1、含RIZ1 PR構(gòu)造域交融蛋白的原核表達(dá)、提純與功能分析摘要目的:表達(dá)與提純RIZ1第1個(gè)至第200個(gè)氨基酸含PR構(gòu)造域的活性GST交融蛋白質(zhì)GSTPR200交融蛋白。方法:設(shè)計(jì)引物以含人RIZ1DNA全序列的pRIZ1RH質(zhì)粒為模板克隆獲得目的基因片段，測序核對后經(jīng)ER與Xh雙酶切，以正確閱讀框架插入一樣酶切的pGEX6P3中，經(jīng)轉(zhuǎn)染與IPTG誘導(dǎo)表達(dá)挑選到陽性大腸桿菌克隆并提純該交融蛋白質(zhì)。分別采用SDSPAGE蛋白電泳法、質(zhì)譜分析法及組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶HT測定法鑒定其性質(zhì)與功能。結(jié)果：獲得的純化交融蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為47000，其P值明顯高于對照組P001，且與作用時(shí)間呈正相關(guān)。結(jié)論

2、:所構(gòu)建的交融蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)能有效表達(dá)活性GSTPR200交融蛋白，可供大量提取作進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞RIZ1蛋白；PR構(gòu)造域；表達(dá)載體；組蛋白甲基化作用RIZ1是功能性挑選能與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB腫瘤抑制因子相結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)別離出來的基因。已發(fā)現(xiàn)由于不同啟動子的作用，RIZ1可以表達(dá)兩種蛋白產(chǎn)物，即氨基端含有PR構(gòu)造域的全長產(chǎn)物RIZ11719個(gè)氨基酸，以及除缺少RIZ1氨基末端200個(gè)氨基酸包含PR構(gòu)造域外其余序列與RIZ1完全一樣的RIZ21。研究說明，RIZ1而非RIZ2具有腫瘤抑制特性。一般來說，RIZ1定位于人染色體1p36，為多種不同類型人癌組織所缺失2。許多人類腫瘤，如肝癌、結(jié)腸

3、癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤的組織中出現(xiàn)RIZ1而非RIZ2表達(dá)沉默35。我們初步研究也發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌組織中存在RIZ1RNA表達(dá)的改變6。人癌組織和細(xì)胞株中RIZ1錯(cuò)義失活性突變均出如今PR構(gòu)造域內(nèi)或其附近7。在乳腺癌細(xì)胞系、肝癌細(xì)胞系中由腺病毒介導(dǎo)的RIZ1表達(dá)可以造成細(xì)胞G2期阻滯和或細(xì)胞凋亡35。更重要的是基因敲除鼠假設(shè)無RIZ1表達(dá)而僅有RIZ2表達(dá)，那么易發(fā)生胃癌和B細(xì)胞淋巴瘤7。通過以上研究可以確定PR構(gòu)造域與腫瘤的發(fā)生有直接聯(lián)絡(luò)，因此，目前認(rèn)為RIZ1抑制腫瘤的作用與其PR構(gòu)造域有關(guān)。為了更好地研究RIZ1PR構(gòu)造域的功能與構(gòu)造，我們采用基因工程技術(shù)合成并提純了RIZ

4、1氨基末端含PR構(gòu)造域的200個(gè)氨基酸的交融蛋白，并初步討論了其體外功能，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法11材料pRIZ1RH質(zhì)粒由本研究組保存；原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX6P3購自AershaBisienes公司，是一種交融蛋白表達(dá)載體，含一個(gè)可編碼谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的讀碼框架，其下游有多克隆位點(diǎn)，插入符合相應(yīng)讀碼框架的外源基因片段，在IPTG的誘導(dǎo)下可表達(dá)出與GST相交融的蛋白質(zhì)；大腸桿菌1061菌株購自NeEnglandBilabs、大腸桿菌BL21DE3表達(dá)菌株購自EDBisienses由本課題研究組保存；PfuDNA聚合酶等PR試劑購自Stratagene公司；PR產(chǎn)物純化試劑盒(Q

