1、蛋白質(zhì)提取與制備Protein Extraction and Preparation 蛋白質(zhì)提取與制備蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上的差異很大，既或是同類蛋白質(zhì)，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。但多數(shù)分離工作中的關(guān)鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)和酶。蛋白質(zhì)與酶在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團(tuán)與極性親水基團(tuán)的比例，其次取決于這些基團(tuán)的排列和偶極矩。故分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不

2、同蛋白質(zhì)溶解差異的內(nèi)因。溫度、pH 、離子強(qiáng)度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。水適用于白蛋白類蛋白質(zhì)的抽提。如果抽提物的pH 用適當(dāng)緩沖液控制時(shí)，共穩(wěn)定性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂苷（Digitonin)溶液或有機(jī)溶劑來(lái)抽提。其它不溶于水的蛋白質(zhì)通常用稀堿溶液抽提。 一、蛋白質(zhì)類別溶解性質(zhì)的介紹簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)：白蛋白球蛋白：溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可被50%飽和度硫酸銨析出。真球蛋白：一般在等電點(diǎn)時(shí)不溶于水，但加入少量的鹽、酸、堿則可溶解。擬球蛋白：溶于水，可為50%飽和度硫酸銨析出醇溶蛋白：溶于70 80%乙醇中，不溶于

3、水及無(wú)水乙醇?xì)さ鞍祝涸诘入婞c(diǎn)不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸、稀堿溶液精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀組蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白質(zhì)：不溶于水、鹽、稀酸及稀堿綴合蛋白：包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白和氮苯蛋白等。 此類蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)隨蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)結(jié)合部分的不同而異，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，則脂溶性占優(yōu)勢(shì)，如脂肪部分被包圍于分子之中，則水溶性占優(yōu)勢(shì)。 二、蛋白質(zhì)提取與制備概述 蛋白質(zhì)的制備是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作。涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的知識(shí)很廣。近年來(lái)雖有了不少改進(jìn)，但其主要原理仍

4、不外乎兩個(gè)方面：一是利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配于可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離的目的，如電泳、超離心、超濾等。 由于不同生物大分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同，分離方法也不一樣。即同一類生物大分子由于選用材料不同，使用方法差別也很大。因此很難有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)任何蛋白質(zhì)均可循用。因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行充分調(diào)查研究，查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)欲分離提純物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)先有一定了解，然后再著手進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作。對(duì)于一個(gè)未知結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的試樣進(jìn)行創(chuàng)造性的分離提純時(shí)，更需要經(jīng)過(guò)

5、各種方法比較和摸索，才能找到一些工作規(guī)律和獲得預(yù)期結(jié)果。 另一方面，蛋白質(zhì)常以與其他生物體物質(zhì)結(jié)合形式存在，因此也易與這些物質(zhì)結(jié)合，這給分離精制帶來(lái)了困難。如極微量的金屬和糖對(duì)巨大蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性起決定作用，若被除去則不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)晶化的難度也隨之增加。如高峰淀粉酶A 的Ca2+，胰島素Zn2+等。此外，高分子蛋白質(zhì)具有一定的立體構(gòu)象，相當(dāng)不穩(wěn)定，如前所述極易變性、變構(gòu)，因此限制了分離精制的方法。通常是根據(jù)具體對(duì)象聯(lián)用各種方法。為得到天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，盡量采用溫和的手段，如中性、低溫、避免起泡等，并還要注意防腐。 整個(gè)制備過(guò)程一般可分為5 個(gè)階段：材料的選擇和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎（有時(shí)需進(jìn)行細(xì)胞

6、器的分離），提取，純化（包括鹽析，有機(jī)溶劑沉淀，有機(jī)溶劑提取、吸附、層析、超離心及結(jié)晶等），濃縮、干燥及保存。以上5 個(gè)階段不是要求每個(gè)方案都完整地具備，也不是每一階段截然分開。 不論是哪一階段使用哪一種方法，均必須在操作中保存生物大分子結(jié)構(gòu)的完整性。保存活性防止變性及降解現(xiàn)象的發(fā)生。因空間結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵、鹽鍵和范德華力的存在，遇酸、遇堿、高溫、劇烈的機(jī)械作用及強(qiáng)烈的輻射等均可導(dǎo)致活性喪失。因此選擇的條件應(yīng)為十分溫和。同時(shí)應(yīng)注意防止系統(tǒng)中重金屬離子、細(xì)胞自身酶系及其他有毒物質(zhì)的污染。 三、蛋白質(zhì)提取與制備具體操作方法 1 、原料的選擇早年為了研究的方便，盡量尋找含某種蛋白質(zhì)豐富的器官?gòu)闹刑崛?/p>

