1、吡咯類抗真菌藥物制劑微生物限度檢查方法的研究劉文杰江志杰余立高春王似錦摘要目的：研究建立吡咯類抗真菌藥物制劑的微生物限度檢查方法。方法：通過預(yù)試驗探索，擬以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及沖洗液，采用離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用的方法進展此類藥物的微生物限度檢查并進展方法學驗證。結(jié)果：按?中國藥典?2022年版附錄要求對擬定方法進展驗證，結(jié)果驗證菌株的回收率均大于70%，控制菌檢查陽性菌也生長良好。結(jié)論：以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及沖洗液，采用離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用進展吡咯類抗真菌藥物制劑的微生物限度檢查，方法是可行的。關(guān)鍵詞吡咯類抗

2、真菌藥物制劑；微生物限度檢查；離心集菌法；薄膜過濾法Abstratbjetive：Testablishaethdfirbialliittestntheantifungaldrugfpiridi.ethds：Ardingttheresultftestbefrehand,eusedthehistidine,leithin,Teen80ixedslutinasthediluentandltin.Theethdsfntrifugalpreipitatinandebranefiltratinereusedfrlletingbateriaandvalidatinfirbilgialtest.Results

3、:Theratifreveriesffivegerserebiggerthan70%,andtherequireentfthePharaEiafhina(hP)2022erereahed.nlusin:Theethdissuitablettheirbialliittestfrtheantifungaldrugfpiridi.KeyrdsAntifungaldrugfpiridi;Validatinfirbilgialtest;entrifugalpreipitatin;ebranefiltratinethds吡咯類抗真菌藥，如硝酸布康唑和克霉唑，具廣譜抗真菌活性，對表皮癬菌、毛發(fā)癬菌、曲菌、著

4、色真菌、隱球菌屬和念珠菌屬均有較好的抗菌活性。該類藥物通過干擾細胞色素P-450的活性，從而抑制真菌細胞膜主要固醇類-麥角固醇的生物合成，損傷真菌細胞膜并改變其通透性，導(dǎo)致重要的細胞內(nèi)物質(zhì)外漏，還可抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化酶和過氧化酶的活性，引起細胞內(nèi)過氧化氫積聚，導(dǎo)致細胞亞微構(gòu)造變性和細胞壞死。此類藥物對細菌也有一定的抑制作用。根據(jù)目前國內(nèi)要求，非規(guī)定滅菌的藥物制劑均需建立微生物限度檢查方法，包括抗細菌和抗真菌類藥物制劑，但由于此類藥物抗菌活性很強，因此如何消除其抑菌性，使檢驗得以順利進展就成為建立方法時極為重要也是較為困難的關(guān)鍵點。本文作者選擇目前在國內(nèi)還沒有適宜微生物

5、限度檢查方法的吡咯類如硝酸布康唑和克霉唑抗真菌藥物制劑進展了試驗研究，經(jīng)屢次試驗，重點對沖洗液組成和沖洗量進展考察研究和優(yōu)選，最終參考?歐洲藥典?確定了以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及沖洗液，采用離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用，從而建立了硝酸布康唑類和克霉唑類藥物制劑的微生物限度檢查方法，并進展了方法學驗證，結(jié)果說明該方法是適宜可行的。1試藥與儀器1.1試藥硝酸布康唑陰道乳膏3批，克霉唑陰道片2個廠家各3批，復(fù)方克霉唑乳膏3批，克霉唑乳膏3批，醋酸米康唑乳膏3批，均為市售藥品；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，改進馬丁培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基，溴化十六烷

6、基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，均購自中國藥品生物制品檢定所；組氨酸、卵磷脂、聚山梨酯80、蛋白胨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為市售分析純試劑、試藥；金黃色葡萄球菌(B)26003，枯草芽孢桿菌(B)63501，大腸埃希菌(B)44102，銅綠假單胞菌(B)10104，白色念珠菌(F)98001，黑曲霉(F)98003，以上菌種均購自中國藥品生物制品檢定所菌種室，按照?中國藥典?2022年版附錄的要求將以上5種驗證菌配制成每1l中含菌量為50100fu的菌液。1.2儀器干凈工作臺，醫(yī)用吸引器，低速離心機等。2方法與結(jié)果2.1藥典附錄收載方法試驗的結(jié)果將上述各藥品用?中國藥典?

