1、內(nèi)毒素的去除是做蛋白表達(dá)時至關(guān)重要的一步，同時也是非常棘手的問題，本文就針對內(nèi)毒素的去除方法以及各方法的注意事項(xiàng)進(jìn)行了歸納總結(jié)。、什么是內(nèi)毒素？內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來，所以叫做內(nèi)毒素。所有能引起熱原反應(yīng)的物質(zhì)稱為熱原。藥品中的熱原主要是細(xì)菌內(nèi)毒素。一般可以認(rèn)為：細(xì)菌內(nèi)毒素是熱原，但熱原不等于細(xì)菌內(nèi)毒素。二、細(xì)菌內(nèi)毒素的理化性質(zhì)耐熱性：徹底滅活需250C高溫干烤一小時水溶性：可溶于水，生產(chǎn)中可用無熱原水沖洗以除去熱原。不揮發(fā)性被吸附性：可被活性碳吸附被酸堿破壞：0.1MHCI或0.1MNaOH浸泡4小時被氧化劑破壞：30

2、%雙氧水浸泡4小時，可完全破壞三、器皿中內(nèi)毒素的去除：干熱法適用對象：耐熱物品如玻璃制品、金屬制品等生產(chǎn)過程中所用的容器處理方法180C34h或250C30min2h注意事項(xiàng)：1在干烤前，被加熱的玻璃器皿上最好不要有水珠，否則可能會使玻璃器皿損壞。2烘烤結(jié)束后，玻璃器皿不要馬上從電熱烘箱中拿出，要等溫度適度降低之后才可以拿出，以免因溫差太大而造成玻璃器皿損壞。3器皿上不能含有紙質(zhì)或塑料制品，以免烘烤時燃燒或熔化?；瘜W(xué)降解法適用對象：主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的內(nèi)毒素。處理方法：常用35%雙氧水、重鉻酸鉀硫酸清潔液(重鉻酸鉀：硫酸：水常用配比1：1：10或1：2：8)、0.1M

3、HCI或0.1MNaOH浸泡去除。一般處理4h以上。注意事項(xiàng)：佩戴防護(hù)用具，防止皮膚直接接觸。四、溶液中內(nèi)毒素的去除方法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)液相分離法一些去污劑，如TritonX-114,脫氧膽酸鈉能夠和內(nèi)毒素的脂質(zhì)部分結(jié)合，通過液相分離的方法萃取內(nèi)毒素從而使后者有效地去除。對內(nèi)毒素的去除率高，且不影響有效成份的活性。該法簡單高效、價格低廉、適合大規(guī)模應(yīng)用，在我們?nèi)粘５牡鞍准兓休^為常用。去內(nèi)毒素后的樣品會有微量去污劑的殘留。分子篩法分子篩是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種方法。由于蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的分子量有較大差別，因此利用分子篩可以有效去除內(nèi)毒素。去除效果明顯每次處理量小，處理時間較長

4、。離子交換色譜法當(dāng)溶液PH2時，內(nèi)毒素帶有負(fù)電荷。因此內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAESepharoseFastFlow有較強(qiáng)結(jié)合。柱上的內(nèi)毒素可在洗脫目標(biāo)蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。成本低，吸附容量大但不適合于溶液中存在其它帶負(fù)電荷物質(zhì)的情況。親和色譜法將適當(dāng)?shù)呐浠梯d于色譜基質(zhì)上合成出親和介質(zhì)，使它特異性結(jié)合內(nèi)毒素。GenScript將多粘菌素B(PMB)偶聯(lián)于SepharoseFF上，以此介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素。高效能、高選擇性相對成本較咼。超濾法由于內(nèi)毒素具有較大的相對分子質(zhì)量，因此可選用超濾膜去除溶液中的內(nèi)毒素。操作簡單，處理量大操作過程中的壓力較高。不適合含有較大相對分子質(zhì)量

5、成份的樣品。因?yàn)樵诔嵩耐瑫r會阻留或吸附樣品中的有效成份，使產(chǎn)品收率大受影響。吸附法活性炭用于去除內(nèi)毒素是由于內(nèi)毒素的相對分子質(zhì)量較大。適合于組分較為簡單的小分子的溶液中或水中去除內(nèi)毒素?；钚蕴砍Ｓ昧繛?.1%0.5%。成本低，處理量大?；钚蕴康倪x擇性較差，易吸附有效成份，純化后溶液中的殘余活性炭不易去除，且自身可能含有的重金屬造成樣品污染，因此目前很少使用蒸餾法此方法可用于生產(chǎn)去熱源水，作為注射用水或洗滌水。去除效果明顯成本較高疏水層析法內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強(qiáng)的疏水性，但在高鹽下會凝集，無法掛上疏水層析柱。因此可選擇能結(jié)合目標(biāo)蛋白的疏水介質(zhì)去除內(nèi)毒素適用于高鹽濃度的樣品目前技術(shù)不夠成熟

6、，還需要進(jìn)一步探索但是，各種去內(nèi)毒素的方法不是孤立的，可以相互結(jié)合使用。比如，如果液相分離法得到的蛋白內(nèi)毒素水平未達(dá)標(biāo)，可以接著利用分子篩法進(jìn)一步去除內(nèi)毒素。五、作為目前去內(nèi)毒素常用的方法，液相分離法的注意事項(xiàng)值得我們重視1液相分離方法應(yīng)用于蛋白純化中內(nèi)毒素的去除目的蛋白上樣后，用預(yù)冷的基礎(chǔ)溶液+1%TritonX-114緩慢淋洗柱子，直至A280數(shù)值穩(wěn)定不變;b用預(yù)冷的去內(nèi)毒素基礎(chǔ)溶液淋洗柱子，直至A280數(shù)值達(dá)到基線，穩(wěn)定不變；用各梯度去內(nèi)毒素的洗脫液洗脫，收集各洗脫液于去內(nèi)毒素的收集管中。d此方法適用廣泛，如我們常用Ni柱GST柱和離子交換柱等純化。e.純化過程應(yīng)盡量在潔凈的環(huán)境下進(jìn)行，

7、純化時間不宜過長。f所用的吸管、槍頭等器材應(yīng)為經(jīng)去內(nèi)毒素處理的。2.液相分離法應(yīng)用于大量樣品中內(nèi)毒素的去除a在大量蛋白樣品中加入終濃度為1%的TritonXT14，充分混勻，冰浴5min，使之成為一相；b升溫超過其濁點(diǎn)21C，37C孵育，觀察分層情況；待溶液中出現(xiàn)明顯分層后，室溫下12000r/min，離心5min，吸取上清液；為達(dá)到較好的去除效果，可以重復(fù)2次。如果樣品內(nèi)毒素含量較高，可以提高TritonXT14濃度至2%。f如果升溫至37C后，分層不明顯或比較慢，可以升溫至56C孵育。g.本方法不適用于去除膜蛋白中的內(nèi)毒素六、去內(nèi)毒素試劑的配置在溶解前將固體試劑用180C烘4-5h，以去除試劑中的水分和內(nèi)毒素。此法適用于試劑的熔點(diǎn)高于180C。若試劑熔點(diǎn)低于180C，常使用80C烘過夜。去內(nèi)毒素的水溶解烘過的試劑，定容，調(diào)節(jié)pH。檢測所配置試劑的內(nèi)毒素含量是否達(dá)標(biāo)，通常為0.01EU/ml。常見的熔點(diǎn)低于180C或高溫分解的試劑：1.Tris（168-172C）2.尿素（