1、目的要求：1.掌握鏈球菌屬及腸球菌屬的分離培養(yǎng)與鑒定方法。2.掌握鏈球菌及鏈球菌的菌落特點(diǎn)、菌體形態(tài)及染色性。目的要求：步驟與方法1、觀察菌落 將菌株接種于血瓊脂平板上，35孵育18-24h后觀察菌落，記錄菌落大小、形態(tài)、表面、邊緣、透明及顏色、有無(wú)溶血及特點(diǎn)。將肺炎鏈球菌繼續(xù)孵育2-3天看菌落中心有無(wú)凹陷呈“臍狀”。步驟與方法1、觀察菌落鏈球菌的溶血性鏈球菌的溶血性溶血性鏈球菌溶血性鏈球菌2、形態(tài)觀察 涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)、排列及莢膜。 2、形態(tài)觀察肺炎鏈球菌 S. pneumoniae形態(tài)與染色：G+球菌,矛頭狀 ,成雙排列，寬端相對(duì)，尖端向外,有莢膜肺炎鏈

2、球菌 S. pneumoniae形態(tài)與染色：G+球菌肺炎鏈球菌革蘭染色有莢膜肺炎鏈球菌革蘭染色有莢膜（2）膽汁-七葉苷試驗(yàn)：原理：B群溶血性鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，該物質(zhì)可促進(jìn)金黃色葡萄球菌溶血素的活性，故在血瓊脂平板上兩菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明溶血區(qū)。結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)且使得培養(yǎng)基變黃為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)為陰性，腸球菌為陽(yáng)性。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。方法：先將病人血清5630min滅活，然后用生理鹽水做1：15稀釋。原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清

3、晰、均勻的凝集顆粒。原理：B群溶血性鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，該物質(zhì)可促進(jìn)金黃色葡萄球菌溶血素的活性，故在血瓊脂平板上兩菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明溶血區(qū)。原理：腸球菌有很強(qiáng)的耐鹽能力，能在65g/L NaCl血清肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而鏈球菌的耐鹽能力較弱，在此培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。將菌株接種于血瓊脂平板上，35孵育18-24h后觀察菌落，記錄菌落大小、形態(tài)、表面、邊緣、透明及顏色、有無(wú)溶血及特點(diǎn)。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。原理：膽汁或膽鹽能活化肺炎鏈球菌的自溶酶，促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞膜破損或菌體裂解而自溶。營(yíng)養(yǎng)要求高：血平板或含血清培養(yǎng)基；結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。原理：

4、膽汁或膽鹽能活化肺炎鏈球菌的自溶酶，促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞膜破損或菌體裂解而自溶。結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基變黑色或棕褐色為陽(yáng)性，不變色為陰性。結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：平板法若菌落消失為陽(yáng)性，不消失為陰性，試管法若液體由渾濁變透明為陽(yáng)性，不透明為陰性，此試驗(yàn)是鑒別甲型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌的重要試驗(yàn)，后者陽(yáng)性。肺炎鏈球菌莢膜染色特點(diǎn)（2）膽汁-七葉苷試驗(yàn)：肺炎鏈球菌莢膜染色特點(diǎn)肺炎鏈球菌 S. pneumoniae 培養(yǎng)特性：營(yíng)養(yǎng)要求高，兼

5、性厭氧。初次分離需提供5%-10%的CO2。18-24h后血平板上形成灰白色、圓形、針尖樣的菌落。菌落周圍有草綠色溶血環(huán)。肺炎鏈球菌 S. pneumoniae 培養(yǎng)特性：營(yíng)養(yǎng)肺炎鏈球菌 S. pneumoniae培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h后，菌落有自溶現(xiàn)象，菌落的中心會(huì)出現(xiàn)凹陷，像“肚臍”稱臍狀凹陷。肺炎鏈球菌 S. pneumoniae培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h（3）65g/L NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)：原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出

