1、地黃飲子含藥腦脊液對A25-35誘導(dǎo)PC12細胞損傷即早基因c-fos和c謝寧孟菲姚辛敏周妍妍何奇麗【摘要】目的探究古方地黃飲子對淀粉酶A2535所致P12細胞損傷時即早基因-fs和-jun表達的調(diào)控作用。要領(lǐng)把離體造就的進入對數(shù)生恒久的P12細胞分為空缺組、模子組、VitE腦脊液比擬組、地黃飲子腦脊液低、中、高劑量組，待24h細胞貼壁后吸去造就液,6組別離參加正常造就液、正常腦脊液、VitE腦脊液、地黃飲子腦脊液低、中、高劑量，加造就液補至等量，37孵育2h。然后除正常組參加等量造就液外，其他各組參加經(jīng)老化處置懲罰的A2535終濃度為10l/L，繼承孵育24h，然后離心網(wǎng)絡(luò)細胞，提取總RNA

2、。應(yīng)用RT-PR二步法和瓊脂糖凝膠電泳要領(lǐng)測定-fs和-jun基因的表達。結(jié)果地黃飲子能下調(diào)-fs和-jun基因的表達，并呈必然的劑量依靠性。結(jié)論地黃飲子腦脊液能顯著低落P12細胞受A2535刺激時即早基因-fs和-jun的過分反響，說明地黃飲子能進步P12細胞對外界不良刺激的應(yīng)激性?！娟P(guān)鍵詞】地黃飲子腦脊液P12細胞即早基因Keyrds:DetinfRehanniae;erebrapinal;Phehrytaderivedellline(P12ells);IediateEarlygene屬于神經(jīng)嵴源細胞之一的P12細胞與原代造就的細胞比擬，同源性較好且較易獵取，細胞保存時間長,易于不雅察。而

3、淀粉樣卵白在老年性癡呆阿爾茨海默病，AlzheieisDisease,AD患者腦中普及沉積，由其誘導(dǎo)的P12細胞的凋亡模子即為老年性癡呆病的一個較貼近的模子。即早基因(Iediateearlygene,IGE)又稱快反響基因、原癌基因(prt-ngers),該基因家屬有包羅-fs和-jun在內(nèi)的近百個成員。-fs和-jun在正常環(huán)境下到場細胞的生長、分化、信息通報、學(xué)習(xí)和影象等生理歷程，在遭受多種刺激因子，如缺血、缺氧、光芒刺激、機器刺激、疼痛刺激等時可被快速誘導(dǎo)過分表達。本實行探究古方地黃飲子對淀粉酶A2535所致P12細胞損傷時即早基因-fs和-jun表達的調(diào)控作用。1質(zhì)料與儀器1.1細胞

4、及動物P12細胞購自中科院上海生物細胞研究所。大耳白家兔，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實行動物中央提供。1.2地黃飲子構(gòu)成由熟地、山萸肉、肉蓯蓉、石斛、麥冬、五味子、石菖蒲、遠志、茯苓、肉桂、炮附子、巴戟天、薄荷等構(gòu)成由哈爾濱市松茂藥行提供。1.3質(zhì)料A25-35siga,DE造就基、胰卵白酶Hylne,5%胎牛血清杭州四序青生物成品，VitE大連南美制藥，引物、DNAarker大連寶生物，AdvantageR7-fr-PRkit(lnteh)中藥飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供。1.4儀器2要領(lǐng)2.1P12細胞的造就要領(lǐng)P12細胞造就于含10%胎牛血清56滅活30inDE的造就液中，并參加100U/l鏈霉素

5、，100U/l青霉素。細胞接種于造就瓶中，在37，5%2/95%氣氛，飽和濕度的造就箱中造就。2d換液1次，34d傳代1次，取對數(shù)生恒久細胞用于實行。2.2中藥腦脊液的提取要領(lǐng)2kg龐大耳白家兔，順應(yīng)性喂養(yǎng)3d，灌胃給服地黃飲子水煎劑、VitE(0.21g/l，吐溫80助溶于蒸餾水中)水溶液，灌服藥量均按成人量10倍給藥，空缺組給服等體積的蒸餾水。灌胃后1h，戊巴比妥鈉靜脈麻醉，于無菌條件下在枕骨大孔處垂直進針，抽取200l腦脊液，并增補等量等生理鹽水，以上步調(diào)一連3d，將3d得到的同一家兔的腦脊液混淆，-70凍存?zhèn)溆谩?.3分組及創(chuàng)立模子離體造就進入對數(shù)生恒久的P12細胞分為6組：空缺比擬組

