生化實驗技術專題主要內容：介紹生物大分子分離純化的一般步驟和原則；介紹層析技術、電泳技術、離心技術、超過濾技術的原理及其應用；總結蛋白質、核酸、酶、氨基酸測定的主要方法。生化實驗技術專題主要內容：介紹生物大分子分離純化的1目錄第一節(jié)生物大分子物質的制備第二節(jié)幾類主要的生化實驗技術第三節(jié)

蛋白質、核酸的檢測目錄第一節(jié)生物大分子物質的制備2第一節(jié)生物大分子物質的制備

一．一般過程和原則二．注意事項三．純化方案的設計和評價例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化確立有效成分的測定方法材料的選擇和預處理細胞的破碎和細胞組分分離有效成分的抽提有效成分的純化和濃縮第一節(jié)生物大分子物質的制備

一．一般過程和原則二．注意3生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點電沉淀有機溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級→│←細分級→│材料選擇與處理細胞破碎（機械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學處理）生物組織→→提取液→

→粗產品→→結晶分子大小溶解度電荷性質吸附性質生物親和力依據原理生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法鹽析（硫酸銨4調整硫酸銨溶液飽和度計算表調整硫酸銨溶液飽和度計算表5注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解1．控制適當?shù)膒H2．控制低溫3．注意提取過程中的溶液環(huán)境4．防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解6宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化

純化步驟總蛋白總活力比活力純化倍數(shù)回收率

（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液8043205411002、乙醇沉淀2935851232.27833、醋酸鈣沉淀2129801412.64694、鹽析417714648.52415、丙酮沉淀11166110420.29276、結晶0.12130107219.703宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化純化步驟7第二節(jié)幾類重要的生化實驗技術一、層析技術二、電泳技術三、離心技術四、透析和超過濾第二節(jié)幾類重要的生化實驗技術一、層析技術8一．層析技術（chromatography）1．層析技術一般原理2．層析技術分類3．常用層析技術及應用一．層析技術（chromatography）1．層析技術一般9層析技術原理

層析技術是一種物理的分離方法。無論何種層析,都是由互不相溶的兩個相組成:一是固定相(固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。

混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)(distributioncoefficient,Kd）來描述。混合物各組分的分配系數(shù)差異越大，越容易分離開。

物質在層析系統(tǒng)中的行為并不直接決定于其Kd，而取決于它的有效分配系數(shù)Keff:

Keff=

某一物質在A相中的總量

某一物質在B相中的總量層析技術原理層析技術是一種物理的分離方法。無論何種層析10層析法分類（按裝置分類）

紙層析薄膜層析

柱層析洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱層析法分類（按裝置分類）

紙層析洗脫液樣11氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光吸收流出液(mL)150cm柱，pH3.25，0.067mol/L檸檬酸鈉150cm柱，pH4.25，0.067mol/L檸檬酸鈉15cm柱，pH5.25，0.12mol/L檸檬酸鈉緩沖液泵顯色反應管茚三酮泵已分開的氨基酸離子交換柱樣品注入口記錄儀光電倍增管光源氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerP12氣液色譜圖解

（gas-liquidchromatigraphy）層析柱恒溫裝置載氣（流動相）樣品）進樣室檢測器記錄儀出口氣液色譜圖解

（gas-liquidchromatigra13高效液相層析（HPLC）圖解

（highperformanceliquidchromatigraphy）層析柱恒溫裝置溶劑儲瓶溶劑過濾器進樣室檢測器記錄儀高效液相層析（HPLC）圖解

（highperforma14各類層析的原理和載體類別分離原理基質或載體吸附層析化學、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析

分子篩效應的排阻效應sepharose、sephadex離子交換層析離子基團的交換反應離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析

分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）各類層析的原理和載體類別分離15幾種主要沉淀方法比較幾種主要沉淀方法比較16常用層析技術及應用吸附層析分配層析凝膠過濾（分子篩層析）離子交換層析親和層析

聚焦層析常用層析技術及應用吸附層析17吸附層析

（absorptionchromatography）

原理：載體：硅膠氧化鋁羥基磷石灰應用：分離純化蛋白質、酶、氨基酸、核苷酸等生化物質以吸附劑作為固定相，選擇適當?shù)娜軇┳髁鲃酉?。由于各種物質的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時，當流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。吸附18分配層析

（distribuptionchromatography）

原理：載體：纖維素硅藻土硅膠應用：各種生化物質的分離鑒定

分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結合水為固定相，以水飽和的有機溶劑為流動相（展開劑）。當流動相沿濾紙經過樣品點時，樣品點中的溶質在水和有機相中溶解度不同而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自的分配系數(shù)進行不斷分配，從而使物質得到分離和純化。分配層析