7、蛋白質(zhì)。但至目前經(jīng)常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細(xì)胞膜或內(nèi)膜等原材料，因而對(duì)提取要求更復(fù)雜一些。 原料的選擇主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā墓I(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來(lái)源豐富及成本低的原料。盡量要新鮮原料。但有時(shí)這幾方面不同時(shí)具備。含量豐富但來(lái)源困難，或含量來(lái)源均理想，但分離純化操作繁瑣，反而不如含量略低些易于獲得純品者。一般要注意種屬的關(guān)系，如鰹的心肌細(xì)胞色素C 較馬的易結(jié)晶，馬的血紅蛋白較牛的易結(jié)晶。要事前調(diào)查制備的難易情況。 若利用蛋白質(zhì)的活性，對(duì)原料的種屬應(yīng)幾乎無(wú)影響。如利用胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)的活性，用豬或牛胰臟均可。但若研究蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)時(shí)，原料的來(lái)

8、源種屬必須一定。研究由于病態(tài)引起的特殊蛋白質(zhì)（本斯.瓊斯氏蛋白、貧血血紅蛋白）時(shí)，不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個(gè)體的原料?？赡軙r(shí)盡量用全年均可采到的原料。對(duì)動(dòng)物生理狀態(tài)間的差異（如饑餓時(shí)脂肪和糖類相對(duì)減少），采收期及產(chǎn)地等因素也要注意。 機(jī)械方法主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。常用器械有：高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm ，具高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片），宜用于動(dòng)物內(nèi)臟組織的破碎；玻璃勻漿器（用兩個(gè)磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對(duì)細(xì)胞破碎程度較高速搗碎機(jī)高，機(jī)械切力對(duì)分子破壞較小。小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_

9、劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。但在磨細(xì)時(shí)局部往往生熱導(dǎo)致變性或pH 顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時(shí)。磨細(xì)劑的吸附也可導(dǎo)致?lián)p失。 物理方法主要通過(guò)各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。反復(fù)凍融法于冷藏庫(kù)或干冰反復(fù)于零下15 20 使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。 化學(xué)及生物化學(xué)方法有機(jī)溶媒法粉碎后的新鮮材料在0 以下加入5 10 倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一般不變性，被脫脂和脫水

10、成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。 自溶法將待破碎的鮮材料在一定pH 和適當(dāng)?shù)臏囟认拢米陨淼牡鞍酌笇⒓?xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。比較穩(wěn)定，變性較難，蛋白質(zhì)不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時(shí)需要時(shí)間，需加少量甲苯、氯仿等。應(yīng)防止細(xì)菌污染。于溫室30 左右較早溶化。自體融解過(guò)程中PH 顯著變化，隨時(shí)要調(diào)節(jié)pH 。自溶溫度選在0 4 ，因自溶時(shí)間較長(zhǎng)，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時(shí)較少用。 表面活性劑處理較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡淀及去氧膽酸鈉等。此外一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì)胞脹破。

11、 b 、細(xì)胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離，對(duì)于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。尤其近年來(lái)分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、遺傳工程等學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展，對(duì)分布在各種細(xì)胞器上的核酸和蛋白質(zhì)的研究工作日益增多，分離各種細(xì)胞器上的各類核酸和特異性蛋白質(zhì)已成為生物大分子制備工作重要內(nèi)容之一。各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的。DNA 幾乎全部集中在細(xì)胞核內(nèi)。RNA 則大部分分布于細(xì)胞質(zhì)。各種酶在細(xì)胞內(nèi)分布也有一定位置。因此制備細(xì)胞器上的生物大分子時(shí)，預(yù)先須對(duì)整個(gè)細(xì)胞

12、結(jié)構(gòu)和各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)分布匹有所了解。以肝細(xì)胞為例整理如表 細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法。細(xì)胞經(jīng)過(guò)破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。細(xì)胞器的分離制備、介質(zhì)的選擇十分重要。最早使用的介質(zhì)是生理鹽水。因它容易使亞細(xì)胞顆粒發(fā)生聚集作用結(jié)成塊狀，沉淀分離效果不理想，現(xiàn)一般改用蔗糖、Ficoll （一種蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。 水溶液提?。捍蟛糠值鞍踪|(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的最常用溶劑。鹽溶液提?。阂喳}溶液