6、-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。方法：取待檢菌純培養(yǎng)物接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基， 35培養(yǎng)48h，3000r/min離心30min,吸取上清液0.將菌株接種于血瓊脂平板上，35孵育18-24h后觀察菌落，腸球菌在血瓊脂平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，菌落周圍可出現(xiàn)溶血環(huán)，也可無(wú)溶血環(huán)。結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)且使得培養(yǎng)基變黃為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)為陰性，腸球菌為陽(yáng)性。腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽(yáng)性球菌。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。（1）觸酶試驗(yàn)：腸球菌屬為陰性反應(yīng)

7、。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。結(jié)果判斷：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，推斷為A群化膿性鏈球菌。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。原理：Lancefield根據(jù)鏈球菌細(xì)胞壁中多糖抗原的不同，將鏈球菌分為20多個(gè)群，對(duì)人類治病的多數(shù)為A群，偶見(jiàn)B、C、D、F、G群。腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽(yáng)性球菌。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變

8、色為陰性。培養(yǎng)特性：營(yíng)養(yǎng)要求高，兼性厭氧。原理：A群化膿性鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎100%敏感，而其他鏈球菌對(duì)桿菌肽通常耐藥。結(jié)果判斷：平板法若菌落消失為陽(yáng)性，不消失為陰性，試管法若液體由渾濁變透明為陽(yáng)性，不透明為陰性，此試驗(yàn)是鑒別甲型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌的重要試驗(yàn)，后者陽(yáng)性。培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h后，菌落有自溶現(xiàn)象，菌落的中心會(huì)出現(xiàn)凹陷，像“肚臍”稱臍狀凹陷。原理：A群化膿性鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎100%敏感，而其他鏈球菌對(duì)桿菌肽通常耐藥。方法：先將病人血清5630min滅活，然后用生理鹽水做1：15稀釋。肺炎鏈球菌 S. pneumoniae主要生化反應(yīng) optochin試驗(yàn): 含5g optoc

9、hin 紙片貼于 涂布有待測(cè)菌的平板上35孵育過(guò)夜，抑菌圈大于14mm即為敏感。甲型溶血鏈球菌(R)肺炎鏈球菌(S)（3）65g/L NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)：肺炎鏈球菌 S. pn膽汁溶菌試驗(yàn) 原理：膽汁或膽鹽能活化肺炎鏈球菌的自溶酶，促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞膜破損或菌體裂解而自溶。 方法：A、平板法：在血瓊脂平板上選擇出待檢的草綠色溶血的菌落，觀察記錄菌落特點(diǎn)，然后于菌落上加一滴去氧膽酸鈉溶液，35孵育15-30min觀察結(jié)果。膽汁溶菌試驗(yàn)B、試管法：將甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1ml分別加入2支試管，再于各管中加入去氧膽酸鈉溶液0.1ml，搖勻后置于37水浴30min后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：平板法

10、若菌落消失為陽(yáng)性，不消失為陰性，試管法若液體由渾濁變透明為陽(yáng)性，不透明為陰性，此試驗(yàn)是鑒別甲型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌的重要試驗(yàn)，后者陽(yáng)性。B、試管法：將甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1ml分別痰標(biāo)本肺炎鏈球菌革蘭染色痰標(biāo)本肺炎鏈球菌革蘭染色A群(化膿性)鏈球菌 生物學(xué)性狀 球形或橢圓形，鏈狀排列，革蘭染色陽(yáng)性(G)， 無(wú)芽胞，無(wú)鞭毛，透明質(zhì)酸的莢膜。1. 形態(tài)與染色A群(化膿性)鏈球菌 生物學(xué)性狀 球形或橢圓形，鏈狀化膿性鏈球菌化膿性鏈球菌A群(化膿性)鏈球菌 生物學(xué)性狀 營(yíng)養(yǎng)要求高：血平板或含血清培養(yǎng)基； 液體培養(yǎng)為沉淀生長(zhǎng)； 血平板呈灰白色表面光滑小菌落，不同 菌株溶血不一， 多數(shù)