（distribupt19逆流分溶原理示意圖物質Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質Z(Kd=3)的分配情況溶劑B總量總量總量總量總量總量平衡后轉移1轉移2轉移3分溶管號轉移4上相轉移下相轉移上相轉移管中蛋白質總量物質Y物質Z分溶曲線管號有效分配系數(shù)（Keff）

某一物質在A相中的總量某一物質在B相中的總量逆流分溶原理示意圖物質Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質20分子篩層析（gel-filtrationchromatography）

基質葡聚糖凝膠（sephadex）瓊脂糖凝膠（sepharose）應用測定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質

原理：凝膠層析也稱為排阻凝膠層析、凝膠過濾和分子篩層析。它是60年代發(fā)展起來的，利用凝膠把物質按分子大小不同進行分離的一種方法。由于被分離物質的分子大小（直徑）和形狀不同，洗脫時，大分子物質由于直徑大于凝膠網孔不能進入凝膠內部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質，由于直徑小于凝膠網孔，能自由進出膠粒網孔，使之洗脫時流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。分子篩層析（gel-filtrationchromatog21分子篩層析原理示意圖

分子篩層析原理示意圖

22分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質管蛋白質混合物大分子從柱上面加緩沖溶液小分子洗脫體積（Ve）凝膠柱大分子小分子Ve1Ve2V0分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質管蛋白質混合物大分子23蛋白質Mr=49,000洗出液中的蛋白質濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對分子質量的關系

Andrews的經驗公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“選擇性曲線”G-200G-100logMrKav蛋白質Mr=49,000洗出液中的蛋白質濃度洗脫體積（mL）24離子交換層析

（ion-changechromatography）

原理基質疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應用制備純化生物物質定量、定性測定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質，后洗下強吸附物質5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度離子交換層25離子交換層析原理示意圖

蛋白質濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質收集樣品的管收集樣品的管帶負電荷的蛋白質蛋白質混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質收集樣品的管NaClNaCl梯度離子交換層析原理示意圖

蛋白質濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質帶26梯度混合器凝膠顆粒蛋白質混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡單型梯度混合器梯度洗脫曲線洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲液瓶混合瓶復合型梯度混合器梯度洗脫曲線凸形線形凹形梯度混合器凝膠顆粒蛋白質混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱27常用的陽離子交換劑

離子交換劑可電離基團可電離基團結構CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強弱酸型）磺丙基常用的陽離子交換劑

離子交換劑28常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）氨基乙基離子交換劑可電離基團可電離基團結構PAB-纖維素（弱減型）對氨基苯甲酸DEAE-纖維素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纖維素（強減型）二乙基氨基乙基QAE-纖維素（強減型）二乙基（2-羥丙基）-氨基乙基（中弱減型）（中弱減型）常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）29親和層析（affiuitychromatography）

應用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結構與功能+待純化分子配體a.理論依據：待純化分子和配體間具有親和性+基質b.活性基質與配體結合產生親和吸附劑++雜質c.待純化分子與親和吸附劑結合，與雜質分離+d.偶聯(lián)復合物經解離后，得到純的待純化分子原理：基質纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex親和層析（affiuitychromatography）

30親和層析原理示意圖

蛋白質混合物配體與配體結合的蛋白質加入的可溶性配基專一性結合蛋白質沒有結合的蛋白質非專一性結合蛋白質蛋白質濃度洗脫體積與配體專一性結合蛋白質加入配基基質親和層析原理示意圖

蛋白質混合物配體與配體結合的蛋白質加入的31聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點聚焦方法基礎上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質的依據是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應的先決條件，如果一種蛋白質加到已形成pH梯度的層析柱上時,由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時間進行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質1（pI=7）蛋白質2（pI=8）流速移動速率層析時的聚焦效應示意圖聚焦層析（Chromatofocusing）32幾種主要層析方法比較幾種主要層析方法比較33二、電泳技術

1．電泳的一般原理2.電泳技術的類別3、常用電泳技術4、電泳技術的拓展二、電泳技術

1．電泳的一般原理34電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質及其所在介質的pH。如果混合物中各組分的結構組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達到分離鑒定各組分的目的。電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其35電泳技術分類垂直板電泳毛細管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳電泳技術分類垂直板電泳毛細管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠36常用電泳技術1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳3、瓊脂糖電泳4、毛細管電泳常用電泳技術1、醋酸纖維薄膜電泳37聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）

1、一般PAGE2、SDS3、PAGE等電點聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryla38聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