13、及緩沖液提取蛋白質(zhì)進(jìn)常注意下面幾個(gè)因素。鹽濃度等滲鹽溶液尤以0.02 0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。 0.15mol/L 氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L 碳酸氫鈉液提取等。有時(shí)為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質(zhì)的靜電結(jié)合，也常使用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質(zhì)在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質(zhì)需用1mol/L 以上氯化鈉液提取。總之，只要能溶解在水溶液中而與細(xì)胞顆粒結(jié)合不太緊密的蛋白質(zhì)和酶，細(xì)胞破碎后選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度及PH ，一般是不難提取的。只有某些與細(xì)胞顆粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊的，需采用有機(jī)溶劑或加入表面活性劑處

14、理等方法提取。 PH 值：蛋白質(zhì)提取液的PH 值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。如細(xì)胞色素C 屬堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，用稀堿提取。某些蛋白質(zhì)或酶與其分物質(zhì)結(jié)合常以離子鍵形式存在，選擇PH3 6 范圍對(duì)于分離提取是有利的。 溫度：多數(shù)酶的提取溫度在5 以下。少數(shù)對(duì)溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進(jìn)一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇37 50 條件下提取，效果比低溫提取更好。此外提取酶時(shí)加入

15、底物或輔酶，改變酶分子表面電荷分布，也能促進(jìn)提取效果。有機(jī)溶劑提?。河袡C(jī)溶劑提取用于提取蛋白質(zhì)的實(shí)例至今是不多的。但一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機(jī)溶劑提取。從一些粒線體（Mitochondria)及微粒體（Microsome)等含多量脂質(zhì)物質(zhì)中提取蛋白質(zhì)時(shí)，采用Morton 的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水也能溶解10%，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中溶解能力大大增加。 丁醇提取法的pH 及溫度選擇范圍較廣（pH3

16、10 ，溫度-2 至40 ）。國(guó)內(nèi)用該法曾成功地提取了琥珀酸脫氫酶。丁醇法對(duì)提取堿性磷酸脂酶效果也是十分顯著的。胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60 70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白質(zhì)水解酶對(duì)胰島素的破壞，同時(shí)也達(dá)到大量除去雜蛋白的目的。 表面活性劑的利用：對(duì)于某些與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)和酶，也有采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等處理。表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽(yáng)離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（Triton X-100 、TirtonX-114 、吐溫60 及吐溫80 ）等。非離子型表面活性劑比離子型溫和，不

17、易引起酶失活，使用較多。對(duì)于膜結(jié)構(gòu)上的脂蛋白和結(jié)構(gòu)，己廣泛采用膽酸鹽處理，兩者形成復(fù)合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來(lái)研究膜蛋白使用表面活性劑的稀溶液提取時(shí)，較喜歡用非離子型表面活性劑。 對(duì)提取物的保護(hù)：在各種細(xì)胞中普遍存在著蛋白水解酶，提取時(shí)要注意防止由它引起的水解。前面所講的降低提取溫度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多數(shù)蛋白水解酶的最適PH 在3 5 或更高些，因在較低PH 條件下可降低蛋白質(zhì)水解酶引起的破壞程度。低pH 可使許多酶的酶原在提取過(guò)程中不致激活而保留在酶原狀態(tài)，不表現(xiàn)水解活力。加蛋白質(zhì)水解酶的抑制劑也同樣起保護(hù)作用，如以絲氨酸為活性中心的酶加二異丙基

18、氟磷酸，以巰基為中心的酶加對(duì)氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有機(jī)溶劑時(shí)也能產(chǎn)生相類似的作用。蛋白水解酶的性質(zhì)變化很大，上述條件均視具體對(duì)象而變化。 有一些蛋白含巰基，這些巰基可能是活性所必需。在提取這種蛋白不要帶入金屬離子和氧化劑。前者可往提取液中加金屬螯合劑如EDTA ，后者可加入還原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質(zhì)帶一些非共價(jià)鍵結(jié)合的配基。提取時(shí)要注意保護(hù)，不要使酸基丟失。四、蛋白質(zhì)的分離純化 從破碎材料或細(xì)胞器提出的蛋白質(zhì)是不純的，需進(jìn)一步純化。純化包括將蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)分開，將各種不同的蛋白質(zhì)分開。選擇提取條件時(shí)，就要考慮盡量除去非蛋白質(zhì)。一般總是有其它物質(zhì)伴隨混入提取液中。但有些雜質(zhì)（如脂肪）以

