1、第四章 噬菌體載體及粘粒一、噬菌體的一般生物學(xué)特性(Bacteriophage)-phagos結(jié)構(gòu)（頭部、尾鞘、尾盤、尾針、尾環(huán)、尾纖絲）無尾的二十面體、具尾的二十面體、線狀體早、中、晚期基因表達(dá)基因組結(jié)構(gòu)二、噬菌體載體的構(gòu)建插入型載體 替代型載體CI基因 SupE（抑制琥珀突變基因）-UAG 麥康凱區(qū)別:插入位點(diǎn)、容量噬菌體的包裝限制：75%105%J基因到N基因非必要區(qū)段占DNA總長度的1/3三、噬菌體的體外包裝*重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染(transfection)作用105106噬菌斑/gDNA*體外包裝轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)體外包裝過程尾部突變-頭頭部突變-尾E-72%E-累積

2、尾部蛋白D-與DNA進(jìn)入頭部及頭部成熟有關(guān)D-累積頭部蛋白四、凱倫噬菌體載體(charon)兩類特點(diǎn)：酶切位點(diǎn)多、含LacZ、容量大克隆程序:分離線性噬菌體DNA-酶切分離左右臂+中央?yún)^(qū)段-與外源DNA混合-包裝幾kb23kb噬菌體載體及派生載體的優(yōu)點(diǎn)：感染效率高2、柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)*具有噬菌體的特性（環(huán)化）*具有質(zhì)粒載體的特性*高容量3、柯斯克隆優(yōu)點(diǎn)：容量大、非重組體少問題：分子內(nèi)重組成多聚體（堿性磷酸酶處理） 基因間連接（電泳分級分離）七、噬菌體展示載體(phage display)絲狀噬菌體（M13/fd)表面-35拷貝geneIII產(chǎn)物-顆粒組裝及F性須吸附G.P.Smith-198

3、5建立-在噬菌體表面表達(dá)蛋白應(yīng)用：噬菌體表面展示文庫 *原理 *分離hGH變體八、噬菌粒載體(phasmid)M13類的缺陷：-插入后遺傳穩(wěn)定性下降，且與片段大小有關(guān)-實際上總以正向插入-容量有限（1500bp）改進(jìn)的M13類-噬菌粒-分子?。?kb-容量10kb-雙向性（細(xì)菌質(zhì)粒和phage）T3+T71、噬菌體載體的類型及其比較。2、噬菌體的體外包裝原理。3、什么是凱倫噬菌體載體？有怎樣的特點(diǎn)？4、什么是柯斯質(zhì)粒載體？有怎樣的特點(diǎn)？5、單鏈DNA噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)。6、噬菌體展示載體的工作原理。7、噬菌粒載體的特點(diǎn)。復(fù)習(xí)提綱 Clerke&Carbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/

4、g)特異mRNA拷貝數(shù)/總mRNA種類可克隆片段大小/基因組總長度mRNA豐度克隆基因的大小(載體容量)10670/29%=87000N=ln(1-99%)/ln(1-1/87000)=1.7x1053、RNA的制備及純化總RNA的提取mRNA的純化-oligodT-纖維素柱層析特異mRNA的富集（mRNA分級分離、 蔗糖密度梯度離心）特異mRNA的分析鑒定*mRNA體外翻譯（麥胚、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞）*RNA電泳-Northern BlotRNaseH方法Self-priming同聚物加尾重組-linker二、cDNA基因文庫的篩選與特異重組體的鑒定1、遺傳檢測*利用載體提供的表型特征*插入基因功

5、能表達(dá)2、物理檢測*凝膠電泳3、核酸探針（screening a library)4、免疫化學(xué)檢測*標(biāo)記抗體探針*免疫沉淀5、轉(zhuǎn)譯篩選法*雜交抑制的轉(zhuǎn)譯-豐富mRNA*雜交選擇的轉(zhuǎn)譯-低豐度mRNA-insulin6、正負(fù)篩選法組織特異性、發(fā)育階段特異性、特殊處理后基因表達(dá)差異三、基因組DNA文庫的構(gòu)建與篩選1、基因組DNA文庫：匯集生物體所有DNA序列的重組DNA群體2、目的研究結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控序列基因組結(jié)構(gòu)3、目的基因的準(zhǔn)備*限制酶切法-鳥槍法(shot-gun approach) 霰彈法*DNA超聲隨機(jī)切斷*限制酶部分酶切-比較4、重組DNA分子的構(gòu)建噬菌體載體構(gòu)建柯斯質(zhì)粒載體構(gòu)建5、重組體的篩選四、PCR方法與化學(xué)合成在重組子篩選時，在Ap平板上常出現(xiàn)較大的菌落及周圍的小菌落，解釋這一現(xiàn)象的原因，如何減少這一現(xiàn)象氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化可將內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍區(qū)域中的抗生素，鋪平板時密度太高或培養(yǎng)時間太長都會導(dǎo)致出現(xiàn)對氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落。在選擇培養(yǎng)基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60g/ml增至100g/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。1、什么是cDNA文庫和基因組DNA文庫？各有怎樣的優(yōu)缺點(diǎn)？2、如何計算構(gòu)建文庫時的規(guī)模？其影響因素有哪些？3、cDNA文庫構(gòu)建過程及其關(guān)鍵步驟的處理和分析。4、cDN