PAGE是在區(qū)帶電泳原理的基礎上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠(PAG)作為支持物，采用電泳基質的不連續(xù)體系(即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性)或連續(xù)體系（一層凝膠、一種pH和一種緩沖溶液），進行電泳分離一種方法。

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應的催化系統(tǒng)有兩種?；瘜W聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED不連續(xù)PAGE三種效應：電荷效應、分子篩效應和濃縮效應聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegele39不連續(xù)PAGE的濃縮效應

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質ABC++--樣品濃縮膠分離膠電極緩沖液低電位梯度E11高電位梯度E21+-不連續(xù)PAGE的濃縮效應

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質40SDS

原理：

當SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質結合后，蛋白質分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質在SDS的作用下結構變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質復合物在電泳時產生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關系?？捎孟率奖硎荆?/p>

LogMr=a–bmr應用:測定蛋白質分子量測定蛋白質亞基數(shù)Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）LogMrSDS

原理：Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）41等電點聚焦（isoelectricfocusing）

原理:

在一定抗對流介質（如凝膠）中加入兩性電解質載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應用：

高效率分離純化蛋白質測定蛋白質分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度等電點聚焦（isoelectricfocusing）

42瓊脂糖電泳

瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構成的多糖鏈，這種多糖鏈在1000C左右時呈液態(tài)，當溫度下降到450C以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖凝膠用作電泳的固相支持物具有分子篩效應，其對生物分子的分離作用不僅與其分子的構象及其相對分子質量大小有關，而且與凝膠的濃度也有密切關系，故可根據分離對象分子量大小選擇適當濃度的凝膠。

瓊脂糖電泳常用于核酸分離，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為2OObP至5Okb的DNA，

瓊脂糖凝膠還常用作免疫電泳的固相支持物。瓊脂糖電泳瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖43不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)可分辨的線性DNA大小范圍／(kb)

0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1DNA相對分子質量標準物水平型平板電泳槽

不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)44毛細管電泳

(CapillaryElectrophoresis，CE)

毛細管電泳又稱毛細管區(qū)帶電泳，它是在毛細管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。

毛細管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術，被認為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產物的分析鑒定等。毛細管電泳原理示意圖毛細管電泳檢測技術的發(fā)展毛細管電泳分離模式的發(fā)展毛細管電泳

(CapillaryElectrophores45毛細管電泳裝置示意圖30KV高壓電源光源光電倍增管數(shù)據采集石英玻璃毛細管緩沖液-樣品緩沖液正極負極毛細管電泳裝置示意圖30KV光源光電倍增管數(shù)據采集石英玻璃毛46毛細管電泳檢測技術的發(fā)展

（一）紫外可見光吸收石英毛細管因可透過20nm波長以下的紫外光，因此不僅允許從紫外到可見光這一波長范圍內對樣品組分進行檢測。而且可將透光窗口直接開在毛細管上，進行“在柱”檢測。（二）熒光檢測法是毛細管電泳中一種常見的“在柱”檢測法，尤其是激光誘導熒光檢測法(LIF)，其靈敏度可高達10-12～10-16mol/L-1，是目前毛細管電泳中最靈敏的一種檢測方法。（三）電化學檢測方法電導檢測、電位檢測、安培檢測是電化學檢測常用的三種方法，對電活性組分的檢測具有靈敏度高、線性范圍寬、選擇性好以及價格低廉等特點。（四）集成毛細管電泳芯片該項技術以晶體硅、玻璃、塑料(指有機玻璃)、陶瓷和硅橡膠為基本材料，借助毛細管電泳技術，將樣品進樣、反應、分離、檢測等過程集成到一起的多功能化的技術，該項工作與分析儀器的微型化、小型化和集成化緊密相連,使得其能符合現(xiàn)代生物化學、制藥工業(yè)的低成本和高產出的需求。毛細管電泳檢測技術的發(fā)展（一）紫外可見光吸收47毛細管電泳分離模式的發(fā)展