19、事先除去為宜。先除去便于以后操作。常用有機(jī)溶劑提取除去。 對(duì)于異類物質(zhì)，提純蛋白質(zhì)和酶時(shí)?；煊泻怂峄蚨嗵?，一般可用專一性酶水解，有機(jī)溶劑抽取及選擇性部分沉淀等方法處理。小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備過(guò)程中通過(guò)多次液相與固相轉(zhuǎn)化中被分離或最后用透析法除去。而對(duì)同類物質(zhì)如酶與雜蛋白、RNA 、DNA 以及不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、酶、核酸之間產(chǎn)分離，情況則復(fù)雜得多。主要采用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法、吸附法、結(jié)晶法、電泳法、超離心法及柱層析法等。 其中鹽析法、等電點(diǎn)法及結(jié)晶法用于蛋白質(zhì)和酶的提純較多，有機(jī)溶劑抽提和沉淀用于核提純較多，柱層析法、梯度離心法對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的提純應(yīng)用十分廣泛。如前所述

20、，蛋白質(zhì)的分離純化較難，而且其本身的性質(zhì)又限制了某些方法的使用，因此要研究目的物的微細(xì)特征，巧妙的聯(lián)用各種方法并進(jìn)行嚴(yán)密的操作，同時(shí)有必要了解精制各過(guò)程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白質(zhì)可利用吸收光譜等物理性質(zhì)或以相當(dāng)于單位氮活性增加為尺度進(jìn)行追蹤。其他蛋白質(zhì)可用電泳、超離心、層析、擴(kuò)散及溶解等測(cè)定純度。如結(jié)晶核糖核酸酶經(jīng)層析分為兩個(gè)成分?？梢妼?duì)確定蛋白質(zhì)結(jié)晶純度尚無(wú)最終的尺度。 根據(jù)經(jīng)驗(yàn)即或純凈的標(biāo)準(zhǔn)品，有極微量的不純物時(shí)，也會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)較大的影響。不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，如分離SH-酶時(shí)使用試劑及緩沖液等，要確認(rèn)不含重金屬離子（特級(jí)試劑也需檢定）。蛋白質(zhì)純化的操作如脫鹽、濃縮干燥等均與低分子化合

21、物不同，必須經(jīng)過(guò)獨(dú)特的繁瑣操作。 蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互分離主要利用它們之間的各種性質(zhì)的微小差別。諸如分子形狀、分子量大小、電離性質(zhì)、溶解度、生物功能專一性等。蛋白質(zhì)提取液中，除包含所需要的蛋白質(zhì)（或酶）外，還含有其它蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸及肽類等雜質(zhì)。除去的方法有： 1 ）核酸沉淀法該法可用核酸沉淀劑和氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。必要時(shí)也可用脫氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗勻漿中加入少量DNase,于4 保溫30 60min ，可使DNA 降解為足夠小的碎片，以致不影響以后的純化。2 ）醋酸鉛沉淀法利用醋酸鉛沉淀劑除去雜蛋白。因這些沉淀劑也常常使需要的酶（或蛋白質(zhì)）緩緩變性而失去活性，所以用

22、這類試劑時(shí)應(yīng)迅速進(jìn)行鹽析，使樣品與這類試劑脫離接觸。3 ）調(diào)pH 值或加熱沉淀法利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差異除去雜蛋白。利用蛋白質(zhì)的熱變性的溫度系數(shù)差異，可在一定的PH 下將蛋白提取液加熱到一定的溫度，使對(duì)熱不穩(wěn)定的雜蛋白性沉淀而除去。4 ）選擇性變性法利用各種蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，可用選擇性變性法來(lái)除去雜蛋白。例如胰蛋白酶及細(xì)胞色素C 等少數(shù)特別穩(wěn)定的酶，甚至可用2.5%三氯醋酸處理，此時(shí)其它雜蛋白均變性而沉淀，而胰蛋白酶和細(xì)胞色素C 則仍留在溶液中。5 ）透析法小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備過(guò)程中多次液相與固相互轉(zhuǎn)化中被分離，或最后用透析法除去。1 、利用溶解度不同的純化方法原理：鹽析法對(duì)于許多非電

23、解質(zhì)的分離純化均適合。對(duì)蛋白質(zhì)和酶的提純應(yīng)用也最早。至今還廣泛使用，一般粗抽提物經(jīng)常利用鹽析法進(jìn)行粗分。也有反復(fù)用鹽析法得到純的蛋白質(zhì)的例子。其原理是蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃度升高而增加（鹽溶，與離子強(qiáng)度10 1 間成比例增加）。球蛋白當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出（鹽析）（離子強(qiáng)度I2 10 ）。這是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的電荷的極性基團(tuán)有靜電引力。當(dāng)水中加入少量鹽時(shí)，鹽離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子一的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加一定程度時(shí)，水的活度降低，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)相互聚集而沉淀析出。鹽