6、簡稱空缺組、模子比擬組簡稱模子組、VitE組簡稱西對組、地黃飲子低劑量組簡稱中低組、地黃飲子中劑量組簡稱中中組、地黃飲子高劑量組簡稱中高組。待24h細胞貼壁后吸去造就液，別離參加空缺造就液10%、正常腦脊液10%、VitE腦脊液10%、中藥腦脊液低劑量5%、中劑量10%、高劑量20%。加造就液補至等量，37孵育2h。然后除空缺組之外的各組參加經(jīng)老化處置懲罰的A25-35終濃度為10l/L，創(chuàng)立AD細胞模子。空缺組參加等量的造就液，繼承孵育24h后將細胞吹打至懸浮狀，離心網(wǎng)絡(luò)細胞，提取總RNA。2.4RT-PR檢測-fs和-jun基因的表達接納Trizl提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系參照RT-PR二步法

7、AdvantageRT-fr-PRKit,lnteh。引物方案由美國NBI數(shù)據(jù)庫提供RNA全序列，用prier3引物方案軟件方案。Rat-fs：leftprier，5AGTTTTATAAT3rightprier5TTATTTTTTTG3(產(chǎn)物為370bp)；Rat-jun：leftprier，5AGAATGGGAATA3rightprier5TTGGGTTTTTA3(產(chǎn)物為451bp)；-atin:leftprier:5TGTGATGGTGGGTATGGG3rightprer:5TAGAAGATTTGGGTG3(產(chǎn)物為500bp)聚合酶鏈式反響PR條件：DNA2.0l,dNTP2.0l,10R

8、Tbuffer2.5l,上卑劣引物20l/L各0.5l，Taq酶0.25l,加去離子水至25l。反響參數(shù)：952in；941in，5545s，7245s，25個循環(huán)；74延伸10in。-atin的反響參數(shù)為955in；941in，551in，741in，25個循環(huán)；74延伸10in。PR產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠電泳下分散檢測。凝膠成像闡發(fā)體系舉行照相和闡發(fā)擴增產(chǎn)物電泳強度，以上實行重復(fù)3次，取均勻值。3結(jié)果3.1地黃飲子含藥腦脊液對P12細胞-fs基因表達的調(diào)控作用見圖1及表1。表1地黃飲子對P12細胞-fsRNA表達的影響略結(jié)果表現(xiàn)，模子組與空缺組比力，-fsRNA表達顯著增長P0.01，而參

9、加地黃飲子含藥腦脊液后可明顯低落-fsRNA表達P0.05或P0.01，且地黃飲子高劑量組優(yōu)于VitE比擬組P0.01。與模子組比力，*P0.05；*P0.01；與比擬組比力，P0.05；n=33.2地黃飲子含藥腦脊液對P12細胞-jun基因表達的調(diào)控作用見圖2及表2。表2地黃飲子對P12細胞-junRNA表達的影響略與模子組比力，*P0.05，*P0.01；與比擬組比力，P0.05；n=3結(jié)果表現(xiàn)，A25-35損傷模子組與空缺組比力，-junRNA表達顯著增長P0.01，經(jīng)治療后，各組-junRNA表達均有所落落P0.05或P0.01，且地黃飲子高劑量組優(yōu)于VitE比擬組。RT-PR結(jié)果表現(xiàn)