（一）毛細管區(qū)帶電泳又稱毛細管自由電泳，毛細管內只充入緩沖溶液，在直流高壓驅動下，溶質以不同的速率在分立的區(qū)帶內進行遷移而被分離?？捎糜诎被帷⒍嚯?、離子、對映體等物質的分析。（二）毛細管凝膠電泳將板上的凝膠移到毛細管中作支持物而進行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用，溶質按分子大小進行分離。常用聚丙烯酸胺在毛細管內交聯(lián)制成凝膠柱，可用于分離測定蛋白質和DNA等，但制備繁瑣，使用壽命短。（三）毛細管等電聚焦(CIEF)將普通等電聚焦電泳轉移到毛細管中進行，在高壓作用下，毛細管內部建立pH梯度，蛋白質在毛細管中向各自的等電點聚焦，形成明顯的區(qū)帶，再通過檢測器分別加以確認，常用于分離離子型物質。（四）親和毛細管電泳(ACE)建立在生物分子之間的親和作用基礎上，利用親和分子（如抗原與抗體、酶與底物、配體與受體等）相互選擇性，通過毛細管電泳來測定這些分子，從而具有高選擇性和靈敏性。傳統(tǒng)的親和分析有很多優(yōu)點，但在技術上操作繁瑣，自動化程度低，測定周期長，因而親和分析與毛細管電泳的聯(lián)用正可彌補其局限性和缺點。毛細管電泳分離模式的發(fā)展（一）毛細管區(qū)帶電泳48電泳技術的拓展1、免疫電泳(immunoelectrophoresis)2、單細胞凝膠電泳技術(singlecellgelelectrophoresisassay，SCGE)，又稱彗星試驗(Cometassay)3、雙向電泳(twodimensionalelectrophoresis，2DE)4、脈沖凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)5、連續(xù)型逆向色譜電泳(continuouscounteractionchromatographicelectrophoresis，CACE)6、介體電泳(preparativeelectrophoresis)7、溫度梯度凝膠電泳（temperaturegradientgelelectrophoresis）電泳技術的拓展1、免疫電泳(immunoelectroph49雙向電泳圖譜正常小鼠結腸組織蛋白質組的雙向電泳人胃癌SGC7901細胞蛋白質組的雙向電泳第一向：PAGE等電點聚焦（IEF），第二向：SDSPAGE雙向電泳圖譜正常小鼠結腸組織蛋白質組的雙向電泳人胃癌SGC750連續(xù)型逆向色譜電泳(CACE)分離原理示意圖

載液色譜陽極陰極目標產品富集區(qū)填料（排阻區(qū)）填料（嵌入區(qū)）凈速度電泳色譜凈速度電泳目標蛋白的遷移情況連續(xù)型逆向色譜電泳(CACE)分離原理示意圖

載液色譜陽51三、離心技術

1．離心機類別普通離心機1000轉/分高速離心機2-3萬轉/分超速離心機3萬轉/分2．沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient,s）3．超離心法類別

密度梯度離心法（densitygradient）

沉降速度法（sedimentationvelocity）

沉降平恒法（sedimentationeguilibrium）三、離心技術

1．離心機類別2．沉降系數(shù)（sedimen52離心機結構示意圖轉頭轉頭腔沉降樣品驅動馬達真空冷凍離心機結構示意圖轉頭轉頭腔沉降樣品驅動馬達真空冷凍53

沉降系數(shù)

（sedimentationcoefficient）

生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從靜止狀態(tài)到達極限速度所需要的時間。數(shù)學定義式為：

沉降系數(shù)單位：由于蛋白質、核酸、病毒等的沉降系數(shù)介于1×10-13介于10-13到200×10-13s的范圍，為方便起見，把1×10-13s作為沉降系數(shù)的一個單位，用Svedberg單位，用即S表示。沉降系數(shù)（s）與相對分子量（Mr）的關系:Mr=RTsD(1-)Svedberg方程:d/dt2

s=沉降系數(shù)

（sedimentation54密度梯度離心法（densitygradient）

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，質量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度密度梯度離心法（densitygradient）551、核酸密度的測定=o+4.2

2(2-02)10-102、測定DNA中G-C之含量

Rolfe-Meselson公式：=0.100xG-C+1.6583、溶液中核酸構象的研究：單鏈DNA雙鏈DNA蛋白質雙鏈DNARNA4、核酸的制備

氯化銫密度梯度超離心經染料-氯化銫密度梯度超離心后，質粒DNA及各種雜質的分布超螺旋DNA閉環(huán)質粒DNA開環(huán)質及線型DNA蛋白質石蠟油密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的應用1、核酸密度的測定經染料-氯化銫密度梯度超離心后，質粒DNA56沉降速率法（sedimentationvelocity）