24、析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同達(dá)到彼此分離的方法。 鹽的選擇：如上所述，蛋白質(zhì)在水中溶解度取決于蛋白質(zhì)分子上離子基團(tuán)周圍的水分子數(shù)目，即取決于蛋白質(zhì)的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白質(zhì)的溶解度?？刂品椒ㄗ畛Ｓ玫氖羌尤胫行喳}。主要有硫酸銨、硫酸鎂 、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25 時(shí)飽滿和溶解度為4.1mol,即767g/l;0時(shí)飽滿和溶解度為3.9mol,即676g/l ）。 在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)均可鹽析出來(lái)，且硫酸銨價(jià)廉易得，分段效果較其它鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。應(yīng)用硫酸銨時(shí)對(duì)蛋白氮的測(cè)

25、定有干擾，另外緩沖能力較差，故有時(shí)也應(yīng)用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白，用硫酸鈉的效果也不錯(cuò)，硫酸鈉的缺點(diǎn)是30 以下溶解度太低。其它的中性鹽如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好，但也由于溶解度太低，受溫度影響大，故應(yīng)用不廣。氯化鈉的溶解度不如硫酸銨，但在不同溫度下它的溶解度變化不大，這是方便之處。它也是便宜不易純化的試劑。硫酸銨濃溶液的PH 常在4.5 5.5 之間,市售的硫酸銨還常含有少量游離硫酸,PH 值往往降至4.5 以下,當(dāng)用其他PH 值進(jìn)行鹽析時(shí),需用硫酸或氨水調(diào)節(jié).在室溫及0 時(shí)所需硫酸銨飽和度可查表。第3 種調(diào)整飽和度的方法是將鹽析的樣品液裝于透析袋內(nèi)對(duì)飽和硫酸銨進(jìn)行透析，此法濃度變化較連續(xù)

26、，不會(huì)出現(xiàn)鹽的局部過(guò)高現(xiàn)象，但鹽析時(shí)測(cè)定鹽的飽和度手續(xù)較繁，運(yùn)用較少。確定沉淀蛋白質(zhì)所需硫酸銨濃度的方法將少量樣品冷卻到0 5 ，然后攪拌加入固體硫酸銨粉末，見蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀時(shí)，離心除去沉淀，分析上清液確定所要蛋白質(zhì)的濃度，如它仍在溶液中則棄去沉淀，再加更多的硫酸銨于上清液中，直到產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀時(shí)止。以所要提取的蛋白質(zhì)在溶液中的濃度對(duì)硫酸銨濃度作圖，得沉淀曲線，找出蛋白質(zhì)開始沉淀的濃度。如不考慮收率，飽和度區(qū)間可取得窄一些，使純度高一些。鹽析時(shí)注意的幾個(gè)問(wèn)題：鹽的飽和度 不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)要求鹽的飽和度不同。分離幾個(gè)混合組成的蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加。每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行離心或

27、過(guò)濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第2 種蛋白質(zhì)沉淀。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質(zhì)飽和度達(dá)20%時(shí)，纖維蛋白原首先析出；飽和增至28 33%時(shí)，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至33 50%時(shí)，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時(shí)清蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，可從牛胰酸性提取液中分離得到9 種以上蛋白質(zhì)及酶。 PH 值pH 值在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小易沉淀析出。因此鹽析時(shí)除個(gè)別特殊情況外，pH 值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。由于硫酸銨有弱酸性，它的飽和溶液的pH 值低于7 ，如所要蛋白質(zhì)遇酸易變性則應(yīng)在適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行。蛋白質(zhì)濃度 在相同鹽析條件下蛋白質(zhì)濃度愈高愈易沉淀。使

28、用鹽的飽和度的極限也愈低。如血清球蛋白的濃度從0.5%增至3.0%時(shí),需用中性鹽的飽和度的最低極限從29%遞減至24%.某一蛋白質(zhì)欲進(jìn)行兩次鹽析時(shí),第1 次由于濃度較稀,鹽析分段范圍較寬,第2 次則逐漸變窄.例如膽堿酯酶用硫酸銨鹽析進(jìn)時(shí)，第1 次硫酸銨飽和度為35%至60%,第2 次為40%至60%.蛋白質(zhì)濃度高些雖然對(duì)沉淀有利,但濃度過(guò)高也易引起雜蛋白的共沉作用.因此,必須選擇適當(dāng)濃度盡可能避免共沉作用的干擾。溫度由于濃鹽液對(duì)蛋白質(zhì)有一定保護(hù)作用，鹽析操作一般可在室溫下進(jìn)行。至于某些對(duì)熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。通常蛋白質(zhì)鹽析時(shí)對(duì)溫度要求不太嚴(yán)格。但在中性鹽中結(jié)晶純化時(shí)，溫度影響則比較

