zhuǎn)移filter inserts 至準(zhǔn)備的孔板內(nèi)；向filter inserts內(nèi)加入藥物溶液（t = 0），立即吸取藥物溶液樣本（C0）b）從基底側(cè)向頂側(cè)的檢測（secretory，Basolateral-to-apical, ba）準(zhǔn)備新的孔板，基底側(cè)加入藥物溶液，取出filter inserts，輕輕倒出上面的HBSS；向頂側(cè)加入HBSS （t = 0）并立即從基底側(cè)吸取藥物溶液樣本（C0）；16在37C，500 r.p.m.的搖床上培養(yǎng)孔板；17設(shè)置4-5個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)（對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)快的親脂性藥物可設(shè)置5min，轉(zhuǎn)運(yùn)慢

10、的親水性藥物 可設(shè)置1h），取樣，取樣體積是取樣側(cè)溶液的一半，對(duì)于ab實(shí)驗(yàn)，從基底側(cè)取樣，對(duì) 于ba實(shí)驗(yàn)，從頂側(cè)取樣，補(bǔ)加新鮮的HBSS；18實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，吸取原始藥物加樣孔內(nèi)的樣品，用于計(jì)算物質(zhì)平衡；19檢測取樣樣品的TER值（樣品如果穩(wěn)定性好，可一起定量）;分析步驟20樣品定量，例如使用scintillation counting計(jì)算放射性標(biāo)記的藥物，HPLC結(jié)合UV，熒光或MS或分光光度計(jì)定量，（如果最終計(jì)算結(jié)果顯示物質(zhì)不平衡或滲透系數(shù)不可信，則 可能是因該藥物是高度親脂性化合物，此時(shí)可在基底側(cè)加入終濃度4%的BSA，但最終 計(jì)算的滲透系數(shù)要比正常高，因此檢測時(shí)最好想辦法去除加入的BSA）

11、。21計(jì)算公式滲透系數(shù)（Papp，單位：cm s-1）Papp =（dQ/dt）（MAC0）其中dQ/dt是滲透速率，單位dpm s-1或|imol s-1； A是filter的表面積，單位cm2； C0是藥物溶液的起始濃度，單位dpm liter-1或rM。液體的補(bǔ)償效應(yīng)有如下公式計(jì)算：where & and A (jig) represent the detected transport flux of the nth and ith sample, respectively; VSn (mL) represents the sampling volume of the nth sampl

12、e/ and VR (mL) is the total volume of HBSS in the receptor chamber.此種計(jì)算方法的前提條件是取樣的藥物濃度不超過藥物起始濃度的10%，當(dāng)不考慮這個(gè) 前提條件時(shí)，用如下公式：CR（t）=町（+切+庇0 -小VD是藥物溶液的體積，VR是另一側(cè)的體積，A是filter面積，M是藥物的總數(shù)，CR0是 在接收組中第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的藥物濃度，CR（t）是在時(shí)間點(diǎn)t時(shí)的藥物濃度； 其他計(jì)算公式質(zhì)量平衡計(jì)算公式recovery （%） = （0）伽）+（&0嶺（弟+頃加）*（而）10。/（頃）*（） CD起始藥物濃度，CR未加藥側(cè)藥物濃度，角標(biāo)0表

13、示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的數(shù)值，fin表示實(shí)驗(yàn) 結(jié)束時(shí)的數(shù)值，Cs(t)表示在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)藥物的濃度，V表示相應(yīng)樣品的體積。當(dāng)質(zhì) 量平衡 80%時(shí)，可接受Papp值。流出率(efflux ratio)= Papp ba/Pappab對(duì)照組設(shè)置設(shè)置對(duì)照組，使用 Endohm tissue resistance measurement chamber在 37C檢測 TER，使 用14Cmannitol或和待測藥物混合后檢測細(xì)胞層的完整性，在每次試驗(yàn)結(jié)束后，再次 檢測TER。37C預(yù)熱 HBSS (PH 7.4)；準(zhǔn)備mannitol溶液至終濃度大約2.5 5X105 dpm ml-1 (放射性單位)，置于3

14、7C 孵育；準(zhǔn)備閃爍瓶(scintillation vials)；取出 3-4 個(gè) filter inserts，棄去培養(yǎng)基，將 inserts 置于新的 12-well cluster 內(nèi)，HBSS洗15分鐘(基底側(cè)1.5ml，頂側(cè)U 0.5ml)；檢測TER值；取一新的12孔板，向3-4個(gè)孔內(nèi)各加入1.2ml HBSS；取出inserts，棄去HBSS，將inserts放入上一步準(zhǔn)備的孔內(nèi)；緩慢想inserts中加入0.45ml mannitol溶液后，立即吸取0.05ml液體(記為C0) 加入閃爍瓶內(nèi)；置于37C的搖床上培養(yǎng)；30分鐘后，從基底側(cè)吸取0.6ml液體，并向孔板中補(bǔ)加預(yù)熱的0.6mlHB