在離心場的作用下，蛋白質分子將沿旋轉中心向外周方向（徑向）移動，并產生沉降界面，界面的移動速度代表蛋白質的沉降速度。在界面處由于濃度差造成折射率不同，可借助適當?shù)墓鈱W系統(tǒng)，如schlieren光學系統(tǒng)（也稱暗線光學照相系統(tǒng)），觀察到這種界面的移動。在schlieren光學系統(tǒng)中，利用溶液的折射率梯度（d/d）和樣品的濃度梯度（dc/d）成正比這一特點，巧妙地設計光路，使移動的界面以峰形曲線呈現(xiàn)在照相圖片上，峰頂代表移動界面。離心機的裝置允許在離心機轉頭旋轉時，對界面的移動進行觀察和拍照。沉降速率法（sedimentationvelocity57分析型超速離心機光源柔性驅動軸熱敏溫度計樣品池準直透鏡液面沉降界面溶劑配衡池沉降界面聚光透鏡馬達濾光片溶質空氣沉降方向照相機透鏡園柱型透鏡底板Schlieren光閘真空冷凍12cd/d分析型超速離心機光源柔性驅動軸熱敏溫度計樣品池準直透鏡液面沉58沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）

在較低速度（8,000-20,000r/min）的離心場中，離心開始時，分子顆粒發(fā)生沉降，由于沉降的結果造成濃度梯度。因而產生了擴散作用，擴散力的作用方向正與離心力相反，當凈離心力與擴散平衡時，在離心池內從液面到池低形成一個由低到高的恒定濃度梯度。如果測得相關參數(shù)即可算出生物分子的分子量。離心力x1軸心液面離心軸擴散力x2Mr=(1-)2(22-12)2RTdln(c2-c1)計算公式如下：沉降平衡法（sedimentationeguilibr59透析（dialysis）半透膜袋蛋白質溶液透析液磁棒磁力攪拌器

透析是利用蛋白質等大分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其它小分子物質如無機鹽單糖等分開。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料透析（dialysis）半透膜袋蛋白質溶液透60超過濾（ultrafiltration）

利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強行使水和其它小分子溶質通過半透膜，而蛋白質被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對分子量不同的蛋白質。為了避免被膜截留的蛋白質在膜表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過濾的方法，即液體在泵驅動下沿著與膜表面相切方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過表面將被膜截留的蛋白質分子沖走。濾膜抽氣濾膜離心AB超過濾（ultrafiltration）利用壓力61蛋白質、核酸的定性定量檢測1、蛋白質的測定凱氏定氮法（含N量6.

25）雙縮脲法、Folin-酚法紫外光度法（max=280nm）離心法、電泳法、層析法2、酶活力的測定終點法、動力學法3、氨基酸的測定茚三酮法Sangerf法、Edmam法、DNS法4、核酸的測定紫外光度法（max=260nm）分子雜交法離心法、電泳法蛋白質、核酸的定性定量檢測1、蛋白質的測定凱氏定氮62生化實驗技術專題主要內容：介紹生物大分子分離純化的一般步驟和原則；介紹層析技術、電泳技術、離心技術、超過濾技術的原理及其應用；總結蛋白質、核酸、酶、氨基酸測定的主要方法。生化實驗技術專題主要內容：介紹生物大分子分離純化的63目錄第一節(jié)生物大分子物質的制備第二節(jié)幾類主要的生化實驗技術第三節(jié)

蛋白質、核酸的檢測目錄第一節(jié)生物大分子物質的制備64第一節(jié)生物大分子物質的制備

一．一般過程和原則二．注意事項三．純化方案的設計和評價例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化確立有效成分的測定方法材料的選擇和預處理細胞的破碎和細胞組分分離有效成分的抽提有效成分的純化和濃縮第一節(jié)生物大分子物質的制備

一．一般過程和原則二．注意65生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點電沉淀有機溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級→│←細分級→│材料選擇與處理細胞破碎（機械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學處理）生物組織→→提取液→

→粗產品→→結晶分子大小溶解度電荷性質吸附性質生物親和力依據原理生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法鹽析（硫酸銨66調整硫酸銨溶液飽和度計算表調整硫酸銨溶液飽和度計算表67注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解1．控制適當?shù)膒H2．控制低溫3．注意提取過程中的溶液環(huán)境4．防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解68宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化

純化步驟總蛋白總活力比活力純化倍數(shù)回收率

（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液8043205411002、乙醇沉淀2935851232.27833、醋酸鈣沉淀2129801412.64694、鹽析417714648.52415、丙酮沉淀11166110420.29276、結晶0.12130107219.703宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化純化步驟69第二節(jié)幾類重要的生化實驗技術一、層析技術二、電泳技術三、離心技術四、透析和超過濾第二節(jié)幾類重要的生化實驗技術一、層析技術70一．層析技術（chromatography）1．層析技術一般原理2．層析技術分類3．常用層析技術及應用一．層析技術（chromatography）1．層析技術一般71層析技術原理

層析技術是一種物理的分離方法。無論何種層析,都是由互不相溶的兩個相組成:一是固定相(固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。