11、有透明溶血環(huán)(b溶血現(xiàn)象)。2. 培養(yǎng)特性A群(化膿性)鏈球菌 生物學(xué)性狀 營(yíng)養(yǎng)要求高：血平板或含血清桿菌肽敏感試驗(yàn) 原理：A群化膿性鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎100%敏感，而其他鏈球菌對(duì)桿菌肽通常耐藥。 方法：挑取被檢菌落，密涂于血瓊脂平板上，將桿菌肽紙片（0.04U/片）貼于平板上，35孵育18-24h觀察。 結(jié)果判斷：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，推斷為A群化膿性鏈球菌。桿菌肽敏感試驗(yàn)B化膿性鏈球菌桿菌肽陽(yáng)性B化膿性鏈球菌桿菌肽陽(yáng)性B群無(wú)乳鏈球菌B群無(wú)乳鏈球菌CAMP試驗(yàn) 原理：B群溶血性鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，該物質(zhì)可促進(jìn)金黃色葡萄球菌溶血素的活性，故在血瓊脂平板上兩菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明

12、溶血區(qū)。 方法：在羊血瓊脂平板上，用金黃色葡萄球菌劃種一條橫線，在將被檢菌距金葡菌接種線3mm處直角接種一短線，35培養(yǎng)18-24h觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。CAMP試驗(yàn)涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)及排列。培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h后，菌落有自溶現(xiàn)象，菌落的中心會(huì)出現(xiàn)凹陷，像“肚臍”稱臍狀凹陷。原理：A群化膿性鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎100%敏感，而其他鏈球菌對(duì)桿菌肽通常耐藥。腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽(yáng)性球菌。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。無(wú)乳鏈球菌CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性B、試管法：將甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1

13、ml分別加入2支試管，再于各管中加入去氧膽酸鈉溶液0.在兩種細(xì)菌劃線的交接處出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)為陽(yáng)性，否則為陰性，此試驗(yàn)為B群鏈球菌與其他鏈球菌鑒別的重要試驗(yàn)，無(wú)乳鏈球菌為陽(yáng)性，其他為陰性。結(jié)果判斷：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，推斷為A群化膿性鏈球菌。腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽(yáng)性球菌。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。（3）65g/L NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)：原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與A

14、SO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。結(jié)果判斷：出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性、不凝集為陰性。原理：B群溶血性鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，該物質(zhì)可促進(jìn)金黃色葡萄球菌溶血素的活性，故在血瓊脂平板上兩菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明溶血區(qū)。方法：將待檢菌接種65g/L NaCl血清肉湯中，35孵育18-24h。掌握鏈球菌屬及腸球菌屬的分離培養(yǎng)與鑒定方法。原理：Lancefield根據(jù)鏈球菌細(xì)胞壁中多糖抗原的不同，將鏈球菌分為20多個(gè)群，對(duì)人類治病的多數(shù)為A群，偶見(jiàn)B、C、D、F、G群。涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)及排列。腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽(yáng)

15、性球菌。（1）觸酶試驗(yàn)：腸球菌屬為陰性反應(yīng)。原理：B群溶血性鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，該物質(zhì)可促進(jìn)金黃色葡萄球菌溶血素的活性，故在血瓊脂平板上兩菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明溶血區(qū)。 結(jié)果報(bào)告： 在兩種細(xì)菌劃線的交接處出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)為陽(yáng)性，否則為陰性，此試驗(yàn)為B群鏈球菌與其他鏈球菌鑒別的重要試驗(yàn)，無(wú)乳鏈球菌為陽(yáng)性，其他為陰性。涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)及排列。無(wú)乳鏈球菌CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性無(wú)乳鏈球菌CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性CAMP陽(yáng)性CAMP陽(yáng)性馬尿酸水解試驗(yàn) 原理：B群鏈球菌有馬尿酸水解酶，可水解馬尿酸為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸可與FeCl3，結(jié)合形成苯甲酸鐵沉淀。