5、IAquikPRPurifiatinKit)、大量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGENPlasidaxiKit)為QIAGEN公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶ER和Xh購自Ferentas公司；T4DNA連接酶購自NeEnglandBiLabs公司；GlutathineAgarse吸附柱購自Siga公司；人組蛋白H3購自upstate公司；AdensylLethinine，Sethyl3H購自PerkinEler公司；BiRad蛋白測定試劑盒購自BIRAD公司。12PR引物的設(shè)計(jì)與合成目的基因?yàn)楹琍R構(gòu)造區(qū)的PR200基因片段,位于RIZ1全基因序列的第1600個(gè)核苷酸(nt1600)。通過GenBank檢索R

6、IZ1的DNA序列，采用DNAStar軟件設(shè)計(jì)PR引物，上游引物GSTPR200P1序列為：5AGAATTATGGAAGTGAGGTTTTTT3，含ER酶切位點(diǎn)及啟始密碼子；下游引物GSTPR200P2序列為：5TTGAGTATTATGAGAGGTGAAATTGGT3，含終止密碼子及Xh酶切位點(diǎn)。引物由Invitrgen公司合成。13目的基因的PR擴(kuò)增以pRIZ1RH質(zhì)粒為模板，以GSTPR200P1、GSTPR200P2為引物，采用PfuDNA聚合酶PR擴(kuò)增目的基因。陰性對照以等量去離子水代替模板。其反響條件為：9513in熱啟動；9530s，5530s，7260s，30個(gè)循環(huán)；最后72延伸

7、10in。取PR產(chǎn)物5l，DNAarker1l，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察結(jié)果。產(chǎn)物純化后經(jīng)ABIPRIST310型基因分析儀PERKINELER測序確認(rèn)。14重組載體的構(gòu)建141PR反響產(chǎn)物的純化將以上PR產(chǎn)物點(diǎn)樣于2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)展電泳，使用PR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收，用20l去離子水溶解，取1l在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢查，純化成功后20貯存。142載體pGEX6P3的制備將原核表達(dá)載體pGEX6P3轉(zhuǎn)入大腸桿菌1061菌株。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒大量提取質(zhì)粒DNA，溶解于50l的去離子水中。20貯存。143PR200pGEX6P3原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建將純化后的

8、PR產(chǎn)物和pGEX6P3表達(dá)載體同時(shí)分別用核酸內(nèi)切酶ER與Xh雙酶切,并分別用PR產(chǎn)物純化試劑盒純化，氯仿抽提法回收。在T4DNA連接酶作用下，連接含PR基因片段與表達(dá)載體獲得了PR200pGEX6P3重組質(zhì)粒5498bp。15表達(dá)重組蛋白陽性克隆的檢測與鑒定用PR200pGEX6P3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3表達(dá)菌株,涂布含100gL-1AP的LB瓊脂平板，37恒溫培養(yǎng)過夜，平板上長出較好菌落。挑取陽性菌落接種在10l含青霉素抗性的LB試管中，37劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。次日按160的比例接種過夜，培養(yǎng)物于15l含青霉素抗性的LB試管中，于37劇烈振蕩培養(yǎng)至D600n為0508,均分該培養(yǎng)

9、物為兩局部，一局部參加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1lL-1以誘導(dǎo)GSTPR200表達(dá),另一局部不加IPTG作對照，繼續(xù)培養(yǎng)5h，每隔1h兩局部各取1l培養(yǎng)物離心后留沉淀細(xì)胞置-70冷凍過夜。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SDSPAGE)法，檢測與鑒定可以表達(dá)與GST交融的含PR構(gòu)造區(qū)蛋白質(zhì)(GSTPR200交融蛋白)的陽性菌落。16GSTPR200交融蛋白的提純與質(zhì)譜分析挑取GSTPR200交融蛋白表達(dá)陽性菌落接種在10l含青霉素抗性的LB試管中，37劇烈振蕩培養(yǎng)過夜,次日按160的比例接種于400l含青霉素抗性的LB培養(yǎng)瓶中，于37劇烈振蕩培養(yǎng)至D600n為0508，參加