混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)(distributioncoefficient,Kd）來描述?；旌衔锔鹘M分的分配系數(shù)差異越大，越容易分離開。

物質在層析系統(tǒng)中的行為并不直接決定于其Kd，而取決于它的有效分配系數(shù)Keff:

Keff=

某一物質在A相中的總量

某一物質在B相中的總量層析技術原理層析技術是一種物理的分離方法。無論何種層析72層析法分類（按裝置分類）

紙層析薄膜層析

柱層析洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱層析法分類（按裝置分類）

紙層析洗脫液樣73氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光吸收流出液(mL)150cm柱，pH3.25，0.067mol/L檸檬酸鈉150cm柱，pH4.25，0.067mol/L檸檬酸鈉15cm柱，pH5.25，0.12mol/L檸檬酸鈉緩沖液泵顯色反應管茚三酮泵已分開的氨基酸離子交換柱樣品注入口記錄儀光電倍增管光源氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerP74氣液色譜圖解

（gas-liquidchromatigraphy）層析柱恒溫裝置載氣（流動相）樣品）進樣室檢測器記錄儀出口氣液色譜圖解

（gas-liquidchromatigra75高效液相層析（HPLC）圖解

（highperformanceliquidchromatigraphy）層析柱恒溫裝置溶劑儲瓶溶劑過濾器進樣室檢測器記錄儀高效液相層析（HPLC）圖解

（highperforma76各類層析的原理和載體類別分離原理基質或載體吸附層析化學、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析

分子篩效應的排阻效應sepharose、sephadex離子交換層析離子基團的交換反應離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析

分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）各類層析的原理和載體類別分離77幾種主要沉淀方法比較幾種主要沉淀方法比較78常用層析技術及應用吸附層析分配層析凝膠過濾（分子篩層析）離子交換層析親和層析

聚焦層析常用層析技術及應用吸附層析79吸附層析

（absorptionchromatography）

原理：載體：硅膠氧化鋁羥基磷石灰應用：分離純化蛋白質、酶、氨基酸、核苷酸等生化物質以吸附劑作為固定相，選擇適當?shù)娜軇┳髁鲃酉?。由于各種物質的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時，當流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。吸附80分配層析

（distribuptionchromatography）

原理：載體：纖維素硅藻土硅膠應用：各種生化物質的分離鑒定

分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結合水為固定相，以水飽和的有機溶劑為流動相（展開劑）。當流動相沿濾紙經過樣品點時，樣品點中的溶質在水和有機相中溶解度不同而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自的分配系數(shù)進行不斷分配，從而使物質得到分離和純化。分配層析

（distribupt81逆流分溶原理示意圖物質Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質Z(Kd=3)的分配情況溶劑B總量總量總量總量總量總量平衡后轉移1轉移2轉移3分溶管號轉移4上相轉移下相轉移上相轉移管中蛋白質總量物質Y物質Z分溶曲線管號有效分配系數(shù)（Keff）

某一物質在A相中的總量某一物質在B相中的總量逆流分溶原理示意圖物質Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質82分子篩層析（gel-filtrationchromatography）

基質葡聚糖凝膠（sephadex）瓊脂糖凝膠（sepharose）應用測定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質

原理：凝膠層析也稱為排阻凝膠層析、凝膠過濾和分子篩層析。它是60年代發(fā)展起來的，利用凝膠把物質按分子大小不同進行分離的一種方法。由于被分離物質的分子大?。ㄖ睆剑┖托螤畈煌?，洗脫時，大分子物質由于直徑大于凝膠網孔不能進入凝膠內部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質，由于直徑小于凝膠網孔，能自由進出膠粒網孔，使之洗脫時流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。分子篩層析（gel-filtrationchromatog83分子篩層析原理示意圖

分子篩層析原理示意圖

84分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質管蛋白質混合物大分子從柱上面加緩沖溶液小分子洗脫體積（Ve）凝膠柱大分子小分子Ve1Ve2V0分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質管蛋白質混合物大分子85蛋白質Mr=49,000洗出液中的蛋白質濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對分子質量的關系

Andrews的經驗公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“選擇性曲線”G-200G-100logMrKav蛋白質Mr=49,000洗出液中的蛋白質濃度洗脫體積（mL）86離子交換層析

（ion-changechromatography）

原理基質疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應用制備純化生物物質定量、定性測定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質，后洗下強吸附物質5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度離子交換層87離子交換層析原理示意圖

蛋白質濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質收集樣品的管收集樣品的管帶負電荷的蛋白質蛋白質混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質收集樣品的管NaClNaCl梯度離子交換層析原理示意圖