16、方法：取待檢菌純培養(yǎng)物接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基， 35培養(yǎng)48h，3000r/min離心30min,吸取上清液0.8ml于另一試管，加入FeCl30.2ml，立即混勻，10-15min觀察結(jié)果。 結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。馬尿酸水解試驗(yàn)3、生化反應(yīng) 1）觸酶試驗(yàn)： 鏈球菌屬為陰性。3、生化反應(yīng)（6）血清學(xué)試驗(yàn)（鏈球菌快速分群乳膠凝集試驗(yàn)） 原理：Lancefield根據(jù)鏈球菌細(xì)胞壁中多糖抗原的不同，將鏈球菌分為20多個(gè)群，對(duì)人類治病的多數(shù)為A群，偶見(jiàn)B、C、D、F、G群。用這6群抗原的兔免疫血清分別致敏的乳膠顆粒，與具有相應(yīng)群特異性抗原的鏈球菌發(fā)生間接乳膠凝集反應(yīng)，可在10min內(nèi)對(duì)鏈球菌作出主

17、要的分群鑒定。（6）血清學(xué)試驗(yàn)（鏈球菌快速分群乳膠凝集試驗(yàn)） 方法：挑取菌落2-3個(gè)轉(zhuǎn)種于含有提取酶的試管中，使其成為乳化均勻的菌懸液，置37水浴15min。在卡片的相應(yīng)區(qū)域滴加一滴A、B、C、D、F、G致敏膠乳，再加入處理后的菌懸液一滴分別與膠乳混勻，同時(shí)在卡片相應(yīng)區(qū)域加一滴控制液與任意一滴致敏乳膠混勻，作為陽(yáng)性對(duì)照，輕搖卡片，觀察結(jié)果。 方法：挑取菌落2-3個(gè)轉(zhuǎn)種于含有提取酶的試管中，使其成為結(jié)果判斷：在2-10min內(nèi)發(fā)生膠乳凝集，為陽(yáng)性。待檢菌與哪群致敏膠乳凝集就表明該菌為相應(yīng)血清群的鏈球菌。結(jié)果判斷：在2-10min內(nèi)發(fā)生膠乳凝集，為陽(yáng)性。待檢菌與哪Lancefield血清凝集分型L

18、ancefield血清凝集分型鏈球菌腸球菌課件（7）膠乳凝集試驗(yàn)： 原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。（7）膠乳凝集試驗(yàn)： 方法：先將病人血清5630min滅活，然后用生理鹽水做1：15稀釋。在反應(yīng)板個(gè)空內(nèi)分別滴加稀釋血清、陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清1滴（50ul），再于各孔內(nèi)滴加1滴溶血素“O”溶液，輕搖1min混勻，最后在各孔內(nèi)分別滴加1滴ASO膠乳試劑，輕搖3min后觀察結(jié)果。 方法：先將病人血清5630min滅活，腸球菌能在膽汁中生長(zhǎng)，并水解七葉苷，使培養(yǎng)基變黑

19、。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽(yáng)性球菌。結(jié)果判斷：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，推斷為A群化膿性鏈球菌。18-24h后血平板上形成灰白色、圓形、針尖樣的菌落。原理：Lancefield根據(jù)鏈球菌細(xì)胞壁中多糖抗原的不同，將鏈球菌分為20多個(gè)群，對(duì)人類治病的多數(shù)為A群，偶見(jiàn)B、C、D、F、G群。pneumoniae結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)且使得培養(yǎng)基變黃為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)為陰性，腸球菌為陽(yáng)性。腸球菌、A群鏈球菌和某些凝固酶陰性的葡萄球菌為陽(yáng)

20、性。2ml，立即混勻，10-15min觀察結(jié)果。（2）膽汁-七葉苷試驗(yàn)：原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。結(jié)果判斷：平板法若菌落消失為陽(yáng)性，不消失為陰性，試管法若液體由渾濁變透明為陽(yáng)性，不透明為陰性，此試驗(yàn)是鑒別甲型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌的重要試驗(yàn)，后者陽(yáng)性。結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。方法：取待檢菌純培養(yǎng)物接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基， 35培養(yǎng)48h，3000r/min離心30min,吸取上清液0.原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余

