1、兔局灶性腦缺血微導(dǎo)絲法預(yù)處理模型的建立【摘要】目的：討論穩(wěn)定的兔局灶性腦缺血預(yù)處理微導(dǎo)絲法模型的建立及對其評價。方法：安康新西蘭白兔35只,隨機分為3組:假手術(shù)組5只;缺血組10只，在dsa引導(dǎo)下，選擇微導(dǎo)絲直接從頸總動脈(a)經(jīng)頸內(nèi)動脈(ia)插至大腦中動脈(a)起始部4h,再灌注時,抽回導(dǎo)絲至頸總動脈內(nèi)；預(yù)處理組20只，在dsa引導(dǎo)下，選擇微導(dǎo)絲從頸總動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈插至a起始部停留15in，再灌注時,抽回導(dǎo)絲至頸總動脈內(nèi)停留15in，如此重復(fù)3次，之后將微導(dǎo)絲堵于大腦中動脈起始部4h,完成微導(dǎo)絲法局灶性腦缺血預(yù)處理模型的制作,并利用神經(jīng)功能缺損評分、tt和he染色對模型進展評價。并且對模型

2、行ri常規(guī)掃描及彌散成像，分析ri是否也能顯示腦缺血預(yù)處理的存在。結(jié)果：血管造影可明晰顯示頸內(nèi)動脈的走行及其顱內(nèi)分支情況，8只80，8/10動物缺血模型成功，12只60，12/20動物腦缺血預(yù)處理模型成功。缺血/再灌注后3h就可在t2i，di表現(xiàn)為右側(cè)海馬及外側(cè)基底節(jié)區(qū)高信號，di范圍大于t2i，于24ht2i范圍根本不變且t2i與di范圍相近。tt染色將正常組織染成紅色,梗死腦組織不染色而呈白色,不染色的范圍與導(dǎo)絲栓塞后t2i上的病變范圍根本一致，預(yù)處理組最終t2i上高信號區(qū)及tt無染區(qū)體積均小于缺血組。結(jié)論：采用微導(dǎo)絲直接從頸總動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈插至a起始部,栓塞15in后，抽回導(dǎo)絲至頸總動脈

3、內(nèi)再灌注15in，如此反復(fù)3次，能建立較穩(wěn)定的腦缺血預(yù)處理模型?！娟P(guān)鍵詞】缺血預(yù)處理磁共振動物模型兔keyrdsisheia;prenditining;ri;anialdel;rabbit眾所周知，短暫性腦缺血發(fā)作tia是發(fā)生缺血性卒中的危險因素之一。但近年來有文獻指出，給予動物短暫性全腦或局灶缺血對間隔一定時間后的嚴(yán)重腦缺血有一定保護作用，不僅可使缺血再灌注損傷體積縮小，而且可使神經(jīng)功能缺損減輕,此即“腦缺血耐受1-2。tia可否作為一種缺血預(yù)處理方式來保護缺血再灌注損傷的腦組織？臨床上用誘發(fā)tia作為一種治療缺血性卒中的措施要冒引起嚴(yán)重腦組織損傷的危險，而且也不現(xiàn)實。因此，我們通過建立缺血

4、預(yù)處理模型來研究缺血耐受機制，以期發(fā)現(xiàn)一種更好、更穩(wěn)定的預(yù)處理方法。1材料與方法1.1實驗動物及分組安康新西蘭白兔35只,雌雄不限,體質(zhì)量2.23.2kg江蘇大學(xué)動物中心提供,自由進食和飲水，12h晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。所有動物隨機分為3組:假手術(shù)組5只，顯露頸總動脈4h后關(guān)閉頸部，不做其他任何處理；缺血組10只，直接將微導(dǎo)絲從頸總動脈a經(jīng)頸內(nèi)動脈(ia)插至大腦中動脈(a)起始部4h。預(yù)處理組20只，方法同缺血組,將微導(dǎo)絲堵塞15in，再灌時,抽回導(dǎo)絲至頸總動脈內(nèi)15in，如此重復(fù)3次，之后導(dǎo)絲堵于大腦中動脈起始部4h。1.2微導(dǎo)絲的制備根據(jù)預(yù)實驗選擇頭端直徑為0.46的導(dǎo)絲(teru,日本),自頭

5、端截取導(dǎo)絲10,紫外線消毒后置于1%肝素溶液中備用。1.3動物模型的制作術(shù)前動物禁食24h,3%戊巴比妥鈉按體質(zhì)量1l/kg)耳緣靜脈麻醉，固定。取頸部正中切口,逐層別離皮下組織,在氣管旁找到頸血管鞘，別離鞘膜，于甲狀軟骨上緣程度顯露右側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)。用彎鑷從頸總動脈下方穿雙股4-0的絲線備用，結(jié)扎頸總動脈近心端。在頸總動脈處穿入留置針，固定，注入比照劑(優(yōu)維顯)約5l,同時在數(shù)字減影血管造影dsa下掃描獲得頸內(nèi)動脈及大腦前、中、后動脈的圖像，緩慢向頸總動脈插入微導(dǎo)絲，在dsa下觀察導(dǎo)絲走行，經(jīng)頸內(nèi)動脈插至大腦中動脈起始部，當(dāng)導(dǎo)絲頭端接近大腦中動脈起始部時，放慢速度，動作輕柔，遇阻力時觀