蛋白質濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質帶88梯度混合器凝膠顆粒蛋白質混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡單型梯度混合器梯度洗脫曲線洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲液瓶混合瓶復合型梯度混合器梯度洗脫曲線凸形線形凹形梯度混合器凝膠顆粒蛋白質混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱89常用的陽離子交換劑

離子交換劑可電離基團可電離基團結構CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強弱酸型）磺丙基常用的陽離子交換劑

離子交換劑90常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）氨基乙基離子交換劑可電離基團可電離基團結構PAB-纖維素（弱減型）對氨基苯甲酸DEAE-纖維素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纖維素（強減型）二乙基氨基乙基QAE-纖維素（強減型）二乙基（2-羥丙基）-氨基乙基（中弱減型）（中弱減型）常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）91親和層析（affiuitychromatography）

應用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結構與功能+待純化分子配體a.理論依據：待純化分子和配體間具有親和性+基質b.活性基質與配體結合產生親和吸附劑++雜質c.待純化分子與親和吸附劑結合，與雜質分離+d.偶聯(lián)復合物經解離后，得到純的待純化分子原理：基質纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex親和層析（affiuitychromatography）

92親和層析原理示意圖

蛋白質混合物配體與配體結合的蛋白質加入的可溶性配基專一性結合蛋白質沒有結合的蛋白質非專一性結合蛋白質蛋白質濃度洗脫體積與配體專一性結合蛋白質加入配基基質親和層析原理示意圖

蛋白質混合物配體與配體結合的蛋白質加入的93聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點聚焦方法基礎上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質的依據是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應的先決條件，如果一種蛋白質加到已形成pH梯度的層析柱上時,由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時間進行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質1（pI=7）蛋白質2（pI=8）流速移動速率層析時的聚焦效應示意圖聚焦層析（Chromatofocusing）94幾種主要層析方法比較幾種主要層析方法比較95二、電泳技術

1．電泳的一般原理2.電泳技術的類別3、常用電泳技術4、電泳技術的拓展二、電泳技術

1．電泳的一般原理96電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質及其所在介質的pH。如果混合物中各組分的結構組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達到分離鑒定各組分的目的。電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其97電泳技術分類垂直板電泳毛細管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳電泳技術分類垂直板電泳毛細管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠98常用電泳技術1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳3、瓊脂糖電泳4、毛細管電泳常用電泳技術1、醋酸纖維薄膜電泳99聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）

1、一般PAGE2、SDS3、PAGE等電點聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryla100聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

PAGE是在區(qū)帶電泳原理的基礎上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠(PAG)作為支持物，采用電泳基質的不連續(xù)體系(即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性)或連續(xù)體系（一層凝膠、一種pH和一種緩沖溶液），進行電泳分離一種方法。

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應的催化系統(tǒng)有兩種?；瘜W聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED不連續(xù)PAGE三種效應：電荷效應、分子篩效應和濃縮效應聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegele101不連續(xù)PAGE的濃縮效應

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質ABC++--樣品濃縮膠分離膠電極緩沖液低電位梯度E11高電位梯度E21+-不連續(xù)PAGE的濃縮效應

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質102SDS

原理：

當SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質結合后，蛋白質分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質在SDS的作用下結構變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質復合物在電泳時產生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關系?？捎孟率奖硎荆?/p>

LogMr=a–bmr應用:測定蛋白質分子量測定蛋白質亞基數(shù)Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）LogMrSDS

原理：Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）103等電點聚焦（isoelectricfocusing）

原理:

在一定抗對流介質（如凝膠）中加入兩性電解質載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應用：

高效率分離純化蛋白質測定蛋白質分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度等電點聚焦（isoelectricfocusing）

104瓊脂糖電泳

瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構成的多糖鏈，這種多糖鏈在1000C左右時呈液態(tài)，當溫度下降到450C以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖凝膠用作電泳的固相支持物具有分子篩效應，其對生物分子的分離作用不僅與其分子的構象及其相對分子質量大小有關，而且與凝膠的濃度也有密切關系，故可根據分離對象分子量大小選擇適當濃度的凝膠。

瓊脂糖電泳常用于核酸分離，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為2OObP至5Okb的DNA，

瓊脂糖凝膠還常用作免疫電泳的固相支持物。瓊脂糖電泳瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖105不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)可分辨的線性DNA大小范圍／(kb)

0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1DNA相對分子質量標準物水平型平板電泳槽

不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)106毛細管電泳

(CapillaryElectrophoresis，CE)

毛細管電泳又稱毛細管區(qū)帶電泳，它是在毛細管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。

毛細管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術，被認為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產物的分析鑒定等。毛細管電泳原理示意圖毛細管電泳檢測技術的發(fā)展毛細管電泳分離模式的發(fā)展毛細管電泳