21、抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。形態(tài)與染色：G+球菌,矛頭狀 ,成雙排列，寬端相對(duì)將菌株接種于血瓊脂平板上，35孵育18-24h后觀察菌落，腸球菌在血瓊脂平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，菌落周圍可出現(xiàn)溶血環(huán)，也可無(wú)溶血環(huán)。肺炎鏈球菌莢膜染色特點(diǎn)菌落周圍有草綠色溶血環(huán)。涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)及排列。 結(jié)果判斷：出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性、不凝集為陰性。ASO陽(yáng)性可認(rèn)為患者近期受溶血性鏈球菌感染過(guò)，可輔助診斷風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等疾病。腸球菌能在膽汁中生長(zhǎng)，并水解七葉苷，使培養(yǎng)基變黑。 鏈球菌腸球菌課件腸球菌屬步驟和方法1、菌落觀察: 將菌株接

22、種于血瓊脂平板上，35孵育18-24h后觀察菌落，腸球菌在血瓊脂平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，菌落周圍可出現(xiàn)溶血環(huán)，也可無(wú)溶血環(huán)。 腸球菌屬步驟和方法2、形態(tài)觀察 涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)及排列。 腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽(yáng)性球菌。2、形態(tài)觀察3、生化反應(yīng)： （1）觸酶試驗(yàn)：腸球菌屬為陰性反應(yīng)。 （2）膽汁-七葉苷試驗(yàn)： 原理：培養(yǎng)基的膽汁對(duì)某些細(xì)菌有抑制作用，只有既能在膽汁中生長(zhǎng)，又能水解七葉苷的細(xì)菌才能表現(xiàn)出對(duì)七葉苷的水解活性。腸球菌能在膽汁中生長(zhǎng)，并水解七葉苷，使培養(yǎng)基變黑。3、生化反應(yīng)： 方法：將被檢菌13個(gè)菌

23、落接種于膽汁-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基，35孵育1824h。 結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基變黑色或棕褐色為陽(yáng)性，不變色為陰性。腸球菌為陽(yáng)性。 方法：將被檢菌13個(gè)菌落接種于膽汁-（3）65g/L NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)： 原理：腸球菌有很強(qiáng)的耐鹽能力，能在65g/L NaCl血清肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而鏈球菌的耐鹽能力較弱，在此培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。 方法：將待檢菌接種65g/L NaCl血清肉湯中，35孵育18-24h。 結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)且使得培養(yǎng)基變黃為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)為陰性，腸球菌為陽(yáng)性。（3）65g/L NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)：方法：挑取被檢菌落，密涂于血瓊脂平板上，將桿菌肽紙片（0.結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不

24、變色為陰性。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。營(yíng)養(yǎng)要求高：血平板或含血清培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)要求高：血平板或含血清培養(yǎng)基；原理：B群鏈球菌有馬尿酸水解酶，可水解馬尿酸為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸可與FeCl3，結(jié)合形成苯甲酸鐵沉淀。結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基變黑色或棕褐色為陽(yáng)性，不變色為陰性。多數(shù)有透明溶血環(huán)(b溶血現(xiàn)象)。結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。腸球菌、A群鏈球菌和某些凝固酶陰性的葡萄球菌為陽(yáng)性。結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。方法：取待檢菌純培養(yǎng)物接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基， 35培養(yǎng)48h，3000r/min離心30min,吸取上清液0.04U/片）貼于平板上，35孵育18-24h觀察。原理

25、：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。多數(shù)有透明溶血環(huán)(b溶血現(xiàn)象)。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。Lancefield血清凝集分型方法：取待檢菌純培養(yǎng)物接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基， 35培養(yǎng)48h，3000r/min離心30min,吸取上清液0.結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。營(yíng)養(yǎng)要求高：血平板或含血清培養(yǎng)基；原理：腸球菌有很強(qiáng)的耐鹽能力，能在65g/L NaCl血清肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而鏈球菌的耐鹽能力較弱，在此培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。將菌株接種于血瓊脂平板上，35孵育18-24h后觀察菌落，腸球菌在血瓊