7、2022年版推薦的常用稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成110的供試液，依次采用藥典附錄收載的幾種消除藥物抑菌性的處理方式，即培養(yǎng)基稀釋法取110的供試液按每皿0.2l或取1100的供試液按每皿0.2l注皿、離心沉淀集菌法和以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液的薄膜過濾法、以及將離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用進展菌落計數(shù)試驗。其中，以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，沖洗總量已達1000l的離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用試驗回收率測定結(jié)果見表1。2.2回收率測定即使采用了處理力度較大的離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用，種驗證菌株中仍有4種回收率為零，說明吡咯類抗真菌藥

8、物具有很強的抑制細菌和真菌的作用，或說明濾膜對此類藥物有較強的吸附作用，目前常用的沖洗液很難將其沖洗干凈，國內(nèi)常用的幾種處理方式均不適用于此類藥品。2.3不同配方稀釋劑與沖洗液的效果比擬參考?中國藥典?2022年版1、?歐洲藥典?第5版2，配制了以下5種稀釋劑與沖洗液，詳見表2。選用一批克霉唑陰道片，依次試驗上述5種稀釋劑與沖洗液，采用離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用，比擬實驗效果，詳見表3。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.論文聯(lián)盟.LL.編輯。上述結(jié)果說明，采用歐洲藥典配方溶液且卵磷脂為進口試劑，或采用自擬5號溶液作為稀釋劑與沖洗液均對消除藥品的抑菌性效果較為滿意，但當卵磷脂改為國產(chǎn)試劑時，由于溶液呈混

9、濁狀，無法進展過濾。將卵磷脂和聚山梨酯80的量降為歐洲藥典配方量的一半時，溶液澄清度可不受試劑質(zhì)量影響，同時沖洗效果也可滿足實驗要求。2.4建立的方法2.4.1根據(jù)上述試驗結(jié)果建立方法取供試品10g，參加含有無菌組氨酸-卵磷脂-聚山梨酯80的混合溶液配制方法見后至100l，在45保溫振搖至供試品分散均勻，制成110的均勻供試品儲藏液。細菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)均采用離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用。取110的供試品儲藏液50l，以500r/in的速率離心5in，取全部上清液，加上述混合溶液至50l，再以3000r/in的速率離心20in，取底部集菌液約5l，加上述混合溶液至50l，即為110的供

10、試液乳膏等制劑可略去沉淀步驟。取110的供試液1l，加至上述混合溶液100l中，用薄膜過濾器全部過濾，以上述混合溶液作為沖洗液，每次沖洗100l，共沖洗3次，取濾膜，依法檢查?中國藥典?2022年版二部附錄J。2.4.2控制菌檢查如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等采用離心沉淀集菌法與薄膜過濾法聯(lián)用。取上述菌落計數(shù)項下110的供試液10l，加至上述混合溶液100l中，用薄膜過濾器全部過濾，沖洗方式同菌落計數(shù)項下，將濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，依法檢查(?中國藥典?2022年版二部附錄J)。2.4.3無菌組氨酸卵磷脂聚山梨酯80混合溶液配制方法聚山梨酯8015g，卵磷脂1.5g，組氨酸0.5g，蛋白胨