29、明顯。 脫鹽蛋白質(zhì)用鹽析法分離沉淀后，常需脫鹽才能獲得純品。脫鹽方法最常用的是透析法。透析法所需時(shí)間較長(zhǎng)，常在低溫下進(jìn)行并加入防腐劑避免微生物污染。透析使用前必須處理，方法是將透析袋置于0.5mol/LEDTA 溶液中煮0.5h,棄去溶液,用蒸鎦水洗凈,置50%甘油中保存?zhèn)溆?。也可用分子篩層析，常用SephadexG-25 柱層析法，上樣不要超過(guò)床體積的20%。此外，有些金屬離子能和蛋白質(zhì)形成較為專一的結(jié)合而使蛋白質(zhì)沉淀。這雖不是典型的鹽析，但在制備蛋白質(zhì)中有許多成功的例子。鋅離子在特定pH 下與胰島素結(jié)合形成沉淀就是這種例子。蛋白質(zhì)從懸浮液中沉淀出來(lái)的速度極慢，必須用強(qiáng)力離心來(lái)促進(jìn)這個(gè)過(guò)程。

30、 2 、有機(jī)溶劑分離純化法有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度降低。有機(jī)溶劑與水作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出。常用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮，由于有機(jī)溶劑的加入易引起變性失活，尤其乙醇和水混合釋放熱量，操作一般宜在低溫下進(jìn)行，且在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以免局部濃度過(guò)大。用此法所析出的沉淀一般比鹽析法易過(guò)濾或離心沉降。 分離后的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑的濃度。操作時(shí)的pH 值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度，減少變性和提高分離的效果。一般在有機(jī)溶劑沉淀

31、時(shí)添加中性鹽的濃度在0.05mol 左右,過(guò)多不僅耗費(fèi)有機(jī)溶劑,而且可能導(dǎo)致沉淀不好.沉淀的條件一經(jīng)確定,就必須嚴(yán)格控制,才能得到重復(fù)性結(jié)果.有機(jī)溶劑濃度通常以有機(jī)溶劑和水容積比或用百分濃度素示.故操作條件比鹽析法嚴(yán)格。 許多有機(jī)溶劑，如碳鏈較長(zhǎng)的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定程度后則分成兩相，一相以水為主，一相以有機(jī)溶劑為主。某些第3 組分的存在可以改變兩相的比例和組成。有許多蛋白質(zhì)在兩相中均能溶解，形成分配。在同一個(gè)兩相的溶劑系統(tǒng)中，不同的蛋白質(zhì)有不同的分配系數(shù)。根據(jù)這一原理，操作全部機(jī)械化的有逆流分溶。因要求實(shí)驗(yàn)室溫度恒定且操作也繁雜，雖一直有人在用但很不普遍。分配層析也是應(yīng)用這一

32、原理，但在分離純化蛋白質(zhì)工作中用得不多，主要是因?yàn)槎鄶?shù)蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中，特別是在易與水分相的溶劑中溶解度小且易變性。 疏水層析是近年發(fā)展的新方法。它利用蛋白質(zhì)表面有一部分疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時(shí)結(jié)合。洗脫時(shí)將鹽濃度逐漸降低，蛋白質(zhì)因疏水性不同而逐個(gè)地先后被洗脫而純化。此法能分離其它一些方法不易純化的蛋白質(zhì)。利用分子形狀和大小不同的分離方法蛋白質(zhì)形狀有細(xì)長(zhǎng)的如纖維，有密實(shí)的如圓球，形狀很不相同。蛋白質(zhì)的分子量從6000左右開始，有各種大小，大的可以大到幾百萬(wàn)。利用這些差別，有幾種方法可用來(lái)分離蛋白質(zhì)。 凝膠層析：屬最常用的蛋白質(zhì)分離方法。系混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層