26、脂平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，菌落周圍可出現(xiàn)溶血環(huán)，也可無(wú)溶血環(huán)。（3）PYR試驗(yàn)： 原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。 方法：挑取被檢菌落在含有PYR的紙片上涂擦， 35孵育5min，再于紙片上滴加PYR試劑，觀察紙片顏色。 結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。腸球菌、A群鏈球菌和某些凝固酶陰性的葡萄球菌為陽(yáng)性。方法：挑取被檢菌落，密涂于血瓊脂平板上，將桿菌肽紙片（0.（鏈球菌腸球菌課件肺炎鏈球菌 S. pneumoniae主要生化反應(yīng) optochin試驗(yàn): 含5g op

27、tochin 紙片貼于 涂布有待測(cè)菌的平板上35孵育過(guò)夜，抑菌圈大于14mm即為敏感。甲型溶血鏈球菌(R)肺炎鏈球菌(S)肺炎鏈球菌 S. pneumoniae主要生化反應(yīng)甲型溶化膿性鏈球菌化膿性鏈球菌桿菌肽敏感試驗(yàn) 原理：A群化膿性鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎100%敏感，而其他鏈球菌對(duì)桿菌肽通常耐藥。 方法：挑取被檢菌落，密涂于血瓊脂平板上，將桿菌肽紙片（0.04U/片）貼于平板上，35孵育18-24h觀察。 結(jié)果判斷：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，推斷為A群化膿性鏈球菌。桿菌肽敏感試驗(yàn) 結(jié)果報(bào)告： 在兩種細(xì)菌劃線的交接處出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)為陽(yáng)性，否則為陰性，此試驗(yàn)為B群鏈球菌與其他鏈球菌鑒別的重要試驗(yàn)，無(wú)乳

28、鏈球菌為陽(yáng)性，其他為陰性。 結(jié)果報(bào)告：馬尿酸水解試驗(yàn) 原理：B群鏈球菌有馬尿酸水解酶，可水解馬尿酸為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸可與FeCl3，結(jié)合形成苯甲酸鐵沉淀。 方法：取待檢菌純培養(yǎng)物接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基， 35培養(yǎng)48h，3000r/min離心30min,吸取上清液0.8ml于另一試管，加入FeCl30.2ml，立即混勻，10-15min觀察結(jié)果。 結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。馬尿酸水解試驗(yàn)（7）膠乳凝集試驗(yàn)： 原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。（7）膠乳凝集

29、試驗(yàn)：（3）65g/L NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)： 原理：腸球菌有很強(qiáng)的耐鹽能力，能在65g/L NaCl血清肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而鏈球菌的耐鹽能力較弱，在此培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。 方法：將待檢菌接種65g/L NaCl血清肉湯中，35孵育18-24h。 結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)且使得培養(yǎng)基變黃為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)為陰性，腸球菌為陽(yáng)性。（3）65g/L NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)：原理：培養(yǎng)基的膽汁對(duì)某些細(xì)菌有抑制作用，只有既能在膽汁中生長(zhǎng)，又能水解七葉苷的細(xì)菌才能表現(xiàn)出對(duì)七葉苷的水解活性。無(wú)芽胞，無(wú)鞭毛，透明質(zhì)酸的莢膜。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形

30、成紅色復(fù)合物。將肺炎鏈球菌繼續(xù)孵育2-3天看菌落中心有無(wú)凹陷呈“臍狀”。B、試管法：將甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1ml分別加入2支試管，再于各管中加入去氧膽酸鈉溶液0.結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基變黑色或棕褐色為陽(yáng)性，不變色為陰性。原理：B群溶血性鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，該物質(zhì)可促進(jìn)金黃色葡萄球菌溶血素的活性，故在血瓊脂平板上兩菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明溶血區(qū)。8ml于另一試管，加入FeCl30.B、試管法：將甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1ml分別加入2支試管，再于各管中加入去氧膽酸鈉溶液0.結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基變