10、IPTG至終濃度為1lL-1以誘導(dǎo)GSTPR200表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4050h。離心收取細(xì)胞，置-70冷凍過夜。次日用5lPBST重新懸浮細(xì)胞，于4溫度下超聲破碎細(xì)胞，利用GlutathineAgarse吸附柱提純GSTPR200交融蛋白。通過atersirassLT質(zhì)譜系統(tǒng)aters公司分析該蛋白質(zhì)的分子量。17純化GSTPR200交融蛋白的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(HT)活性測定采用BiRad蛋白測定試劑盒檢測純化的GSTPR200交融蛋白濃度后，按組蛋白HT測定法分析該蛋白質(zhì)的活性8。反響體系如下：總?cè)莘e為40l，含20lL-1TrisHlpH80，02lL-1Nal，04lL-1EDTA，1lL

11、-1DTT，4g純化的GSTPR200交融蛋白或GST蛋白陰性對照，5g組蛋白H3，3l165iAdensylLethinine，Sethyl3H。各反響混合物于37孵育1020h后，分別取5l各設(shè)3個(gè)測定樣品，共取15l反響物在P81上點(diǎn)樣、沖洗、晾干，采用LS6000I型液閃儀BEKAN公司測定每分鐘脈沖數(shù)P以說明蛋白質(zhì)HT活性度。2結(jié)果21PR擴(kuò)增的目的基因PR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為625bp，其中目的基因?yàn)?00bp，引入擴(kuò)增產(chǎn)物兩端的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列、啟始密碼子與終止密碼子識別位點(diǎn)序列及保護(hù)堿基長25bp。同DNA相對分子質(zhì)量參照物相比，PR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)測的結(jié)果一致圖1。圖1P

12、R擴(kuò)增PR200的結(jié)果(2%瓊脂糖電泳)略Fig1AplifiatinfPR200ithPR(2%agarsegel)1DNAladder；2Negativentrl；3PRprdut22檢出的表達(dá)重組蛋白陽性克隆經(jīng)SDSPAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色觀察，包含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌在相對分子質(zhì)量47000位置出現(xiàn)一蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在相應(yīng)位置的蛋白條帶要弱得多；含質(zhì)粒pGEX6P3的誘導(dǎo)菌在相對分子質(zhì)量27000位置出現(xiàn)一條帶。目的基因表達(dá)的多肽相對分子質(zhì)量為19700，與交融蛋白共同表達(dá)相對分子質(zhì)量約為47000，與理論估計(jì)值相一致。見圖2。圖2IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化大腸桿菌

13、BL21DE3菌株表達(dá)的SDSPAGE結(jié)果略Fig2SDSPAGEshingtheIPTGinduedexpressinfthetransfredEliBL21DE3ells1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；2未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化pGEX6P3的BL21細(xì)胞；3誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)化pGEX6P3的BL21細(xì)胞；4、6、8分別為未誘導(dǎo)的三個(gè)菌落的轉(zhuǎn)化PR200pGEX6P3BL21細(xì)胞；5、7、9分別為誘導(dǎo)后的三個(gè)菌落的轉(zhuǎn)化PR200pGEX6P3BL21細(xì)胞。每泳道加樣量約15g,12%膠。1StandardprtEins;2UninduedBL21ellsfpGEX6P3transfredlne;3InduedBL21ells

14、fpGEX6P3transfredlne;4,6,8UninduedPR200pGEX6P3transfredBL21ellsfthreelnes，respetively;5,7,9InduedPR200pGEX6P3transfredBL21ellsfthreelnes,respetively15gperlane,12%gel23GSTPR200交融蛋白的純化與質(zhì)譜分析通過GlutathineAgarse吸附柱提純的GSTPR200交融蛋白經(jīng)SDSPAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色，在相對分子質(zhì)量47000位置呈現(xiàn)單一的蛋白條帶圖3。質(zhì)譜分析可見46980處出現(xiàn)單一峰，進(jìn)一步明確了該純