33、析柱時(shí)，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。所指凝膠從廣義上說(shuō)是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如天然物質(zhì)中的馬鈴薯淀粉及瓊脂糖凝膠，人工合成品的葡聚糖凝膠及帶離子交換基團(tuán)的葡聚糖凝膠等。把適當(dāng)?shù)哪z顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，于柱內(nèi)加入欲分離的混合物，然后用大量蒸鎦水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物質(zhì)的分子大小和形狀不同，在洗柱過(guò)程中，分子量最大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆 粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。整個(gè)過(guò)程和過(guò)濾相似，故又名凝膠過(guò)濾、凝膠滲透過(guò)濾、分子篩過(guò)濾等。由于物質(zhì)在分離過(guò)程中的阻滯減速現(xiàn)象，有人也

34、稱之為阻滯擴(kuò)散層析、排阻層析等。凝膠過(guò)濾是分子篩的一種，在介紹凝膠過(guò)濾法之前，首先介紹分子篩的由來(lái)。McBain(1928)提出了分子篩的概念。后來(lái)發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象在許多地方都存在。Synge 與Tiselins（1950 ）在解釋凝膠層中的電泳和電滲現(xiàn)象時(shí)引用了分子篩的概念。此后發(fā)現(xiàn)在柱層析中也有這種現(xiàn)象，于是許多工作者嘗試了一系列適用于生物高分子分離純化用的分子篩。至1959年P(guān)orath 與Flodim 找到部分水解的葡聚糖凝膠將其交聯(lián)，得到了商品名為交聯(lián)葡聚糖（Sephadex)的分子篩。該分子篩具有許多良好的性能，在蛋白質(zhì)的分離分析中已被廣泛采用。 Lathe 與Ruthven(1956

35、)曾利用分子篩效應(yīng)測(cè)定過(guò)分子大小與分子量。Flodin 與Granath （1961 ）發(fā)現(xiàn)不同分子量的葡聚糖級(jí)分，其凝膠過(guò)濾行為與分子量大小有關(guān)。Andrew （1962 ）發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中也有類似的性質(zhì).此后經(jīng)過(guò)不少人的實(shí)際應(yīng)用，完善了這一方法，形成一個(gè)可靠的測(cè)定高分子分子量的方法。凝膠層析是60 年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)便的分離技術(shù)。由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便和不需要有機(jī)溶劑，以及對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，所以目前它已被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)藥學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。 PH 值：與沉淀蛋白質(zhì)或酶原理相同，結(jié)晶的溶液PH 值一般選擇在被結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶的等電點(diǎn)附近，以利于晶體

36、的析出。溫度：除少數(shù)情況外，通常選擇低溫條件進(jìn)行。低溫條件對(duì)蛋白質(zhì)和酶不僅溶解度低且不易變性。在中性鹽溶液中結(jié)晶時(shí)，溫度可在0 至室溫范圍內(nèi)選擇，在有機(jī)溶劑中結(jié)晶一般要求溫度較低。 晶種：不易結(jié)晶蛋白質(zhì)和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶結(jié)晶可導(dǎo)致大量結(jié)晶的形成。有時(shí)用玻璃輕輕摩擦容器壁也可達(dá)到此目的。需加晶種才能形成結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶，大多數(shù)結(jié)晶收率都不高。金屬離子：有些蛋白質(zhì)和酶結(jié)晶時(shí)還需加入金屬離子，如鐵蛋白在硫酸銨溶液中結(jié)晶時(shí)，加入少量鎘離子才形成菱狀結(jié)晶，烯醇化酶也常加入汞鹽后形成結(jié)晶。結(jié)晶時(shí)間：在結(jié)晶條件比較適合的情況下，在幾小時(shí)甚至幾分名即可獲得結(jié)晶。但有些情況需數(shù)天甚至數(shù)月才能

37、結(jié)晶完全，視各種蛋白質(zhì)和酶的具體情況不同而定。蛋白質(zhì)和酶的結(jié)晶大多數(shù)是針狀、棒狀、片狀，有的為八面體或立方體的菱狀結(jié)晶。結(jié)晶的大小與結(jié)晶時(shí)間及條件有關(guān)。干燥：干燥是將潮濕的固體、半固體或濃縮液中的水分（或溶劑）蒸發(fā)除去的過(guò)程。根據(jù)水分在固體中分布情況可分為表面水分、毛細(xì)管水分和被膜所包圍的水分3 種。表面水分附著于固體表面，蒸發(fā)時(shí)完全暴露于外界空氣中，干燥最快、最均勻。毛細(xì)管水分存在于固體極細(xì)孔隙的毛細(xì)管中，水分子逸出比較困難，蒸發(fā)時(shí)慢并需較高溫度。膜包圍的水分如細(xì)胞中被細(xì)胞質(zhì)膜所包圍的水分，需經(jīng)緩慢擴(kuò)散至膜外才能蒸發(fā)最難除去。被干燥的物質(zhì)其濕度與周圍空氣的濕度是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，暴露于大氣中