31、黑色或棕褐色為陽(yáng)性，不變色為陰性。方法：挑取被檢菌落，密涂于血瓊脂平板上，將桿菌肽紙片（0.結(jié)果判斷：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，推斷為A群化膿性鏈球菌。B、試管法：將甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1ml分別加入2支試管，再于各管中加入去氧膽酸鈉溶液0.結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。pneumoniae結(jié)果判斷：平板法若菌落消失為陽(yáng)性，不消失為陰性，試管法若液體由渾濁變透明為陽(yáng)性，不透明為陰性，此試驗(yàn)是鑒別甲型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌

32、的重要試驗(yàn)，后者陽(yáng)性。培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h后，菌落有自溶現(xiàn)象，菌落的中心會(huì)出現(xiàn)凹陷，像“肚臍”稱臍狀凹陷。多數(shù)有透明溶血環(huán)(b溶血現(xiàn)象)。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h后，菌落有自溶現(xiàn)象，菌落的中心會(huì)出現(xiàn)凹陷，像“肚臍”稱臍狀凹陷。結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)且使得培養(yǎng)基變黃為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)為陰性，腸球菌為陽(yáng)性。營(yíng)養(yǎng)要求高：血平板或含血清培養(yǎng)基；原理：腸球菌有很強(qiáng)的耐鹽能力，能在65g/L NaCl血清肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而鏈球菌的耐鹽能力較弱，在此培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。結(jié)果判斷：在2-10min內(nèi)發(fā)生膠乳凝集，為陽(yáng)性。球形或橢圓形，鏈狀排列，革蘭染色陽(yáng)性(G)，原理：Lan

33、cefield根據(jù)鏈球菌細(xì)胞壁中多糖抗原的不同，將鏈球菌分為20多個(gè)群，對(duì)人類治病的多數(shù)為A群，偶見(jiàn)B、C、D、F、G群。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽(yáng)性球菌。2ml，立即混勻，10-15min觀察結(jié)果。結(jié)果：約1min后紙片呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)及排列。肺炎鏈球菌莢膜染色特點(diǎn)結(jié)果：細(xì)菌生長(zhǎng)且使得培養(yǎng)基變黃為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)為陰性，腸球菌為陽(yáng)性。培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h后，菌落有自溶現(xiàn)象，菌落的中心會(huì)出現(xiàn)凹陷，像“肚臍”稱臍狀凹陷。涂片

34、、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)及排列。（3）65g/L NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)：原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。結(jié)果判斷：平板法若菌落消失為陽(yáng)性，不消失為陰性，試管法若液體由渾濁變透明為陽(yáng)性，不透明為陰性，此試驗(yàn)是鑒別甲型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌的重要試驗(yàn)，后者陽(yáng)性。結(jié)果判斷：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，推斷為A群化膿性鏈球菌。原理：培養(yǎng)基的膽汁對(duì)某些細(xì)菌有抑制作用，只有既能在膽汁中生長(zhǎng)，又能水解七葉苷的細(xì)菌才能表現(xiàn)出對(duì)七葉苷的水解活性。結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物

35、為陽(yáng)性。原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。原理：B群溶血性鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，該物質(zhì)可促進(jìn)金黃色葡萄球菌溶血素的活性，故在血瓊脂平板上兩菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明溶血區(qū)。04U/片）貼于平板上，35孵育18-24h觀察。原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），釋放出-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。營(yíng)養(yǎng)要求高：血平板或含血清培養(yǎng)基；培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h后，菌落有自溶現(xiàn)象，菌落的中心會(huì)出現(xiàn)凹陷，像“肚臍”稱臍狀凹陷。在反應(yīng)板個(gè)空內(nèi)分別滴加稀釋血清、陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清1滴（50ul），再于各孔內(nèi)滴加1滴溶血素“O”溶