11、0.5g，氯化鈉2.15g，磷酸二氫鉀1.8g，磷酸氫二鈉3.6g，水1000l，混勻，微溫溶解，分裝，滅菌。2.5驗證試驗按照?中國藥典?2022年版附錄要求對上述建立的方法進展驗證。2.5.1細菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗證菌液組：分別取上述5種菌液各1l，采用平皿計數(shù)法，測定制備好的菌液中每毫升的活菌數(shù)。供試品對照組：取110的供試液1l，參加上述混合溶液100l，用薄膜過濾器全部過濾，沖洗方式同上，取濾膜，置規(guī)定溫度培養(yǎng)、計數(shù)。試驗組：取110的供試液1l，按供試品對照組同法操作，在第三次沖洗液中參加1l上述菌液50100fu試驗菌，取濾膜，置規(guī)定溫度培養(yǎng)、計數(shù)，計算回收率，見表4

12、。稀釋劑對照組：分別取上述5種菌液各10l5001000fu試驗菌，按供試品對照組同法操作，計算回收率，見表4。按以下公式計算回收率(%)：上述實驗顯示，各驗證菌的回收率均到達藥典附錄要求，說明該類藥品采用此法進展細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)是可行的。2.5.2控制菌檢查方法的驗證試驗組：取上述110的供試液10l，加至上述混合溶液100l中，用薄膜過濾器全部過濾，沖洗方式同上，將濾膜加至相應(yīng)培養(yǎng)基100l中進展增菌培養(yǎng)，作為供試品組?？瞻讓φ战M：取上述混合溶液10l，同法操作，作為稀釋劑空白對照組。陰性菌對照組：取110的供試液10l，加至上述混合溶液100l中，用薄膜過濾器全部過濾，沖洗方式同上

13、，但在第3次沖洗液中參加適宜的陰性對照菌如金黃色葡萄球菌檢查就選用大腸埃希菌作為陰性對照菌10100fu，將濾膜加至相應(yīng)培養(yǎng)基100l中作為陰性菌對照組。陽性菌對照組：取110的供試液10l，加至上述混合溶液100l中，用薄膜過濾器全部過濾，沖洗方式同上，但在第3次沖洗液中加適宜的菌如金黃色葡萄球菌檢查就參加金黃色葡萄球菌10100fu，將濾膜加至相應(yīng)培養(yǎng)基100l中作為陽性菌對照組。上述各組均置3537培養(yǎng)1824h，分別劃線于相應(yīng)培養(yǎng)基上，再置3537培養(yǎng)1824h，結(jié)果陽性菌對照組均生長良好，說明該類藥物經(jīng)此法處理后已無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計；陰性菌均未檢出，說明該控制菌檢查方

14、法的專屬性好，說明方法可行。3討論本實驗研究說明吡咯類藥物對細菌和真菌同時具有很強的抑菌作用，對于這類具有較強抗菌活性的藥物必須首先探索處理方式來消除其抑菌作用，然前方能順利進展其微生物限度檢查。假設(shè)采用薄膜過濾法進展藥品的微生物限度檢查，選用的稀釋液和沖洗液的種類和用量非常重要，甚至可以決定方法的適用與否。作為微生物限度檢查用稀釋液和沖洗液，不單應(yīng)具有溶解藥物的功能，同時還應(yīng)具有維持菌體細胞膜的通透性、修復(fù)受損細胞、破壞藥物對菌體細胞損傷等作用。本實驗確定的沖洗液的處方中組氨酸是白色念珠菌生長中重要的氮源之一；卵磷脂對于細胞膜的修復(fù)可起到重要的作用；聚山梨酯80作為一種外表活性劑，可降低細菌體周圍與培養(yǎng)基接觸面之間的外表張力，使外圍營養(yǎng)物質(zhì)更快地進入細胞內(nèi)，因此促進細菌較快的生長和其他活動。卵磷脂和聚山梨酯80配合使用可中和抑菌劑，中和后的產(chǎn)物對細菌及培養(yǎng)基無太大影響，因此在稀釋液和沖洗液中參加這些物質(zhì)可有效的降低藥品對細菌和真菌的抑制作用，同時促進受損的細菌和真菌生長。某些國產(chǎn)試劑、試藥與進口品存在一定的質(zhì)量差異，?歐洲藥典?收載的沖洗液配