6、察導(dǎo)絲頭端位置，再次注入比照劑，如大腦中動脈血流被阻斷即說明導(dǎo)絲頭端已到達大腦中動脈起始部圖1。將導(dǎo)絲與頸總動脈結(jié)扎固定，防止挪動和出血。記錄時間作為大腦中動脈阻塞開場時間,逐層縫合頸部切口,留置剩余導(dǎo)絲,于體外再灌時抽回導(dǎo)絲至頸總動脈內(nèi)。圖1大腦中動脈栓塞的dsa圖像fig1andsa1.4模型成功的標(biāo)準(zhǔn)動物存活，手術(shù)操作順利,術(shù)中無大出血,麻醉反響正常,兔清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體不同程度的偏癱。tt染色右側(cè)出現(xiàn)不同程度無紅染區(qū)及he染色出現(xiàn)病理改變?yōu)槟Ｐ统晒Φ臉?biāo)準(zhǔn)。未成功的實驗動物,在完成所需檢查或死亡后開顱取腦觀察,尋找不成功或死亡原因。1.5神經(jīng)功能缺損體征評分方法參考kili等3的報道,即

7、5級評分法:0-正常運動功能；1-動物的軀干和病灶對側(cè)前肢呈屈曲狀態(tài)；2-動物行走時向病灶對側(cè)作轉(zhuǎn)圈運動，但在安靜休息時姿勢正常；3-在安靜休息時動物姿勢倒向病灶對側(cè)，不能站立；4-沒有自發(fā)的運動動作。1.6ri檢查微導(dǎo)絲栓塞大腦中動脈4h后，于再灌注1，3，6，12，24h行ri掃描。采用西門子agnettriti3.0tr掃描儀,動物仰臥于頭線圈中央,在定位相上取視穿插平面為中心層面,行冠狀位連續(xù)掃描,層厚4,層間距0.4。部分掃描參數(shù)如下:t1i:tr500s,te83s,fv100100,矩陣256256；t2i:tr3000s,te82s,fv100100,矩陣256256；di:t

8、r3000s，te97s,在x,y,z軸三個方向分別施加擴散敏感梯度b值取0，150，300，500，1000s/2，fv100100,矩陣256256。1.7組織病理染色在最后一次r檢查完畢后立即用戊巴比妥鈉過量麻醉將兔處死，完好取出大腦，置于冰箱中冷藏。1520in后取出兔腦，沿冠狀面均勻切成4厚的腦片。腦片迅速放入2tt2，3，5-三苯基四氮唑生理鹽水溶液中，置入37恒溫水浴箱避光反響30in，取出后用10甲醛溶液反復(fù)屢次置換，固定24h后進展he染色。2結(jié)果2.1血管造影血管造影可明晰顯示頸內(nèi)動脈的走行及其顱內(nèi)分支情況,如大腦前動脈、大腦中動脈、大腦后動脈及椎基底動脈。此外由于導(dǎo)絲不透

9、x線,還可在透視下觀察其位置，準(zhǔn)確定位。當(dāng)微導(dǎo)絲頭端到達大腦中動脈起始部時注入比照劑，發(fā)現(xiàn)比照劑無法進入大腦中動脈，即大腦中動脈血流被完全阻斷。缺血組10只兔中1只因麻醉過量死亡，1只因?qū)Ыz進入頸內(nèi)動脈時發(fā)生痙攣，利多卡因治療后5in仍無法緩解而被去除,成功率為80%8/10。預(yù)處理組20只兔，3只因麻醉過量死亡，2只因?qū)Ыz進入頸內(nèi)動脈時發(fā)生痙攣，利多卡因治療后5in仍無法緩解而被去除，2只于缺血后4h內(nèi)死亡，1只于預(yù)處理過程中死亡，ri及tt，he染色未見異常，成功率為60%12/20。2.2ri表現(xiàn)假手術(shù)組r掃描未發(fā)現(xiàn)明顯異常。缺血組于缺血4h再灌注624h后行連續(xù)ri檢查，缺血/再灌注后