10、，地黃飲子含藥腦脊液可以或許下調(diào)-fs和-jun基因的表達,并呈必然的劑量依靠性,其表達程度低于VitE。電泳強度比力表現(xiàn)，模子組地黃飲子腦脊液低劑量組VitE比擬組地黃飲子腦脊液中劑量組地黃飲子腦脊液高劑量組空缺組結(jié)果見表12。4討論老年性癡呆AlzhEieisDisease,AD的發(fā)病機制尚未明白，腦內(nèi)突出病理表示為老年斑，淀粉樣卵白的沉積是老年斑的重要身分，是由正常存在于細胞膜上的,排泄酶作用下水解形成的相對分子質(zhì)量為4000擺布的卵白12。比年來，已經(jīng)證明與AD發(fā)病有關(guān)的基因突變(APP基因，PS-1基因，PS-2基因A)以及載脂卵白E基因等，都可導(dǎo)致A的非常沉積，A對體外造就及在體神

11、經(jīng)細胞有損傷作用，因此越來越多的學(xué)者都以A作為研究AD的關(guān)鍵。P12細胞株是如今研究神經(jīng)細胞的精良模子，與原代造就的細胞比擬，細胞的同源性較好且較易獲齲而淀粉樣卵白在AD患者腦中普及沉積，由其誘導(dǎo)的P12細胞的凋亡模子即為老年性癡呆疾病的一個較貼近的模子。-jun和-fs同屬即早基因(IediateEarlyGene,IEG)。-fs基因作為早期反響基因,在正常環(huán)境下到場細胞的生長、分化、信息通報、學(xué)習(xí)和影象等生理歷程。研究以為3,-fs可作為細胞快樂和細胞損傷希望的標記，-fs與神經(jīng)細胞凋亡在漫衍、時程和數(shù)目上具有必然的相干性,且-fs表達的時間在細胞凋亡產(chǎn)生形態(tài)及生化變革之前4。在正常環(huán)境

12、下,中樞神經(jīng)體系某些部位的神經(jīng)細胞可有-fs，-jun底子程度的表達,但程度較低,不輕易檢測到;然而中樞神經(jīng)構(gòu)造受到撞擊性刺激或缺血、缺氧等多種差異的生理和病理性刺激時，神經(jīng)細胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生-fs，-jun快速、短暫、高程度的表達5，6。研究創(chuàng)造,A誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)氧自由基增長,導(dǎo)致-fs和-jun被誘導(dǎo)過分表達。Andersn等7創(chuàng)造在A處置懲罰神經(jīng)元2h后-fs表達最高，4h后仍出現(xiàn)高表達并連續(xù)較長時間，24h后-jun陽性神經(jīng)元拒染苔酚藍，說明細胞已開始凋亡。本實行證明,A可致P12細胞損傷,誘導(dǎo)-fs，-jun的高表達。地黃飲子可以通過調(diào)治SD，AT和GSH-Px這些抗氧化酶的活性起到間接的

13、抗氧化作用,進步AT和GSH-Px協(xié)同作用以使細胞內(nèi)H22濃度保持在不變程度。因此，地黃飲子腦脊液有用身分可以通過進步抗氧化酶活性消除自由基的產(chǎn)生,制止誘發(fā)-fs和-jun的表達,按捺細胞凋亡。此調(diào)控效應(yīng)與含藥腦脊液的濃度嚴密相干，此中高、中劑量的地黃飲子含藥腦脊液對按捺-fs和-jun的表達可以或許獲得較好的結(jié)果?！緟⒖嘉墨I】1GiltterBD,BggsLN,ayP,etal.Regulatinfytkineseretinandaylidpreursrprteinpr-essingbyprinflaatryaylidbeta(Abeta)J.AnnNYAadSi,2000，91(7):154.2劉春善，黃耀德.阿爾茨海默病中針對淀粉樣卵白治療的希望性研究J.中國臨床病愈，2022，728：3867.3Dragun,RbertsnHA,Braininjuryindues-fsprtein(s)innerveandglial-likeellsinadultaalianbrainJ.BrainRes,1988,455(2):295.4田金州,時晶,高揚,等.大鼠短暫腦缺血后海馬區(qū)-fsRNA和FS卵白表達的時間紀律J.卒中與神經(jīng)疾病,2022,10(3):131.5田偉,李立新,郭實士.湖南漢族群體HLADR2等位基因多態(tài)性與體系性紅斑狼