1、關(guān)于蛋白質(zhì)等電點的測定第一張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月主要內(nèi)容(1)了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。(2)學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點的方法。第二張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)的解離性質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：第三張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH達到一定數(shù)值時，蛋白質(zhì)顆粒上正負電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點。不同蛋白質(zhì)各有其特異的等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種

2、蛋白質(zhì)的等電點。第四張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月最常用的方法是：測其溶解度最低時的溶液pH值。等電聚焦電泳測其凈電荷為零時的PH濁度、分光光度法基于蛋白質(zhì)與離子交換的作用第五張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、測定溶解度最低時的溶液PH實驗原理： 借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與酷酸鈉(醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中)配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。第六張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月器材：水浴鍋、溫度計、200毫升錐形瓶、100毫升容量瓶、吸管、試管、試管架、乳缽試劑：

3、(1)0.4酪蛋白醋酸鈉溶液 (2)1.00摩爾升醋酸溶液 (3)0.10摩爾升醋酸溶液 (4)0.01摩爾升醋酸溶液 實驗器材與試劑：第七張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗步驟：(1) 取同樣規(guī)格的試營4支，按下表顛序分別精確地加入各試劑，然后混勻。試管號 蒸餾水（ml）0.01M醋酸（ml）0.1M醋酸（ml）1M醋酸（ml）18.40.628.70.338.01.047.41.6第八張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月 (2) 向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1毫升，加一管，搖句一管。此時1、2、3、4管的pH值依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10

4、分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點。第九張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、等電聚焦電泳原理：1）有一類兩性電解質(zhì)：它具有依次遞變而又相差不大的等電點，在電場下形成遞變而又連續(xù)的pH梯度，故在電泳介質(zhì)中加入這種物質(zhì)則能造成介質(zhì)pH由酸到堿逐步變化。第十張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2)各種蛋白質(zhì)pI不同3）兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度 以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持介質(zhì)，并在凝膠中加入兩性電解質(zhì)載體，在電場作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度的凝膠中泳動，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時，就不再泳動，而被濃縮成狹窄

5、的區(qū)帶。第十一張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月三、實驗試劑與儀器1）兩性電解質(zhì)2）30丙烯酰胺溶液3）TEMED4）10過硫酸銨溶液5）負極緩沖液：0.1M NaOH正極緩沖液：0.1M 磷酸或硫酸固定液：10（W/V）三氯乙酸染色液脫色液蛋白質(zhì)等電點標(biāo)準(zhǔn)電泳儀圓盤電泳槽第十二張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月圖 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)第十三張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月四、操作方法1. 凝膠柱的制備（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中（2）配膠表 10mL 7.5%凝膠的配制試 劑 名 稱 體積(mL)凝膠貯液 2.5兩性電解質(zhì)載體 0.5蒸餾水

6、 6.7510%過硫酸銨 0.0510%TEMED 0.1蛋白質(zhì)混合樣品 0.1混勻后置真空干燥器中抽氣 10 min第十四張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）將配好的凝膠溶液用細長頭滴管加到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻管中，至離上端1 cm處，再用注射器緩緩加水3-5 mm高。（4）待凝膠聚合2. 電泳將裝有膠的玻管固定到電泳槽上槽的洞中（安裝時要保證凝膠管垂直且橡膠塞孔密封不漏）在上槽中裝入0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸緩沖液。連接到電泳儀，接通電源，調(diào)電壓至160 V，聚焦過夜，至電流降為0，則可關(guān)閉電源。第十五張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3剝膠

7、電泳結(jié)束后，取下凝膠管，用蒸餾水洗凈兩端電極液，在凝膠條的正極端作上標(biāo)記。用灌滿水的注射器長針頭插入凝膠與玻管管壁之間，邊壓水邊慢慢轉(zhuǎn)動玻管，推針前進，同時注入水，靠水流壓力和潤滑力將玻璃管內(nèi)壁與凝膠分開，凝膠條即可流出。 4 .固定染色取出凝膠條放在一塊潔凈的玻板上，用尺量出固定前的凝膠條長度。放入帶蓋試管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脫色液漂洗2次，再染色1h，用蒸餾水漂洗數(shù)次后用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，量出蛋白帶距正極端的距離。第十六張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月5 .蛋白質(zhì)條帶聚焦位置的計算 求出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實際長度為：蛋白區(qū)帶中心距凝膠條正極端的距離 固定染色前凝膠條長度 固定染色后凝膠條長度 第十七張，PPT共二十頁，創(chuàng)作于2022年6月三、濁度、分光光度法溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點相同時，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點時，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負電荷。反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點時，則氨基