15、化交融蛋白質(zhì)與預(yù)期的分子質(zhì)量一致圖4。圖3GSTPR200交融蛋白純化的SDSPAGE結(jié)果略Fig3SDSPAGEshingthepurifiatinfGSTPR2001：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；2：誘導(dǎo)后細(xì)胞破碎液；3：通過柱子后的細(xì)胞破碎液；4：洗柱液；5，6：蛋白洗脫液。每泳道加樣量約15g,12%膠。1Standardprteins；2Induedlysate；3Thrughfl；4ashingfl；5,6Elutins15gperlane,12%gel圖4純化GSTPR200交融蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果略Fig4assspetretryanalysisfthepurifiedGSTPR20024GSTP

16、R200交融蛋白對組蛋白甲基化作用采用HT測定法可見，GSTPR200交融蛋白組P孵育1、2h后的3個(gè)樣本P均值分別為81758、119283明顯高于對照組GST蛋白質(zhì)組,分別為13512、18421，兩者差異具有高度顯著性P001,且與作用時(shí)間呈正相關(guān)。3討論P(yáng)R構(gòu)造域是腫瘤抑制因子RIZ1的功能區(qū)域，本研究為了原核表達(dá)與純化含該構(gòu)造域的交融蛋白質(zhì)GSTPR200交融蛋白，選用了pGEX6P3載體。該載體具有GST交融特征，可利用此標(biāo)簽進(jìn)展純化。采用大腸桿菌BL21DE3表達(dá)菌的優(yōu)點(diǎn)在于該菌T7RNA聚合酶基因可受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，而且該菌沒有膜結(jié)合性蛋白分解酶活性，可抑制表達(dá)的交融蛋白質(zhì)分

17、解。本研究通過將重組載體PR200pGEX6P3轉(zhuǎn)入BL21DE3表達(dá)菌，成功地構(gòu)建了GSTPR200交融蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，并提純了該交融蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)PR結(jié)域可以使組蛋白H3中的第9賴氨酸甲基化，而人癌組織因PR構(gòu)造域基因突變造成RIZ1甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低89。本研究為了理解所獲得的GSTPR200交融蛋白是否具有甲基化活性，采用HT測定法對提純的交融蛋白質(zhì)進(jìn)展了檢測。由于組蛋白H3與甲基在HT的作用下可形成甲基化組蛋白H3，根據(jù)這一原理以3H標(biāo)記甲基3Hethyl，將其與組蛋白H3及受檢測的蛋白一起反響，通過測定P可反映形成的甲基化組蛋白H3的量，以說明該蛋白的HT活性。本研究中純化的

18、GSTPR200交融蛋白組P比對照組GST蛋白質(zhì)組明顯增高，說明得到的交融蛋白質(zhì)中PR局部具有HT活性。本研究純化蛋白的大量獲取為進(jìn)一步研究RIZ1PR區(qū)域的構(gòu)造與功能奠定了基矗參考文獻(xiàn)1HUANGSHistneethyltransferases,dietnutrientsandtuursuppressrsJ.NatureReviesaner,2002,2(6):4694762EITHA,BRDEURG,BRUNSGA,etalReprtfthesendinternatinalrkshpnhuanhrse1apping1995J.ytgenetisellGenetis,1996,72(23):1141443HEL,YUJX,LIUL,etalRIZ1,butntthealternativeRIZ2prdutfthesaegene,isunderexpressedinbreastaner,andfredRIZ1expressinausesG2ellylearrestand/rapptsisJ.anerRes,1998,58(19):423842444JIANGGL,LIUL,BUYSEI,etalDereasedRIZ1expressinbutntRI