(CapillaryElectrophores107毛細管電泳裝置示意圖30KV高壓電源光源光電倍增管數(shù)據采集石英玻璃毛細管緩沖液-樣品緩沖液正極負極毛細管電泳裝置示意圖30KV光源光電倍增管數(shù)據采集石英玻璃毛108毛細管電泳檢測技術的發(fā)展

（一）紫外可見光吸收石英毛細管因可透過20nm波長以下的紫外光，因此不僅允許從紫外到可見光這一波長范圍內對樣品組分進行檢測。而且可將透光窗口直接開在毛細管上，進行“在柱”檢測。（二）熒光檢測法是毛細管電泳中一種常見的“在柱”檢測法，尤其是激光誘導熒光檢測法(LIF)，其靈敏度可高達10-12～10-16mol/L-1，是目前毛細管電泳中最靈敏的一種檢測方法。（三）電化學檢測方法電導檢測、電位檢測、安培檢測是電化學檢測常用的三種方法，對電活性組分的檢測具有靈敏度高、線性范圍寬、選擇性好以及價格低廉等特點。（四）集成毛細管電泳芯片該項技術以晶體硅、玻璃、塑料(指有機玻璃)、陶瓷和硅橡膠為基本材料，借助毛細管電泳技術，將樣品進樣、反應、分離、檢測等過程集成到一起的多功能化的技術，該項工作與分析儀器的微型化、小型化和集成化緊密相連,使得其能符合現(xiàn)代生物化學、制藥工業(yè)的低成本和高產出的需求。毛細管電泳檢測技術的發(fā)展（一）紫外可見光吸收109毛細管電泳分離模式的發(fā)展

（一）毛細管區(qū)帶電泳又稱毛細管自由電泳，毛細管內只充入緩沖溶液，在直流高壓驅動下，溶質以不同的速率在分立的區(qū)帶內進行遷移而被分離?？捎糜诎被帷⒍嚯?、離子、對映體等物質的分析。（二）毛細管凝膠電泳將板上的凝膠移到毛細管中作支持物而進行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用，溶質按分子大小進行分離。常用聚丙烯酸胺在毛細管內交聯(lián)制成凝膠柱，可用于分離測定蛋白質和DNA等，但制備繁瑣，使用壽命短。（三）毛細管等電聚焦(CIEF)將普通等電聚焦電泳轉移到毛細管中進行，在高壓作用下，毛細管內部建立pH梯度，蛋白質在毛細管中向各自的等電點聚焦，形成明顯的區(qū)帶，再通過檢測器分別加以確認，常用于分離離子型物質。（四）親和毛細管電泳(ACE)建立在生物分子之間的親和作用基礎上，利用親和分子（如抗原與抗體、酶與底物、配體與受體等）相互選擇性，通過毛細管電泳來測定這些分子，從而具有高選擇性和靈敏性。傳統(tǒng)的親和分析有很多優(yōu)點，但在技術上操作繁瑣，自動化程度低，測定周期長，因而親和分析與毛細管電泳的聯(lián)用正可彌補其局限性和缺點。毛細管電泳分離模式的發(fā)展（一）毛細管區(qū)帶電泳110電泳技術的拓展1、免疫電泳(immunoelectrophoresis)2、單細胞凝膠電泳技術(singlecellgelelectrophoresisassay，SCGE)，又稱彗星試驗(Cometassay)3、雙向電泳(twodimensionalelectrophoresis，2DE)4、脈沖凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)5、連續(xù)型逆向色譜電泳(continuouscounteractionchromatographicelectrophoresis，CACE)6、介體電泳(preparativeelectrophoresis)7、溫度梯度凝膠電泳（temperaturegradientgelelectrophoresis）電泳技術的拓展1、免疫電泳(immunoelectroph111雙向電泳圖譜正常小鼠結腸組織蛋白質組的雙向電泳人胃癌SGC7901細胞蛋白質組的雙向電泳第一向：PAGE等電點聚焦（IEF），第二向：SDSPAGE雙向電泳圖譜正常小鼠結腸組織蛋白質組的雙向電泳人胃癌SGC7112連續(xù)型逆向色譜電泳(CACE)分離原理示意圖

載液色譜陽極陰極目標產品富集區(qū)填料（排阻區(qū)）填料（嵌入區(qū)）凈速度電泳色譜凈速度電泳目標蛋白的遷移情況連續(xù)型逆向色譜電泳(CACE)分離原理示意圖

載液色譜陽113三、離心技術

1．離心機類別