ICS 65.020.30B45

DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T3317—2018雞白血病多重PCR和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法Laboratorydetectiontechnologiesofmulti-PCRanddothybridationfordiagnosisofAvianleukosis(AL)20182018061220180712山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：成子強(qiáng)。雞白血病多重PCR和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了我省針對(duì)禽白血病的診斷檢測(cè)技術(shù)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于企、事業(yè)單位禽病診斷實(shí)驗(yàn)ALV-A/B和ALV-J的檢測(cè),判斷雞群是否患A/B、J亞群白血病。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T26436禽白血病診斷技術(shù)NY/T680禽白血病病毒p27抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1禽白血病AvianLeukosis，AL反轉(zhuǎn)錄病毒科甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬禽反轉(zhuǎn)錄病毒引起的以禽類造血組織中某些細(xì)胞成分過(guò)度增生為A-J共10個(gè)亞群，其中A、B、C、D、E和J亞群的宿主是雞，流行于我國(guó)禽群的主要是AB和JALV-J101JA/B亞群主要造成淋巴細(xì)3.2多重PCR技術(shù)Multiplepolymerasechainreaction，M-PCR在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改進(jìn),于一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。3.3斑點(diǎn)分子雜交技術(shù)dotblotting是直接從待檢雞只的組織或血液樣品提取DNA,將變性的DNA樣品點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后與制備的特異性探針進(jìn)行雜交來(lái)檢測(cè)樣品中的前病毒DNA。試劑或材料除另有規(guī)定外，所有化學(xué)試劑均為分析純。DNARNALB（Rryptone）、酵母抽提物（YeastExtract）試劑。MultiHotstartDNAPolymerase(5U/μL10×MultiHotstartBuffer(+Mg2+SuperPuredNTP(2.5Mmeach)、PCRRNAprepPure/RNA提取試劑盒。DL1000DNAMarker、PMD18-T6×loadingBuffer、PrimeScriptTMRTMasterMix。禽白血病抗原檢測(cè)試劑盒。斑點(diǎn)雜交所需溶液。1MAA.1。AA.2。AA.3。lMTris-AA.4。10SDS（sodiumdodecylsulfate）AA.5。20×SSC（salinesodiumcitrate）AA.6。封閉溶液（Blocking）：AA.7。AA.9。AAA.9。AA.10。NBT/BCIPAA.11。探針標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒（Roche）。B。PT-PCRC。5儀器設(shè)備各量程移液槍，PCRPCR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)。紫外分析儀。凝膠成像系統(tǒng)。MK3恒溫?fù)u床。恒溫恒濕箱、立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)。雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀、核酸電泳槽。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。數(shù)顯超純水機(jī)。全自動(dòng)雪花制冰機(jī)數(shù)顯恒溫水浴鍋。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。HealForce二氧化碳培養(yǎng)箱。pH恒溫磁力攪拌器。三洋超低溫保存箱。高壓滅菌器。硝酸纖維素膜或尼龍膜。冰箱。樣品采集組織樣品℃冰箱備用。樣品儲(chǔ)運(yùn)樣品存放樣本采集后迅速放入液氮罐中，若需長(zhǎng)期保存應(yīng)放在-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。操作方法方法概要PCR基于ALV-A、ALV-J的保守性基因，合成了特異性引物（見(jiàn)附錄D），從混合病毒中，提取了混合病毒的RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用多重RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出545bp(ALV-J)、692bp(ALV-A)的特異性片段。ALV-A、ALV-J將復(fù)蘇后的DF-1細(xì)胞進(jìn)行傳代25cm2的培養(yǎng)瓶，4h后取保存于-80℃的病毒液，經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾除菌，接種1.5mL于細(xì)胞，1h后棄病毒液，加入5mL的PBS清洗后，再加入1DMEM培養(yǎng)基維持7d，7d后收集細(xì)胞上清即為擴(kuò)增的病毒液。RNA培養(yǎng)7d后的細(xì)胞吸棄上清后，按照1mL每瓶（以覆蓋細(xì)胞瓶底壁為參考）2530s，倒棄胰酶后加入PBS5mL清洗細(xì)胞，移入離心管后按照1006.2×g離心2min。將分離的細(xì)胞用商品化試劑盒提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-80℃超低溫冰箱中。RNA先去除RNA中的DNA：5×gDNAEraserBuffer2μL，gDNAEraser1μL，總RNA1μg,加無(wú)RNAse雙蒸水至10μL，42℃2minRNA5×PrimeScriptTMRTMasterMix2μL,加無(wú)RNAse雙蒸水至20μL，混勻后，37℃反應(yīng)15min，85℃5S，然后置于4℃。RT-PCT見(jiàn)附錄E。PCR1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析斑點(diǎn)雜交準(zhǔn)備好自制的特異性探針，提取樣品DNA，將變性的DNA樣品點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后與制備的特異性探針進(jìn)行雜交，通過(guò)觀察出現(xiàn)的斑點(diǎn)來(lái)檢測(cè)樣品中的前病毒DNA。DNA按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書的方法，提取DNA，并于4℃保存?zhèn)溆谩Ｌ结樐康幕蛟O(shè)計(jì)與合成DNAStarALVp27部分基因和ALV-Jenv部分基因作為探針目的基因。核酸探針標(biāo)記按照地高辛標(biāo)記試劑盒的說(shuō)明書對(duì)上述回收的通用探針基因片斷和各亞群探針基因片段進(jìn)行Eppenderf管中，加1μgDNA16μL；10min2min,充分變性有利于標(biāo)記；4μL，至變性的DNA中，離心313×g；37，24h，時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)增加標(biāo)記產(chǎn)物；2μL0.2MEDTA(pH=0.8)終止反應(yīng)。探針標(biāo)記效率的檢測(cè)2～9管（標(biāo)記探針）和標(biāo)記陰性探針對(duì)照中取1μL到尼龍膜；固定核酸到膜上（烤箱120℃，30min）；20mL馬來(lái)酸緩沖液里面，搖晃2min；10mL封閉液孵育30min；10mL30min；10mL15min×210mL2min～5minpH=9.5；2mL50mL斑點(diǎn)雜交檢測(cè)0.7mm×0.7mm，劃好格子，做好標(biāo)記；1.0μLDNA將硝酸纖維素膜（NC）10min；5min；NC30min802hDNA；NC682hNC10min，5min；將變性的探針倒入預(yù)雜交液中，NC686h（一般雜交過(guò)夜）；將膜取出放于11cmNC15min，2NC68℃洗滌15min，2NC1min；30min，期間經(jīng)NC20ml4μLDigoxiaenin（5min，7826g，3730min；洗膜：緩沖液Ⅰ洗滌；5min×5210mL100μBCIP混合物），NC30min～1h，TE（pH＝8.0）終止顯色反應(yīng)。結(jié)果判定PCRALV-AALV-J凝膠電泳上未出現(xiàn)特異性目的條帶判定為陰性。凝膠電泳上出現(xiàn)特異性目的條帶判定為陽(yáng)性。斑點(diǎn)雜交結(jié)果ALV，SPF（REV）病病毒（MDV）為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)斑