10、3h就可在t2i，di表現(xiàn)為右側(cè)海馬及外側(cè)基底節(jié)區(qū)高信號，di范圍大于t2i，t1i表現(xiàn)為稍低信號，之后信號范圍逐漸擴大。于24ht2i范圍根本不變且t2i與di范圍相近。tt染色將正常組織染成紅色,梗死腦組織不染色而呈白色,不染色的范圍與導(dǎo)絲栓塞后t2i上的病變范圍根本一致(圖2，圖3)。預(yù)處理組處理后，亦再灌注624h。其中10只3ht2i，di上亦可見右側(cè)高信號區(qū)，之后范圍漸擴大，但24ht2i不再變化的范圍較小及邊緣模糊，2只24h仍不出現(xiàn)異常信號。出現(xiàn)信號改變的10只動物tt染色根本為紅色，僅小部分區(qū)域不著色，仍與t2i高信號區(qū)對應(yīng)圖4，5；2只不出現(xiàn)信號改變的tt染色為均質(zhì)紅染。最

11、終t2i高信號區(qū)體積即梗死體積及平均梗死面積比擬，缺血組大于預(yù)處理組p0.05，且分別與之對應(yīng)tt染色后無紅染區(qū)體積與平均無紅染面積相符見表1。表1缺血組與預(yù)處理組最終梗死體積及平均梗死面積2.3大體及組織病理表現(xiàn)假手術(shù)組大體標(biāo)本、tt染色及he染色均未見明顯異常。缺血組、預(yù)處理組大體標(biāo)本梗死區(qū)顏色較正常側(cè)白，可見因?qū)Ыz插入梗死半球的顏色較對側(cè)白，留下少許血跡，觸感似豆腐渣圖6。he染色示梗死區(qū)部分核碎裂，不能顯示完好的細(xì)胞核圖7，神經(jīng)元構(gòu)造模糊，軸突構(gòu)造不清圖8。2.4神經(jīng)功能缺損評分缺血組腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能缺損評分多在23級,主要表現(xiàn)為向左側(cè)傾倒，通常無意識狀態(tài)的改變。預(yù)處理組神經(jīng)功

12、能缺損評分多在01級，明顯低于缺血組。3討論3.1模型的制作目前有多種方法制作大腦中動脈缺血模型。經(jīng)眶入路結(jié)扎或夾閉大腦中動脈起始部由于手術(shù)損傷大,術(shù)中出血多以及磁共振研究時偽影影響實驗結(jié)果，近年來根本被線栓法取代?？琢铉?研究了如何進步線栓法制作大腦中動脈局灶性兔腦缺血模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性的問題。我們在模型的制作中對其進展了借鑒,并做了一些改良，只需別離出一段長約10的頸總動脈,直接從頸總動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈插至起始部,不用返折頸外動脈與頸內(nèi)動脈成一直線,再灌時,抽回導(dǎo)絲至頸總動脈內(nèi)即可。導(dǎo)絲具有一定的韌性,而且頭端圓滑稍彎曲,直徑大小恒定便于控制,更易通過頸動脈孔及頸內(nèi)動脈虹吸段。此外,還可

13、在透視下觀察導(dǎo)絲的位置。3.2造模失敗主要原因主要有以下3種。麻醉意外。我們的經(jīng)歷是首次注射量要足，因為二次追加極易引起麻醉過量死亡，劑量很難控制；另外，當(dāng)麻藥劑量接近致死量時，注射速度要相當(dāng)緩慢，注意觀察呼吸，一旦呼吸停頓立即復(fù)蘇。手術(shù)意外。手術(shù)時盡量防止?fàn)坷?、刺激迷走神?jīng)和氣管。兔子血管變異大，假如顯露有困難，應(yīng)另辟途徑。血管痙攣。無論顯露血管時或?qū)Ыz插入時刺激血管都易引起痙攣，阻礙導(dǎo)絲繼續(xù)前行?？捎美嗫ㄒ蚪獐d，5in后仍無法緩解者，本實驗將其剔除。插導(dǎo)絲時動作緩慢、輕柔可減少血管痙攣發(fā)生。3.3ri評價總之,本實驗通過微導(dǎo)絲法建立兔局灶性腦缺血預(yù)處理模型,缺血效果肯定,梗死部位恒定,重

14、復(fù)性好,并合適影像學(xué)研究,為進一步開展缺血預(yù)處理的病理生理變化的研究和r影像學(xué)研究奠定了基?！緟⒖嘉墨I】2李文斌，周愛民，李青君,等.全腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠海馬缺血耐受的實驗研究j.中國應(yīng)用生物學(xué)雜志,2002，18(2)：109-113.4孔令琦,謝敬霞,韓鴻賓,等.進步線栓法大腦中動脈閉塞性兔腦缺血模型穩(wěn)定性和可重復(fù)性的研究j.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2022,20(2):209-212.6sajlvid,sinanvi.sensitivityftheneuriagingtehniquesinisheistrkej.edarh,2022,58(5):282-284.7riverss,ardlaj.hathasdiffusiniaginginanialstldusabutdiffusiniaginginpatientsithisheistrkej.erebrvasdis,2022,19(5):328-336.8uttssb,sinje,eliaszi.triagintransientisheiattakandinrstrke