38、的物質(zhì)是不會(huì)絕對(duì)干燥的。 若使被干燥的物質(zhì)所含水分低于周圍空氣中水分，則必須放在嚴(yán)密封蓋的容器中進(jìn)行干燥。用這種方法可得到含水量極低的干燥樣品，生物大分子制備得到所需的產(chǎn)品后，為了防止變質(zhì)易于保存和運(yùn)輸，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥，某些無(wú)活性核酸、微生物酶制劑和酪蛋白等工業(yè)產(chǎn)品則較多地應(yīng)用噴霧干燥、氣流干燥等直接干燥法。 真空干燥在相同溫度下，被干燥物質(zhì)所含水分或溶劑由于周圍空氣壓力的降低蒸發(fā)速度增加。真空度愈高，溶劑沸點(diǎn)愈低，蒸發(fā)愈快。其原理與真空濃縮（或稱減壓濃縮）相同。真空干燥適用于不耐高溫、易氧化物質(zhì)的干燥和保存，整個(gè)裝置包括干燥器、冷凝器、及真空泵3部分。干燥器

39、頂部連接一帶活塞的管道接通冷凝器，氣化后的蒸氣由此管道通過(guò)冷凝管凝聚，冷凝器另一端連接真空泵，干燥器內(nèi)常放一些干燥劑如五氧化二磷、無(wú)水氯化鈣等，以便干燥保存樣品。 冷凍真空干燥冷凍真空干燥除利用真空干燥原理外，同時(shí)增加了溫度因素。在相同的壓力下，水蒸氣壓隨溫度的下降而下降。在低溫下低壓下冰很容易升華為氣體。操作時(shí)通常將等干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。干燥后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類生物大分子的干燥保存。樣品干燥時(shí)先在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪成薄層（厚度不超過(guò)1cm 的液體），置于低溫冰箱內(nèi)凍固。 另在真空干燥器內(nèi)用兩個(gè)培養(yǎng)皿分別放置

40、固體氫氧化鈉和五氧化二磷，真空干燥上端抽氣通過(guò)五氧化二磷干燥管與真空泵相連。當(dāng)放進(jìn)等待干燥的凍塊后，立即封閉干燥器，開動(dòng)真空泵，紅5 10h后得冷凍干燥品。也可將待干燥物質(zhì)置于圓底容器中，然后浸入干冰-乙醇混合而成的冷卻劑中，容器內(nèi)液體迅速凍成固體，抽真空后等干燥凍塊的水分子升華變成氣體，經(jīng)過(guò)冷凝器凝結(jié)為霜。冰凍的樣品逐漸失去水分變成疏松的干燥粉末。上述操作關(guān)鍵在于真空泵的高真空度及管道的口徑要合適。 噴霧干燥噴霧干燥是將液體通過(guò)噴灑裝置噴成霧滴后，與干燥介質(zhì)（通常為熱空氣）直接接觸干燥的方法。由于液體分散為霧滴時(shí)，直徑通常只有1 200 m 大小，與熱空氣接觸面大，水分蒸發(fā)很快。在100 的

41、熱空氣中只需不到1 秒的時(shí)間即可干燥。因干燥時(shí)間短和水分蒸發(fā)時(shí)吸收熱量，使液滴及其附近的空氣溫度較低，故工業(yè)上常用。 樣品貯藏保存：保存方法和生物大分子穩(wěn)定性有很大關(guān)系，生物大分子的貯藏保存可分為干態(tài)和液態(tài)貯藏兩種。但不論是干態(tài)或液態(tài)貯藏均應(yīng)避免長(zhǎng)期暴露于空氣中防止微生物的污染。溫度對(duì)生物大分子的穩(wěn)定性影響很大，低溫保存在大多數(shù)情況下是有利的。干態(tài)貯藏：干燥的制品一般比較穩(wěn)定，如制品含水量很低，要低溫情況下物質(zhì)大分子活性可在數(shù)月甚至數(shù)年無(wú)顯著變化。貯藏方法也很簡(jiǎn)單，只將干燥后的樣品置于干燥容器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保存于0 4 冰箱中即可。有時(shí)為了取樣方便和避免取樣時(shí)樣品吸水和污染，可先將樣品分裝于許多小瓶中，每次用時(shí)只取出1 瓶。 液態(tài)貯藏液態(tài)貯藏的優(yōu)點(diǎn)是使樣品免去干